표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

이 절차의 전체적인 목적은 형광 현미경을 사용하여 스워밍(swarming), 슬라이딩(sliding) 또는 바이오필름 형성 과정 중 미생물 균주의 공간적 분포를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 공간적 분리가 미생물 상호작용에 어떤 영향을 미치는지와 같이 사회 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현미경 기법과 하위 세그먼트 이미지 분석을 통해 미생물 균주의 적응도와 공간적 분포를 쉽게 평가할 수 있다는 점입니다.

시연은 저희 실험실의 박사 연구원인 Theresa Holscher가 진행하겠습니다. 실험 전날, 배양 튜브에 LB medium 3 mL를 넣고 B.subtilis의 냉동 보존주를 접종합니다. 관심 있는 각 균주에 대해 별도의 튜브를 사용하여 이 접종 과정을 반복합니다.

튜브를 37 °C의 수평 진탕 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. swarming 및 sliding 실험용 플레이트를 준비하려면, 20 mL의 온도를 조절한 LB 배지를 90 mm 폴리스티렌 페트리 접시에 붓습니다. 접지를 즉시 닫고 멸균 후드 한쪽에 두어 최소 1시간 동안 식힙니다.

다음으로, 90 mm 페트리 접시에 2% agar SG 배지 25 mL를 부어 콜로니 바이오필름 실험용 플레이트를 준비합니다. 플레이트 뚜껑을 즉시 닫고, 4개 이하씩 쌓아 최소 1시간 동안 식힙니다. 먼저, LB agar swarming 및 sliding 플레이트를 층류 후드(laminar flow hood)에 넣고 뚜껑을 엽니다.

플레이트를 20분 동안 건조시킵니다. 본 실험에서 플레이트의 습도는 매우 중요합니다. 수분이 너무 많으면 박테리아가 헤엄칠 수 있지만, 충분히 건조시키면 스워밍(swarming)과 슬라이딩(sliding) 현상을 방지할 수 있습니다.

마찬가지로, 군락 바이오필름 구조는 배지의 건조도에 따라 달라집니다. 분광광도계를 사용하여 600 nanometers에서 하룻밤 동안 배양한 스타터 배양액의 흡광도를 측정하십시오. 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 밀도가 표준화된 양의 녹색 및 적색 형광 단백질 생성 균주를 혼합하여 총 200 microliters가 되도록 합니다.

튜브를 3초 동안 볼텍싱합니다. 마이크로파이펫을 사용하여 층류 후드 내에서 미리 건조된 90 mm LB 한천 배지 플레이트의 중앙에 혼합 배양액 2 µL를 점적합니다. 플레이트를 10분 동안 건조시킵니다.

마지막으로, 응결수가 한천 표면에 맺히는 것을 방지하기 위해 플레이트를 37 °C에서 세운 상태로 배양합니다. 먼저, 2x SG 한천 플레이트를 층류 후드(laminar flow hood)에 15분 동안 두어 건조시킵니다. 다음으로, 녹색 및 적색 형광 단백질을 생성하는 생물막 균주인 B.subtilis 168의 스타터 배양액을 각각 100 µL씩 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.

튜브를 3초 동안 볼텍싱합니다. 100 µL의 LB 배지가 담긴 튜브들을 준비하고, 혼합 배양액을 사용하여 접종액의 10배 희석 계열을 만듭니다. 마이크로 피펫을 사용하여 희석하지 않은 혼합 배양액 2 µL를 2배 SG 한천 배지에 스팟팅합니다.

이 과정을 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴ 희석액 접종물에 대해 반복하되, 단일 플레이트에서 6~9개의 콜로니가 자랄 수 있도록 스팟 간격을 동일하게 유지합니다. 플레이트를 30 °C에서 1~3일 동안 세운 상태로 배양합니다. 먼저, 플레이트를 형광 검출 현미경의 이미징 플랫폼 위에 놓습니다.

슬라이딩 및 스워밍 실험의 경우, 방사형 군락 확장을 측정할 수 있도록 접종 시작점인 페트리 접시의 중앙을 가시 영역의 모서리에 맞춥니다. 배율은 90 mm 플레이트의 가능한 가장 넓은 영역을 이미지화할 수 있는 최고 해상도로 조정하십시오. 형광 신호의 강도에 따라 노출 시간을 적절하게 조정하십시오.

바이오필름 분석을 위해, 관심 있는 콜로니를 시야 중심에 위치시킵니다. 콜로니 전체를 볼 수 있는 가장 높은 해상도로 배율을 설정하십시오. 이제 콜로니를 측정하고 분석할 준비가 되었습니다.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석하십시오. 이 그림은 두 균주를 공동 접종한 전형적인 Bacillus subtilis 콜로니의 성장을 보여줍니다. 편모 의존적인 집단 표면 이동인 swarming은 매우 잘 혼합된 집단을 형성합니다.

이 타임랩스 영상에서, 초기 접종균은 플레이트 도말 중심부에 배치되었습니다. 얇은 층의 스워밍(swarming) 현상이 명확하게 관찰되며, 콜로니가 성장함에 따라 적색과 녹색의 형광 균주 두 가지가 혼합되고 겹쳐져 나타납니다. 반면, 슬라이딩(sliding) 거동의 이미지는 서로 다르게 표지된 형광 균주들에 대응하는 뚜렷한 성장 구역을 보여줍니다.

이 영상은 기능성 편모가 결핍된 균주들이 공동 접종되어 형성된 슬라이딩 콜로니의 성장을 보여줍니다. 이러한 콜로니들은 분비된 외다당류, 하이드로포빈 및 서팩틴의 조합을 이용하여 여전히 확산될 수 있습니다. 그 결과, 형성된 콜로니는 스워밍 균주와 비교하여 뚜렷한 공간적 성장 배열을 나타냅니다.

바이오필름 형성 군집의 초기 세포 밀도는 결과적으로 형성된 군집의 공간적 배열에 큰 영향을 미쳤습니다. 혼합 집단의 세포 밀도가 높은 상태에서 시작된 군집은 공간적 배열이 거의 나타나지 않거나 미미했습니다. 반면, 초기 세포 밀도가 낮을 때는 녹색과 적색의 형광 섹터가 뚜렷하게 검출되었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 미생물 콜로니 내 형광 표지 균주의 상대적 풍부도를 결정하고, 공간적 분리를 조사하며, 창시 세포 밀도의 영향을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.