표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

이 절차의 전반적인 목표는 형광 현미경을 사용하여 스웜(swarming), 슬라이딩 또는 생물막(biofilm)이 형성되는 동안 미생물 균주의 공간적 분포를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 공간적 분리가 미생물 상호 작용에 미치는 영향과 같은 사회 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현미경 기술과 하위 세그먼트 이미지 분석을 사용하여 미생물 균주의 적합성 및 공간 분포를 쉽게 평가할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 연구원인 Theresa Holscher입니다. 실험 전날, 배양 튜브에 3ml의 LB 배지를 추가하고 B.subtilis의 냉동 재고에서 접종합니다. 관심 있는 각 균주에 대해 별도의 튜브로 이 접종을 반복합니다.

튜브를 섭씨 37도의 수평 진탕 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다. 떼 짓기 및 슬라이딩 실험을 위한 플레이트를 준비하려면 20밀리미터의 템퍼링된 LB 매체를 90mm 폴리스티렌 페트리 접시에 붓습니다. 접시를 즉시 닫고 멸균 후드의 한쪽에 놓아 최소 1시간 동안 식히십시오.

다음으로, 90mm 페트리 접시에 25ml의 한천을 2배 SG 배지로 부어 콜로니 생물막 실험을 위한 플레이트를 준비합니다. 플레이트를 즉시 닫고 최소 1시간 동안 4개 이하로 쌓아 식히십시오. 시작하려면 LB 한천 군집 및 슬라이딩 플레이트를 층류 후드에 놓고 뚜껑을 제거합니다.

접시를 20분 동안 말리십시오. 이 실험에서 플레이트의 습도는 매우 중요합니다. 과도한 수분은 박테리아가 헤엄칠 수 있게 하지만, 장기간 건조하면 떼를 지어 미끄러지는 것을 방지할

마찬가지로, 콜로니 생물막 구조는 배지의 건조도에 따라 달라집니다. 분광 광도계를 사용하여 600나노미터에서 하룻밤 스타터 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 밀도가 정규화된 양의 녹색 및 적색 형광 단백질을 혼합하여 총 200 마이크로리터의 균주를 생성합니다.

3초 동안 튜브를 소용돌이치십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 층류 후드의 사전 건조된 90mm LB 한천 플레이트 중앙에 2마이크로리터의 혼합 배양물을 찾아냅니다. 접시를 놓고 10분 동안 건조시킵니다.

마지막으로, 한천 표면에 응결이 쌓이는 것을 방지하기 위해 섭씨 37도의 접시를 똑바로 세웁니다. 먼저 두 번의 SG 한천 플레이트를 층류 후드에 15분 동안 놓고 건조시킵니다. 다음으로, 생물막 균주인 B.subtilis 168 스타터 배양을 생산하는 녹색 및 적색 형광 단백질 각각 100마이크로리터를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.

3초 동안 튜브를 소용돌이치십시오. 100마이크로리터의 LB 배지가 있는 튜브를 준비하고 혼합 배양액을 사용하여 10배 희석 시리즈를 접종합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 2마이크로리터의 희석되지 않은 혼합 배양물을 2회 SG 한천 플레이트에 찾아냅니다.

10에서 1로, 10에서 2로, 10에서 3으로, 10에서 4개의 희석액에 대한 접종으로 이를 반복하고, 한 접시에서 6-9개의 군체가 자랄 수 있도록 동일한 거리에 지점을 배치합니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 1-3일 동안 똑바로 세놓고 배양합니다. 시작하려면 형광 검출 현미경의 이미징 플랫폼에 플레이트를 놓습니다.

슬라이딩 및 벌집 실험의 경우, 방사상 군집 확장을 측정할 수 있도록 접종 기원인 페트리 접시의 중앙을 가시 필드의 모서리로 설정합니다. 90mm 플레이트의 가능한 가장 큰 영역을 이미징할 수 있는 최고 해상도로 배율을 조정합니다. 형광 신호의 강도에 따라 노출 시간을 적절하게 조정하십시오.

생물막 분석을 위해 관심 콜로니를 시야의 중심에 배치합니다. 전체 군체를 볼 수 있는 가장 높은 해상도로 배율을 설정합니다. 이제 군체를 측정하고 분석할 준비가 되었습니다.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다. 이 그림은 전형적인 두 균주가 공동 접종된 Bacillus subtilis 군체의 성장을 보여줍니다. 편모에 의존하는 집단 표면 이동인 스웜(Swarming)은 매우 혼합된 개체군을 초래합니다.

이 타임랩스 비디오에서 초기 접종제는 플레이트 스프레드의 중앙에 배치되었습니다. 얇은 층 군집이 명확하게 관찰되며 군체가 발달함에 따라 두 개의 적색 및 녹색 형광 균주가 혼합되고 겹치는 것처럼 보입니다. 반대로, 슬라이딩 거동의 이미지는 다르게 표지된 형광 균주에 해당하는 정의된 성장 부문을 보여줍니다.

이 비디오는 균주가 기능하지 않는 슬라이딩 공동 접종 군체의 성장을 보여줍니다. 이러한 군집은 여전히 분비된 외다당류(exo-polysaccharide), 하이드로포빈(hydrophobin) 및 계면활성제(surfactin)의 조합을 사용하여 퍼질 수 있습니다. 결과 군체는 군집 균주에 비해 뚜렷한 공간적 성장 구색을 나타냅니다.

세포 밀도를 시작하는 생물막 생산 군체는 결과 군체의 공간적 구색에 큰 영향을 미쳤습니다. 혼합된 집단의 높은 세포 밀도로 시작된 군체는 미미하거나 전혀 공간적 구색을 보이지 않았습니다. 대조적으로, 시작 시 세포 밀도가 낮을 때는 선명한 녹색 및 빨간색 형광 섹터를 감지할 수 있었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미생물 군집에서 형광 표지된 균주의 상대적 풍부도를 결정하고, 공간적 분리를 조사하고, 설립자 세포 밀도의 영향을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.