Name: 특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 순수 배양 및 자연 미생물 군집에서 유세포 분석 워크플로를 활용한 미생물 역학 연구 방법을. 이 기술은 생태학 및 생명공학 연구에 비용 효율적인 실시간 모니터링을 제공합니다.

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우리가 기꺼이 인정 마이클 Jahn Yuting Guo 절차 및 순수 문화 및 활성된 슬러지 커뮤니티의 데이터 집합을 각각 제공 합니다. 우리는 추가 biogas 커뮤니티 샘플을 분석 하기 위한 카트린 Mörters 감사 합니다. 이 작품 음식과 농업 (BMEL), 중소기업 (ZIM)를 위한 연방 내각의 중심 혁신 프로그램에 대 한 독일 연방 내각 대신 대 (FNR, 프로젝트 바이오 가스-지문 Nr. 22008313) Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.에 의해 투자 되었다 경제와 에너지 (BMWi) (INAR-ABO, 16KN043222), 독일 Bundesstiftung Umwelt (DBU, 프로젝트 온 디맨드 프로덕션 폰 Phosphatdünger aus Reststoffen 폰 Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), 교육에 대 한 독일 연방 내각 및 연구 (BMBF) (FZK 03XP0041G), 및 헬름홀츠 협회의 자금 프로그램 지향 (POF III R31 주제 3 Bioenergy).

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<li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li>
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<li>Koch, C., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li>
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<li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li>
<li>Günther, S., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning%3A+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

미생물 인구 및 지역 사회에 대 한 성공적인 분석 잘 조정 된 cytometers, 세포 매개 변수의 적절 한 선택 및 샘플링, 측정 및 데이터 평가 쪽으로 고정에서 신뢰할 수 있는 워크플로 필요합니다. 선택한 셀 매개 변수는 사용할 수 있는 여기 파장 consort 해야 합니다. 우리가 사용 하 고 매우 낮은 농도;에서 민감한 DAPI 추천 하지만 일반적으로 하지 표준 cytometer 설정에 구성 된 UV 레이저에 의해 흥분 할 필요가 있다. SYBR 같은 다른 염료 나, 또한 얼룩 전체 인구 또는 지역 사회 녹색 하지만 일반적으로 열 등 한 해상도 제공 합니다. 우리는 미생물 지역 사회에서 물고기 절차 또는 생존 테스트를 사용 하 여 권장 하지 않습니다. 이러한 접근 방법은 계량, 확인 하 고 지역 사회에서 개별 종에 그들의 효과 불확실 때문에 제어할 수 없습니다. 그들은 수 없습니다 안정적으로 테스트, 일반적인 지역 사회의 상당한 비율은 여전히 순수한 문화로 사용할 수 없습니다.
프로토콜에 중요 한 단계는 샘플링 및 고정 절차로 셀 정렬 포함 됩니다. 샘플링 특정 순수한 문화와 flocs를 집계 하거나 샘플 매트릭스의 입자에 고착 미생물 커뮤니티의 추세에 의해 복잡 하 게 될 수 있습니다. 이러한 집계를 낭비 하 고 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 흐름 cytometric 분석에 그들을 소개 하기 전에 샘플에서 세포를 분리 하는 필수적 이다. 발표 준비 프로토콜 단일 세포 분석 수 있도록 최적화 했다. 마지막 50 µ m 여과 어떤 잔여 집계를 제거 하 고 셀 정렬의 70 µ m 노즐 및 분석기의 흐름 베트 막힘 방지를 측정 하기 전에 수행 됩니다. 폐수 처리 공장에서 셀 flocs 특히 풍부 하 고, 강력 하 고 시스템의 기능에 중요 한 있습니다. 우리는 planktonic 조사 및 슬러지 기반 설립된 프로토콜을 테스트 하는 본격적인 폐수 처리 식물의 다른 탱크에 미생물 지역 사회. 집계 했다 명확 하 게 방출 하는 세포를 형성 하는 슬러지와 지역 사회 구성 안정 유지. 또한, planktonic 및 슬러지 기반 커뮤니티 그들 모든 3 개의 샘플된 탱크 (그림 8, 보조 파일 1-S10) 사이의 놀라운 유사성을 전시. 이러한 결과 포 름 알 데히드와 에탄올 집착의 신선한, 포름알데히드 처리-비교 16S rDNA amplicon 시퀀싱에 의해 확인 했다-, 그리고 정렬된 샘플10. 그럼에도 불구 하 고, 매우 강한 biofilms 또는 밀접 하 게 연결 된 체인에서 성장 하는 박테리아와 같은 환경 샘플을 도전 수 있습니다 수 없습니다 없앨 수 있습니다. 유비 쿼터 스 입자 히스토그램에 표시 되 고 투명 한 풍부에 의해 셀 리 수로 토양 샘플 특히 문제가 될 수 있습니다. 이러한 경우에 기존의 시퀀싱 방법 적용 될 필요가 있다.
모든 새로운 샘플 세트의 고정 안정성 결과 유효성을 보장 하기 위해 실험을 설계 하기 전에 테스트 되어야 합니다. 좋은 고정 안정성 풀링된 얼룩이 지 고 하루에 여러 샘플 시간 점의 측정 해줍니다. 또한 복제 측정 및 결론 및 실험의 최종 평가 후 결정적인 시간 포인트의 회고전 셀 정렬 수 있습니다. 순수한 문화 정착 안정성 28 일 동안 (그림 9) 확인 했습니다. 현장 실험 샘플 수송을 포함 하 여, (이 경우에는 활성된 슬러지 커뮤니티에 대 한 바이오 가스 커뮤니티, 보충 파일 1-S9 195 한 일)에 더 긴 기간 동안 고정 안정성을 테스트 해야 합니다.
얼룩 보통 문제가 아니다 그러나 bioinformatic 평가 도구 응용 프로그램을 허용 하는 생물학 표준으로 제어할 필요가 있다. 우리가 사용 하는 모의 변형 대장균 BL21 (DE3)는 ASC 프로토콜에 따라 집착 되었고 모든 얼룩 일괄 처리에 사용 하기 위해 비축.
DAPI, SYBR 녹색에서에서 떨어져 내가 성공적으로 적용 되었습니다 몇 년14,23,,2425,26미생물 커뮤니티를 해결 하기 위해. 높은-낮은 및 핵 산 하위 집합 (HNA 및 LNA)으로 지역 사회를 해결할 수 있습니다 SYBR 녹색 온라인 방법에서 라이브 셀을 사용 하 여. DAPI, dna 바인딩에 더 구체적인 고 한 샘플 세트에 50 개 이상의 subcommunities의 구별을 가능 하 게 그러나, 얼룩이 지기 전에 정착 단계를 요구 한다.
셀 정렬은이 접근의 뛰어난 기능 그리고 특정 subcommunities 더 관심의 경우에 적용 될 수 있다. 그것은 둘 다 PFA-(30 분만에 대 한 수행)도 에탄올 치료 또는 DAPI10 얼룩 했다 후속 16S amplicon 시퀀싱에 부정적인 영향을 강조 해야 합니다. 잠재력 정착의 영향과 subcommunity metagenome에 얼룩 분석 여전히 테스트 해야.
커뮤니티 기능 및 추세 역학에 대 한 정보를 많이 얻을 수 있습니다 정렬 방식에서 독립적인 생물 정보학 도구를 가상으로 셀 수준에서 커뮤니티 기능을 해결 하 고 abiotic 이러한 기능 연결을 포함 하는 경우 매개 변수입니다.
최근, 여러 가지 새로운 생물 정보학 평가 도구, 모든 유용 두 SYBR 녹색 나와 DAPI 접근, cytometric 커뮤니티 패턴을 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 이들은 FlowFP27, 민물 지역 사회29 설립 deconvolution 모델 및 그들의 생리에 따라 긴장을 차별 하는 데 사용 하는 도구는 패키지 (flowCHIC20, flowCyBar28),이 연구에 사용 된 특성30. 또한, cytometric 다양성 결정된25 수 있으며 심지어 안정성 속성 미생물 커뮤니티의 온라인 도구10이제 지켜질 수 있다.
따라서, 흐름 cytometric 분석 미생물 지역 사회와 가능한 abiotic 매개 변수 상관 관계의 급속 한 평가 관해서 큰 장점이 있다. 그러나, 여전히 방법에 제한이 있습니다. 그것은 진정한 온라인 경험된 기반된 게이트 설정 절차로 인해 flowCyBar 도구를 적용할 수 없습니다. 또한, 주문 품, 사용 하기 쉬운 교류 cytometers의 개발 흐름 cytometric 미생물 분석 접근의 확산을 사전 크게 것 이다. 이 방향으로 첫 번째 단계는 착수28.
그것은 높은 주파수 세균 생성 시간 범위 내에서 모니터링 있으며 생태 패러다임 cytometric 데이터5에 적용 되는 표시 된 미생물 생태학, 미생물 cytometry의 미래 응용 프로그램을 구상 수 있습니다. ,10. 스위스31필수 식 수 컨트롤 같은 자연 환경의 일상적인 검 진 방법은 매우 유용합니다. 그것은 또한 인간의15 또는 동물32 미생물 검사 같은 의료 응용 프로그램에 대 한 유용한 도구가 될 수 있습니다. 또한, 생물 정보학의 최신 개발 될 관리 되는 미생물 시스템의 공정 제어에 필수적인 센서 미생물 cytometry를 사용 수 있습니다. 미생물 커뮤니티 cytometry는 또한 특정 커뮤니티 하위 집합의 게놈 조사 높은 해상도 수 있는 셀 정렬, 검사 도구를 제공 합니다.

미생물 라이브 인간의 여러 측면에서 중요 한 역할을 담당할. 그들은 행성 탄소, 질소, 인 및 유황 사이클1및2,3 저하 뿐만 아니라 폐수 처리 등 다양 한 산업에서4 biocatalysts 합성 법의 주요 생물 드라이버 5 또는 생명 공학6. 그들은 심지어는 직접에 영향을 미치는 인간의 건강과 신진 대사7,8인간 microbiome 구성. 따라서, 구조, 기능 및 미생물, 그들의 즉시 환경에 대 한 응답에서의 동적 행동에 정보는 우리가 완전히 이해 하 고 이러한 시스템을 조작 하고자 하는 경우에, 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)는 미생물의 구조와 기능9를 해결 하기 위한 설립된 기술. 그러나, 분석과 NGS 데이터의 평가 양적 정보를 얻을 수 없습니다 이며 여전히 비싼, 시간이 걸리는 절대로 성능 복도 내에서 현장 결과 제공 하기 위해 준비. 일부 박테리아 생성 시간 1 시간 그리고 끊임없이 변화 하는 사회 구조에서 특정 환경10원인 아래 표시 됩니다. 이러한 역학에 따라 시퀀싱 방법을 사용 하 여 가장 과학적인 실험실의 재정 및 인력 용량을 초과 것입니다.
대조적으로, cytometry 높은 시간, 노동 및 비용 효율성을 유지 하면서 커뮤니티 지문 비슷한 NGS 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기, 우리가 현재 흐름 cytometric 기술을 단일 셀 수준에 미생물 지역 사회 역학에서 라인을 따라 할 수 있습니다. NGS, 달리 cytometry 기능 유전자 계통 발생 제휴 또는 정보를 제공 하지 않습니다 하지만 양적 세포 수를 제공 합니다. Cytometry 사용 하 여, 미생물 커뮤니티 subcommunities 별개 가벼운 살포와 형광 속성 (앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 셀 크기와 단위의 각각 제공)으로 해결할 수 있습니다. 제시 방식을 주로 활용 셀 크기-그리고 DNA 금액 특정 세포 유형 및 생리 (성장) 상태에 관련 된 관련된 정보. DNA 콘텐츠 UV-고르기 4', DNA의 A T 풍부한 지역에 바인딩하고 다른 염색체 수준 해결도 수는 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) 염료를 사용 하 여 정량 이다. DAPI 형광 및 FSC 결합 하 여 50 이상 subcommunities 구별 고 시간11에 나타났는데 변경 모니터링 될 수 있습니다. Subcommunity 풍부 유사 변화 pH 및 제품 titers12, 글로벌 매개 변수, 날씨13,14또는 창 자 또는 타 액과 같은 마이크로 환경 주변에 상관 될 수 있습니다. 특정 치료15microbiomes입니다. 이러한 상관 관계 공개 키 subcommunities 전체 공동체의 대사 네트워크의 특정 기능에 대 한 책임. 키 subcommunities 수 다음 수 특히 승진 주변 마이크로-환경, 변경 하 여 억제 또는 후속 시퀀싱15 또는 proteomic 조사16정렬.
그러나, 미생물 커뮤니티 cytometry 하지 아직 널리 설립 흐름 cytometric 장치 미생물 인구 또는 지역 사회를 제대로 해결 능력의 다소 낮은 수 또한, 경험, 커뮤니티 분석 파이프라인 및 효과적인 데이터 평가의 부족 연구원 미생물 분석도 전에 직면에 대 한 진입 장벽을 포즈 수 있습니다. 우리는 이러한 문제를 해결 하기 위해 포괄적인 워크플로 설립 했다. 그들의 일반적인 적용을 설명 하기 위해 우리 3 모범 샘플 세트 (보조 파일 1-S1), 즉 나에 그들을 발표할 예정 이다) 정의 된 명확한 매체 (슈 도모 나 스 putida KT 2440에에서 성장 하는 바이오 응용 프로그램에 대 한 순수한 문화 (PC) 포도 당), ii) 복잡 한 실험실 커뮤니티 명확한 매체 (활성된 슬러지 커뮤니티 (ASC) 합성 폐수) 및 iii에) 고밀도 매트릭스 (biogas 커뮤니티 (BC) 옥수수 목초)에서 자연적인 환경에서 복잡 한 사회.
여러 가지 요인이 이러한 샘플 세트의 각각에 대 한 프로토콜 선택 영향. 깊은 동결 싶고 독성 화학 물질의 사용 하지만 주로 충격 설탕 프로 스 팅에 대 한 액체 질소의 사용으로 인해 실험실 환경에 제한 됩니다. 포 름 알 데히드 안정화 및 후속 에탄올 고정 aliquot 준비를 위한 필요 없이 대량 샘플링을 허용 하 고 오랜 기간 동안 안정적인 것을 입증 했다. 그러나, 인간 침15 등 단백질이 풍부한 샘플 단백질 flocs, 포 름 알 데히드에 의해 denaturized 불리 한 신호 잡음 비율을 발생할 수 있습니다 때문에 문제가 될 수 있습니다. 이 비교에서 절차의 대부분의 시간 (총에서 약 1 시간) 소요 됩니다 샘플 건조 하지만 독성 화학 물질 없이 사이트에 수행할 수 있습니다. 그것은 튜브, 냉각 또는 추가 위험 예방 조치 없이 쉽게 전달할 수 있는 안정 된 펠 릿을 생성 합니다. 또한, 많은 대체 고정 방법이 제안된11되었습니다. 우리는 강력히 새로운 샘플 세트를 소개 하는 경우 다른 프로토콜의 해상도 고정 안정성 테스트 권장 합니다.
우리는 세트를 분석 하 두 개의 서로 다른 흐름 cytometers 사용: i)는 매우 정교 하 고 비싼, 연구 중심 셀 정렬 및 현장 응용 프로그램5에 대 한 더 적절 한 나타나는 ii)는 응용 프로그램 집중 벤치 가기 분석기. PC와 ASC 셀 정렬와 함께 측정 하는 동안 BC 벤치 가기 분석기로 측정 되었다. 3 모범 샘플의 분석 최적화 재현성, 샘플 안정성과 워크플로 필요한 다른 절차를 설정합니다. 다음 프로토콜은 세 가지 다른 시스템에 대 한 섹션을 지정 합니다.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q 시스템 합성 A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak 초여과 카트리지</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc, Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp;</td><td>Coherent, Inc , 산타클라라 (미국)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , 산타클라라 (미국)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>광전자 증배관 R928 및 R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 소프트웨어</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &마이크로; 엠&nbsp; FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td> <td>F8815</td><td>350/440 청색 형광</td></tr><tr><td>2 &mu; m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td> <td>F-8827</td><td>505/515 노록색 형광 비즈&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 &무; m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &mu; m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 청색 형광</td></tr><tr><td>1 &micro; mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 노록색 형광 비즈&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (일본)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,Coherent</td><td>, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMT</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml; rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>all optical filters</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>빌드 번호: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

특성화 미생물 역학-cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

순수한 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역동성의 모니터링은 이해 하 고 자연 생태계와 기술 응용 미생물에 의해 구동 제어 중요 합니다. 차세대 시퀀싱 메서드는 널리 활용 해결 microbiomes, 하지만 그들은 일반적으로 리소스와 시간을 집중 하 고 주로 질적 정보를 제공. 흐름 cytometric 미생물 분석 그 단점에서 고통을 하지 않습니다 및 상대 subcommunity 나타났는데 및 절대 제공할 수 있는 셀 번호 줄에. 직접 계통 발생 정보를 제공 하지 않습니다, 비록 그것 분석 깊이 접근을 시퀀싱의 해상도 강화할 수 있다. 의료 응용 프로그램 연구 및 일상적인 설정에 예리한 대조, cytometry 미생물 분석 하지 널리 사용 됩니다. 샘플 준비 및 데이터 분석 파이프라인에 대 한 누락 된 정보는 종종 교과서 교류 cytometry 응용 프로그램 것 미생물 분석도 전에 직면 하는 연구원에 대 한 진입 장벽을 만들 수 있습니다. 여기, 선물이 순수 문화에 대 한 세 개의 포괄적인 워크플로, 복잡 한 사회에서 분명 도전 행렬에 중간과 복잡 한 사회 각각. 우리는 개별 샘플링 및 고정 절차를 설명 하 고 각각 샘플 집합에 대 한 프로토콜을 얼룩이 지 최적화. 우리는 cytometric 분석 중심으로 복잡 한 연구와 응용 프로그램 집중된 벤치 톱 장치 셀 정렬 절차를 설명 하 고, 데이터 분석 패키지를 제안. 우리는 또한 중요 한 실험 제어를 제안 하 고 각각 샘플 세트를 제시 워크플로 적용 합니다.

다음 대표 결과 복제의 필요성을 강조 하 고 3 개의 샘플 세트의 각각에 서로 다른 데이터 시각화 및 분석 기법을 예증. 그들은 각 집합에 대 한 표준 연구 질문에 대 한 적합 한 가능한 데이터 평가 파이프라인의 결과 보여줍니다. 그러나, 제시 기법으로 선물을 샘플 집합에 독점 하지 않습니다. 교류 cytometry 원시 데이터와 함께 FlowRepository ID FR-FCM-ZY46에 공개적으로 사용할 수 되었다. 이전 업로드 된 ASC 데이터는 ID FR FCM ZYD7에서 사용할 수 있습니다.
생물학과 기술적인 복제 했다 촬영, 준비 하 고 게시 프로토콜11에 따라 분석. PC와 ASC에서 생물학적 복제 3 병렬 플라스 크에서 촬영 됐다. BC의 생물 복제는 파일럿 규모의 공장에서 한 위치에 3 개의 후속 samplings로 촬영 했다. 한 샘플의 3 aliquots 고정, 스테인드 되었고 기술 재현성을 보장 하기 위해 분석. 방법 재현성11이전에 게시 절차 따라 평가 했다. 하나의 샘플 세트 (보조 파일 1-S6)의 모든 샘플에 대 한 게이트 템플릿 게이트 당 표준 편차 (%)를 계산에 사용 되었다.
PC를 위한 관계 되는 풍부의 최대 표준 편차 평균 표준 편차는 2.13% (그림 1) 동안 3.44%, 이었다. ASC와 BC, 상대 나타났는데 최대 표준 편차 표준 편차의 평균 2.13%와 0.21% (보충 파일 1-S8) 동안 1.27%, 0.88%, 이었다.
표준 절차, 순수한 긴장 문화를 조사할 때 지연 위상, 생성 시간 및 특정 조건 하에서 세포 밀도 분석 하는 성장 곡선의 준비 이다. 우리가이 절차 흐름 cytometric 분석 워크플로 (그림 2) 시스템의 더 깊은 이해를 달성 하기 위해 결합. DAPI 대 FSC 형광 플롯 배치 문화의 다른 지점에서 문화의 세포 주기 상태 공개. 마스터 게이트 템플릿 (보충 파일 1-S6) 하나 (c1n), 포함 된 셀의 비율을 측정 하기 위해 설립 되었다 2 (c2n)와 여러 개의 염색체 (cXn, 그림 2B). 접종된 세포의 우세 비율 하나의 염색체 (0 h에서 93.7%) 했다. 이 지 수 성장, 어디 거의 모든 셀 하나 이상의 (99.6%, 4 h)을 포함 하 고 이상 인구 (53.1%)의 절반도 포함 된 두 개 이상의 염색체 동안 대폭 변경. 이것의 생성 시간 보다 더 빨리 그것의 염색체를 복제 하는 P. putidas 능력을 보여줍니다.
흐름 cytometric 분석 미생물 커뮤니티의 진화를 모니터링을 위한 매우 유용한 입증 했다. 그것은 더 많은 자원을 집중 분자 방법5,10보다 가까이 지역 사회 역학을 따를 수 있습니다. 우리 영화에이 역동성을 강조 하 고 시간이 지남에 활성된 슬러지 사회 변화에 대 한 개요를 얻었다. 각 1 초 프레임 샘플 포인트 (보충 파일 2)의 FSC 대 DAPI 형광 줄거리를 보여 줍니다. 0 일과 4 일 사이 매우 뚜렷한 변화는 7 일 후 핵심 공동체의 설립에 선행 되었다. 추가 subcommunities 하루 21에서 했다. 우리는 subcommunity 수준에 미생물 역학의 평가 사용 하는 마스터 게이트 서식 파일 (보충 파일 1-S6) 설립. 실험의 다른 단계에 있는 지배적인 subcommunities 명확 하 게 CyBar 도구 (그림 3)를 사용 하 여 확인 되었다. 상대 subcommunity 나타났는데 도움이 흥미로운 (키 시간에 발생에 중요 한 변화) 빌 게이츠를 선택 하 고 가능한 주파수 분배와 (이상 5% 상대 풍부) 정렬 및 추가 분석22.
산업 규모 생물 응용 프로그램 동요 제한으로 인해 잠재적인 공간 heterogeneities를 직면할 수 있다. 그들은 또한 자주 운영 매개 변수, 교대 비 합성 기판의 품질에서 변화에 노출 됩니다. BC 이러한 시스템을 대표 하 고 동적으로 구동된 플러그 흐름 반응 기에서 다른 지역에서 샘플링. DAPI 대 FSC 형광 플롯 (그림 4) 모범 샘플 포인트의 표시만 작은 공간, 하지만 발음 임시이. BC는 둘 다를 사용 하 여 조사에 추가, 빠른 자동화 세련 및 자세한 마스터 게이트 템플릿 기반 CyBar 접근.
자동화, 신속 하 고 공평한 자연의 산업 환경에서 특히 bioprocesses의 현장 제어에 대 한 흥미는 세련 된 게. 그것은 모든 사용 가능한 샘플의 원시.fcs 데이터를 비교합니다. 이러한 비교의 두 그림 5에 표시 됩니다. 결과 서로 값에 관한 공간 및 시간이 이전 관측을 확인 합니다. NMD 플롯 생성 양식 세련 된 도구 호환성 매트릭스 (그림 6) 더이 결과 substantiates 하 고 그에 따라 그것을 시각화.
또한, 우리는 마스터 게이트 템플릿 (보충 파일 1-S6)를 사용 하 여 BC의 23 subcommunities의 상대 나타났는데 계산. 1 년 기간에서 48 샘플의 상관 관계 분석 기능 미생물 지역 사회 관계를 이해 하 실시 됐다. 이 추가 조사 (4 셀 정렬)에 대 한 관심의 식별 수 있습니다. Abiotic 매개 변수와 함께 강한 긍정적인 또는 부정적인 상관 관계 같은 제품 titers 이해 하 고 생태계 및 바이오 프로세스를 최적화 하는 데 도움이 수 있습니다. 이 상관 관계 (그림 7)에 포함 된 유기 로딩 속도 같은 비 생물 적인 매개 변수를 예로 보여주. G4, G5, g 10 강한 긍정적인 상관 관계를 전시 하 고 수 있는 가능 하 게 포함 되 고 발효 종, G8에 부정적인 상관 관계 methanogenic archaea을 향해 힌트 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> 그림 1: 순수 문화의 cytometric 분석의 재현성. FSC 대 DAPI 형광 ± 1 표준 편차 (C, D)를 나타내는 오차 막대와 제어 구슬 (A, B) 및 바 3 subcommunity 나타났는데 [%]의 플롯을 플롯 합니다. 상대 나타났는데 보충 파일 1-s 6에 표시 된 게이트 템플릿을 결정 했다. A, B, C 4 h에서 성장 곡선의 찍은 3 생물 복제와 3 개의 기술 복제 P1, P2, P3 샘플 A에서 준비 되었고 몇 번이 고, 각각 측정: M1, M2, M3, 그들의 각각 표준 편차와 함께 부여 됩니다. 50000 이벤트 셀 게이트에 기록 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> 그림 2: 순수 문화 성장 곡선 중의 세포 주기 분석 실험 (A) 이상 12 헤. FSC 대 DAPI 형광의 지 수 성장 단계 동안 DNA 콘텐츠의 변화는 bi 시간당 samplings 플롯 합니다. 이 측정 시리즈 팬 들은 구슬 (보충 파일 1-S3 참조)의 정보를 포함 하지 않습니다. (B). ± 1 표준 편차와는 subcommunities에서 상대 나타났는데 시간이 지남에 나타내는 오차 막대를 가진 광학 밀도 기반 성장 곡선. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> 그림 3: 활성된 슬러지 커뮤니티 구조 24 일 동안의 진화. (A) 주파수 분배 동향의 유사성에 의해 정렬 된 개별 게이츠 boxplots 시각 overlaying와 flowCyBar, 해당 색상 키 (B)와 NMD 플롯 재치 R 유사성 분석 &lt; 0.001 ( C). 기본 플롯 보충 파일 2에 필름 순서에 표시 됩니다. 상대 나타났는데 보충 파일 1-S6 게이트 서식 파일을 사용 하 여 결정 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> 그림 4: 미생물 지역 사회 구조는 산업 규모에서의 공간과 일시적인이 플러그 흐름 biogas 반응 기. (A) 4의 미생물 지역 사회 구조의 비교 샘플링 포트 I-IV 날 223. (B) 하루 384 포트에서 시간 의존 사회 구조 변이 하루 0에서에서의 비교 II. 소음 뒤늦게 시각화를 향상 시키기 위해 차단 되어 있다. 250000 이벤트 셀 게이트 (보충 파일 1-S6)에 측정 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> 그림 5: Cytometric 히스토그램 이미지 비교-세련 된. 세련 된 알고리즘의 원리는 공간 및 시간이 각각 대표 하는 두 개의 샘플을 비교 하 여 exemplified입니다. (i) 세련 된 이미지는 두 개의 매개 변수 (FSC 대 DAPI 형광) 표시를 선택한 후.fcs 파일에서 생성 됩니다. 그레이 스케일 (0-255) 코드는 픽셀에서 이벤트 수 있습니다. (ii) 세련 된 하위 포함 하는 셀 영역을 지정한 후 생성 (여기: 200 &lt; &lt; 4000, 200 x &lt; y &lt; 2200). (iii) XOR 조합 이미지 사이의 하위 픽셀을 비교 하 여 만들어집니다. 차이가 0을 검은색으로 표시 됩니다. 최대 차이 200 이며 흰색으로 표시 됩니다입니다. 해당 XOR 값 XOR 이미지의 모든 픽셀의 그레이 스케일 값을 추가 하 여 계산 됩니다. (iv) 오버레이 조합 이미지 하위 픽셀의 그레이 스케일 값을 추가 하 여 만들어집니다. 해당 오버레이 값을 0 및 그러므로 정보를 포함 하지 않는 오버레이 이미지의 픽셀을 계산 하 여 계산 됩니다. (v) 서로 값 XOR 및 오버레이 값을 분할 하 여 계산 됩니다. 다음은 그림 6에서 NMD 음모에 대 한 기초입니다. 모두는 서로 가치와 NMD 플롯 표시는 무시할 수 공간-그리고 발음된 일시적인 지역 사회가 성분. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> 그림 6: 세련 된 기반 바이오 커뮤니티 샘플의 유사성 분석. 0-하루 샘플 분석 (보충 파일 1-S11)을 왜곡 하는 그것의 매우 다른 지역 사회 구조 때문이 음모에서 제외 했다. NMD 플롯 낮은 공간에 대 한 가설을 확인-및 높은 일시적인이 세련 된 도구를 사용 하 여 만든 고 그림 5에 설명 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> 그림 7: 바이오 커뮤니티에 상관 관계 분석. 매트릭스는 Spearman의 등급 순서 계수를 사용 하 여 계산 하 고 보충 파일 1-S6에서 마스터 게이트 템플릿으로 결정 했다 23 subcommunities의 상대적인 나타났는데 기반. 그들은 1 년 기간에서 48 샘플에 대 한 유기 로딩 속도 (OLR)와 상관 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> 그림 8: planktonic (P)와 슬러지의 유사성 분석 기반 폐수 지역 사회 (S). 샘플 기본 헤어 청 징 제 (PCL), 활성화 슬러지 분 지 (AS)와 본격적인 폐수 처리 공장 (보충 파일 1-S10에서 점 플롯)의 소화 탱크 (DT)에서 찍은. 상대 나타났는데 보충 파일 1-s 6에 표시 된 게이트 템플릿을 사용 하 여 결정 했다. 이러한 subcommunity 나타났는데도 CyBar (보조 파일 1-S10) 및 NMD를 만드는 flowCyBar 도구와 분석 되었다 음모 (R &lt; 0.01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> 그림 9: 순수 문화 정착 안정성. 0 h에서 찍은 성장 곡선 실험에서 샘플 15% 글리세롤에 고정 후 28 일 동안-80 ° C에서 저장 되었다. FSC 대 DAPI 형광 구슬 표시 됩니다 컨트롤과 플롯 합니다. 측정 시리즈 팬 들은 구슬 (보충 파일 1-S3)의 정보를 포함 하지 않습니다. 50000 이벤트 셀 게이트 (보충 파일 1-S6)에 기록 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

흐름 cytometric 분석은 순수 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역학을 모니터링 귀중 한 입증 했다. 우리는 순수한 문화 및 도전 행렬에서 명확한 매체 뿐만 아니라 복잡 한 사회에 대 한 데이터 분석, 샘플링에서 세 개의 포괄적인 워크플로 각각 제시.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

이 방법은 예를 들어 미생물 생태학 및 생명 공학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 짧은 간격 샘플링 체제로 빠른 마이크로바이옴 역학을 닫는 데 사용할 수 있으면서도 매우 비용 효율적이라는 것입니다. 이 방법은 생명 공학 및 자연 미생물 군집과 영양 및 건강 상태에 대한 동물 및 인간 미생물 군집에 대한 정보를 얻는 데 사용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자이자 SediMeter 운영자인 Florian Schattenberg가 맡을 것입니다. 바이오가스 커뮤니티 샘플을 건조하려면 변형된 1ml 피펫 팁을 사용하여 200마이크로리터의 점성 소화액을 1.7ml의 PBS가 들어 있는 2mL 튜브로 옮깁니다. 철저한 혼합 후 튜브를 초음파 수조에 1분 동안 넣어 큰 세포 응집체를 분해하고 식물 세포 잔류물에 달라붙는 세포를 부착합니다.초음파 처리 후 샘플을 철저히 혼합하고 50 마이크로 미터 공극 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 2 밀리리터 플라스틱 튜브로 여과합니다. 여과액을 4개의 400번째 마이크로리터 분취액으로 나누고 분취액을 두 번 원심분리한 후 두 번 모두 상층액을 완전히 버리고 미생물 샘플을 기계적으로 최대한 철저하게 탈수합니다. 그런 다음 가열된 진공 원심분리기에서 시료를 건조시켜 안정적인 펠릿을 만들고 펠릿을 빛으로부터 보호하여 섭씨 4도에서 보관합니다.활성 슬러지 샘플의 안정화 및 고정을 위해 4ml의 셀을 원심분리하고 PBS에서 2% 포름알데히드 4ml에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 실온에서 30분 후 안정화된 세포 샘플을 원심분리하고 펠릿을 섭씨 영하 20도의 보관을 위해 70% 에탄올 4밀리리터에 고정합니다. 0.6ml의 고정 세포 현탁액을 1.4ml의 PBS가 들어 있는 유리관에 혼합하여 옮기고 철저한 혼합 후 시연된 바와 같이 10분 동안 초음파 처리합니다.초음파 처리가 끝나면 원심 분리로 세포를 수집하고 펠릿을 2 밀리리터의 신선한 PBS에 다시 현탁시킵니다. 철저한 혼합 후 방금 설명한 대로 세포를 5분 동안 초음파 처리하고 새로운 PBS로 OD 700 나노미터를 035로 조정합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 실온에서 20분 동안 배양하기 위해 0.11 몰 시트르산과 4.1 milimolar tween 20을 함유한 1milil의 투과화 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.그런 다음 원심분리로 세포를 수집하고 0.68 마이크로몰 DAPI를 함유한 2mililit의 염색 용액에 펠릿을 완전히 재현탁시켜 빛으로부터 보호된 실온에서 최소 60분 동안 배양합니다. bead calibration의 경우, linear calibration을 위한 bead mix를 유세포분석기에 로드하고, 노즐 및 레이저 광학 위치를 조작하면서 beads를 지속적으로 측정하여 linear range에서 기기를 사전 보정합니다. 비드 피크를 사전 설정된 보정 템플릿에 맞출 수 있게 되면 로그 모드로 전환하고 로그 보정 비드 샘플을 로드합니다.로그 비드 피크를 사전 설정된 보정 템플릿에 맞춰 기기의 하드웨어를 미세 조정하고, 광전자 증배관 게인 설정을 사용하여 비드 위치에 필요한 최종 조정을 수행합니다.이 절차의 가장 중요한 측면은 실험 간의 비교를 위해 일관된 측정을 유지하는 것입니다. 따라서 일일 세포분석기 보정과 생물학적 스텀 뚜껑에 있는 비드의 사용은 느린 cytromic microbiome 투석의 성공에 필수적입니다. 세포가 준비되면 샘플을 혼합 및 여과하고 로그 비드 혼합물을 세포에 추가합니다.이제 샘플을 혼합하여 세포분석기에 로드하고 염색된 세포를 포함하고 노이즈와 비드를 제외하는 게이트를 만듭니다. 그런 다음 셀 게이트 내에서 250, 000개의 세포가 검출될 때까지 초당 최대 3, 000개의 이벤트로 샘플 세트를 연속적으로 분석합니다. 유세포 분석 데이터를 분석하려면 모든 샘플에 사용할 수 있는 마스터 게이트 템플릿을 개발합니다.먼저 유세포 분석 표준 파일을 적절한 유세포 분석 프로그램에 로드하고 샘플을 연속적으로 처리합니다. 샘플을 로드하고, 측정값을 두 번 클릭하고, 각각의 드롭다운 메뉴에서 X축 및 Y축 매개변수를 선택하여 전방 산란 대 DAPI 형광 플롯을 엽니다. 폴리곤 드로잉 도구를 사용하여 이전에 생성된 측정 셀 게이트를 재현하여 비드와 노이즈를 제외하고 그에 따라 게이트의 이름을 지정합니다.셀 게이트 항목을 모든 샘플 그룹 리스트로 드래그하고 셀 게이트를 두 번 클릭하여 셀 이벤트만 선택적으로 표시합니다. 샘플에 널리 퍼져 있는 하위 커뮤니티를 elliptical gate tool로 정의하고 풀링합니다. 그런 다음 마스터 게이트 템플릿이 모든 샘플에 맞을 때까지 추가 하위 커뮤니티 할당과 후속 샘플을 추가합니다.측면 산란 스캐닝 방법으로 마스터 게이트의 템플릿을 제어하여 서로 가까이 있는 하위 커뮤니티를 해결합니다. 그런 다음 모든 하위 커뮤니티를 테이블 편집기에 추가하고 출력 통계를 frequency of parent로 설정합니다. 테이블 편집기를 사용하여 상대적인 하위 커뮤니티의 풍부도를 적절한 스프레드시트 소프트웨어로 내보내고 사이드바 매뉴얼의 지침에 따라 데이터 형식을 조정합니다.그런 다음 하위 커뮤니티 역학 및 상관 관계를 시각화하려면 R 패키지를 설치 및 로드하고 txt 파일을 로드 및 정규화합니다. 전방 산란 대 DAPI 형광 플롯은 배치 배양의 여러 지점에서 순수 균주 배양의 세포주기 상태를 보여줍니다. 마스터 게이트 템플릿을 사용하면 염색체가 하나, 둘 또는 여러 개인 세포의 비율을 정량화할 수 있으며, 예를 들어 이 대표적인 미생물이 생성 시간보다 더 빠르게 염색체를 복제할 수 있는 능력을 밝힐 수 있습니다.시간이 지남에 따라 복잡한 미생물 군집을 조사할 때 군집 변화의 속도와 중요성을 점도표 순서로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 실험의 여러 단계에서 지배적인 하위 군집은 세포 측정 바코드 도구를 사용하여 명확하게 식별할 수 있습니다. 이 데이터를 상대적인 하위 군집 풍부도의 빈도 분포와 결합하면 주요 시점에서 상당한 풍부도 변화를 보여주는 게이트를 선택할 수 있습니다.이 데이터를 비미터법 다차원 척도 플롯으로 시각화하면 커뮤니티 역학에 대한 더 깊은 이해를 용이하게 할 수 있습니다. 바이오가스 군집은 교반 제한으로 인해 잠재적으로 공간적 이질성에 직면할 수 있습니다. 모범적인 바이오 가스 군집 샘플 포인트는 공간적 이질성은 거의 없지만 뚜렷한 시간적 이질성을 나타냅니다.Product Tighters와 같은 비생물적 매개변수와의 강력한 긍정적 또는 부정적 상관관계는 생태계와 생명공학 과정을 이해하고 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 후속 분류 및 분석을 위해 특별히 관심 있는 게이트를 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 절차를 수립하는 동안 다양한 고정 및 염색 절차를 평가하여 각각의 새로운 샘플 세트에 대한 성능과 안정성을 평가하는 것이 좋습니다.분류 후, 앰플리콘식 펜싱(ampliconsic fencing), 메타유전체학(metagenomics) 및 단백질체학(proteomics)과 같은 추가 접근법을 적용하여 대사 경로에서 활동 상태에 대한 원시 유전적 제휴에 대한 정보를 제공하는 상위 군집을 선택할 수 있습니다. 이 방법은 미생물 생태학자와 바이오 프로세스 엔지니어가 합리적인 자원 투자로 미생물 군집 역학, 자연 및 통제된 생태계를 따를 수 있는 길을 열었습니다.

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환경

미생물 biofilms은 일반적으로 전문의 세포 독특한 subpopulations에 의해 형성된다. 이러한 subpopulations의 단일 세포 분석은 형광 기자의 사용을 필요로합니다. 여기 몇 가지 subpopulationswithin을 시각화하고 모니터하는 프로토콜을...

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

미생물 인구는 전체 동작을 지시 할 수있는 실질적인 세포 이질성가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 분자 프로브 분석 그러나 그것의 응용 프로그램이 종 사이에서 변화, 세포의 생리 학적 상태를 확인할 수 있습니다. 이 연구는 과소 평가하거나 거짓 긍정적 인 결과를 기록하지 않고, 정확하게 cyanobacterium 인구 내에서 세포 사망을 결정하는 프로토콜을 제공합니다.

분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

시각적 클러스터링 함께에서 cytometry 수생 biofilms 공부는 쉬운--사용 하 고 빠른 방법을 제공 합니다. 그것은 biofilm 특성, biofilm 커뮤니티 구조에 변화의 탐지 및는 biofilm에 포함 하는 비 생물 적인 입자의 탐지에 사용할 수 있습니다.

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획기적인 곡선(BtC)은 다공성 미디어에서 박테리아의 운반을 연구하는 효율적인 도구입니다. 여기에서는 현미경 검사법과 유동 세포계 계수와 함께 유체 장치를 기반으로 한 도구를 소개하여 BtC를 획득합니다.

유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

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야생 동물의 기생충 수집 및 식별

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