특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

이 방법은 예를 들어 미생물 생태학 및 생명 공학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 짧은 간격 샘플링 체제로 빠른 마이크로바이옴 역학을 닫는 데 사용할 수 있으면서도 매우 비용 효율적이라는 것입니다. 이 방법은 생명 공학 및 자연 미생물 군집과 영양 및 건강 상태에 대한 동물 및 인간 미생물 군집에 대한 정보를 얻는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자이자 SediMeter 운영자인 Florian Schattenberg가 맡을 것입니다. 바이오가스 커뮤니티 샘플을 건조하려면 변형된 1ml 피펫 팁을 사용하여 200마이크로리터의 점성 소화액을 1.7ml의 PBS가 들어 있는 2mL 튜브로 옮깁니다. 철저한 혼합 후 튜브를 초음파 수조에 1분 동안 넣어 큰 세포 응집체를 분해하고 식물 세포 잔류물에 달라붙는 세포를 부착합니다.

초음파 처리 후 샘플을 철저히 혼합하고 50 마이크로 미터 공극 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 2 밀리리터 플라스틱 튜브로 여과합니다. 여과액을 4개의 400번째 마이크로리터 분취액으로 나누고 분취액을 두 번 원심분리한 후 두 번 모두 상층액을 완전히 버리고 미생물 샘플을 기계적으로 최대한 철저하게 탈수합니다. 그런 다음 가열된 진공 원심분리기에서 시료를 건조시켜 안정적인 펠릿을 만들고 펠릿을 빛으로부터 보호하여 섭씨 4도에서 보관합니다.

활성 슬러지 샘플의 안정화 및 고정을 위해 4ml의 셀을 원심분리하고 PBS에서 2% 포름알데히드 4ml에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 실온에서 30분 후 안정화된 세포 샘플을 원심분리하고 펠릿을 섭씨 영하 20도의 보관을 위해 70% 에탄올 4밀리리터에 고정합니다. 0.6ml의 고정 세포 현탁액을 1.4ml의 PBS가 들어 있는 유리관에 혼합하여 옮기고 철저한 혼합 후 시연된 바와 같이 10분 동안 초음파 처리합니다.

초음파 처리가 끝나면 원심 분리로 세포를 수집하고 펠릿을 2 밀리리터의 신선한 PBS에 다시 현탁시킵니다. 철저한 혼합 후 방금 설명한 대로 세포를 5분 동안 초음파 처리하고 새로운 PBS로 OD 700 나노미터를 035로 조정합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 실온에서 20분 동안 배양하기 위해 0.11 몰 시트르산과 4.1 milimolar tween 20을 함유한 1milil의 투과화 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 원심분리로 세포를 수집하고 0.68 마이크로몰 DAPI를 함유한 2mililit의 염색 용액에 펠릿을 완전히 재현탁시켜 빛으로부터 보호된 실온에서 최소 60분 동안 배양합니다. bead calibration의 경우, linear calibration을 위한 bead mix를 유세포분석기에 로드하고, 노즐 및 레이저 광학 위치를 조작하면서 beads를 지속적으로 측정하여 linear range에서 기기를 사전 보정합니다. 비드 피크를 사전 설정된 보정 템플릿에 맞출 수 있게 되면 로그 모드로 전환하고 로그 보정 비드 샘플을 로드합니다.

로그 비드 피크를 사전 설정된 보정 템플릿에 맞춰 기기의 하드웨어를 미세 조정하고, 광전자 증배관 게인 설정을 사용하여 비드 위치에 필요한 최종 조정을 수행합니다.이 절차의 가장 중요한 측면은 실험 간의 비교를 위해 일관된 측정을 유지하는 것입니다. 따라서 일일 세포분석기 보정과 생물학적 스텀 뚜껑에 있는 비드의 사용은 느린 cytromic microbiome 투석의 성공에 필수적입니다. 세포가 준비되면 샘플을 혼합 및 여과하고 로그 비드 혼합물을 세포에 추가합니다.

이제 샘플을 혼합하여 세포분석기에 로드하고 염색된 세포를 포함하고 노이즈와 비드를 제외하는 게이트를 만듭니다. 그런 다음 셀 게이트 내에서 250, 000개의 세포가 검출될 때까지 초당 최대 3, 000개의 이벤트로 샘플 세트를 연속적으로 분석합니다. 유세포 분석 데이터를 분석하려면 모든 샘플에 사용할 수 있는 마스터 게이트 템플릿을 개발합니다.

먼저 유세포 분석 표준 파일을 적절한 유세포 분석 프로그램에 로드하고 샘플을 연속적으로 처리합니다. 샘플을 로드하고, 측정값을 두 번 클릭하고, 각각의 드롭다운 메뉴에서 X축 및 Y축 매개변수를 선택하여 전방 산란 대 DAPI 형광 플롯을 엽니다. 폴리곤 드로잉 도구를 사용하여 이전에 생성된 측정 셀 게이트를 재현하여 비드와 노이즈를 제외하고 그에 따라 게이트의 이름을 지정합니다.

셀 게이트 항목을 모든 샘플 그룹 리스트로 드래그하고 셀 게이트를 두 번 클릭하여 셀 이벤트만 선택적으로 표시합니다. 샘플에 널리 퍼져 있는 하위 커뮤니티를 elliptical gate tool로 정의하고 풀링합니다. 그런 다음 마스터 게이트 템플릿이 모든 샘플에 맞을 때까지 추가 하위 커뮤니티 할당과 후속 샘플을 추가합니다.

측면 산란 스캐닝 방법으로 마스터 게이트의 템플릿을 제어하여 서로 가까이 있는 하위 커뮤니티를 해결합니다. 그런 다음 모든 하위 커뮤니티를 테이블 편집기에 추가하고 출력 통계를 frequency of parent로 설정합니다. 테이블 편집기를 사용하여 상대적인 하위 커뮤니티의 풍부도를 적절한 스프레드시트 소프트웨어로 내보내고 사이드바 매뉴얼의 지침에 따라 데이터 형식을 조정합니다.

그런 다음 하위 커뮤니티 역학 및 상관 관계를 시각화하려면 R 패키지를 설치 및 로드하고 txt 파일을 로드 및 정규화합니다. 전방 산란 대 DAPI 형광 플롯은 배치 배양의 여러 지점에서 순수 균주 배양의 세포주기 상태를 보여줍니다. 마스터 게이트 템플릿을 사용하면 염색체가 하나, 둘 또는 여러 개인 세포의 비율을 정량화할 수 있으며, 예를 들어 이 대표적인 미생물이 생성 시간보다 더 빠르게 염색체를 복제할 수 있는 능력을 밝힐 수 있습니다.

시간이 지남에 따라 복잡한 미생물 군집을 조사할 때 군집 변화의 속도와 중요성을 점도표 순서로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 실험의 여러 단계에서 지배적인 하위 군집은 세포 측정 바코드 도구를 사용하여 명확하게 식별할 수 있습니다. 이 데이터를 상대적인 하위 군집 풍부도의 빈도 분포와 결합하면 주요 시점에서 상당한 풍부도 변화를 보여주는 게이트를 선택할 수 있습니다.

이 데이터를 비미터법 다차원 척도 플롯으로 시각화하면 커뮤니티 역학에 대한 더 깊은 이해를 용이하게 할 수 있습니다. 바이오가스 군집은 교반 제한으로 인해 잠재적으로 공간적 이질성에 직면할 수 있습니다. 모범적인 바이오 가스 군집 샘플 포인트는 공간적 이질성은 거의 없지만 뚜렷한 시간적 이질성을 나타냅니다.

Product Tighters와 같은 비생물적 매개변수와의 강력한 긍정적 또는 부정적 상관관계는 생태계와 생명공학 과정을 이해하고 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 후속 분류 및 분석을 위해 특별히 관심 있는 게이트를 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 절차를 수립하는 동안 다양한 고정 및 염색 절차를 평가하여 각각의 새로운 샘플 세트에 대한 성능과 안정성을 평가하는 것이 좋습니다.

분류 후, 앰플리콘식 펜싱(ampliconsic fencing), 메타유전체학(metagenomics) 및 단백질체학(proteomics)과 같은 추가 접근법을 적용하여 대사 경로에서 활동 상태에 대한 원시 유전적 제휴에 대한 정보를 제공하는 상위 군집을 선택할 수 있습니다. 이 방법은 미생물 생태학자와 바이오 프로세스 엔지니어가 합리적인 자원 투자로 미생물 군집 역학, 자연 및 통제된 생태계를 따를 수 있는 길을 열었습니다.