Name: 화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 화학적 매개 종간 상호작용을 공배양과 형광 리포터를 사용하여 검출하는 방법을. Bacillus subtilis 유전자 발현 변화를 실시간으로 관찰하여 미생물 생태학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자 덕분에 자신의 귀중한 조언과이 공 배양 화면의 개발 과정에 도움 로베르토 콜터 (하버드 의과 대학). 그녀는 그림 6을 얻는에 대한 지원도 명확성을 위해 원고를 읽어 주셔서 감사합니다 마 힘, 그리고 치아 - 이순신 쳉.

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 프로토콜의 본질적인 한계 중 하나는 미생물 유기체의 cultivability에 의존하고 있다는 점이다. 도 24을 문서화 한 바와 같이, 지구상에서 가장 미생물 생명은 (아직) 날짜 탐구 배양 조건에서 재배 할 수 없습니다. 따라서, 자연 환경에서 발생하는 미생물 종 사이의 상호 작용의 거대한 숫자는이 방법을 사용하여 발견되지 않을 것입니다. 우리의 욕망은 이러한 상호 작용의 존재를 확인, 그러나 또한 그들을 중재에 관여하는 메커니즘과 분자를 연구하는 단지이기 때문에 그러나, 이러한 미생물을 배양 할 수있는 능력이 필요합니다. 심지어 경작 종 내에서,이 지역은 제대로 접근 방식은 여기에 미생물 사이의 화학적 매개 상호 작용을 식별 할 수있는 방법으로 가치있는 기여를 설명하고, 탐구하고있다. 이 프로토콜은 바실러스 서브 틸리 스의 행렬 유도 스크리닝하기 위해 최적화되어 있지만, 또한, 이론적으로 적용될 수있다다른 세균 종의 Y 전사 형광 기자. <p class="jove_conten...

우리는 박테리아가 분비하는 대사가 이웃 미생물의 생리 및 개발에 영향을 미치는 방법에 대한 이해에 관심이 있습니다. 많은 대사 산물은 다른 미생물에 대한 자신의 생리 활성 효과를 특징으로하고 있습니다. 두 잘 설명 된 예는 다른 미생물의 해외 유전자 발현을 변경하는 다른 미생물의 성장을 억제하는 항생 물질, 및 정족수 인식 분자를 포함한다. 그러나 박테리아는 알려진 bioactivities 1이없는 다른 많은 작은 분자 천연 제품을 생산하고 있습니다. 우리는 박테리아가 진화하고 그들 대부분 세균이 존재하는 내에 복잡한 미생물 군집에서의 미생물 이웃 세포 생리학을 변조 할 수 있기 때문에 이들의 대사 산물을 생산하는 능력을 보존한다는 가설. 바실러스 서브 틸리 세포 유형 우리는 Bacil을 포함하는 화학적 매개 미생물의 상호 작용에 대한 우리의 연구 초점을 맞추고있다LU의 서브 틸리 스. 이뿐만 아니라 때문에 그람 양성 모델 박테리아와 조작에 사용할 수있는 결과 유전 도구와 같은 상태의뿐만 아니라, 때문에 특징 종류의 세포로 분화 할 수있는 능력이다. 예는 셀을 포함한다 :; 강력한 biofilm 형성에 필요한 세포 외 기질을 생산, 환경으로부터 DNA를 취할 능력, 수영 등 2 중, 포자 형성된. 이러한 유형의 세포는 각각 그들 생리 학적 및 / 또는 물리적으로 구별 그들의 유 전적으로 동일한 형제로부터 만드는 특성 전사 귤론을 표현한다. 다양한 성장 조건 하에서, 다중 셀 유형은 B. 단일 콜로니 내에 다양한 모집단 공존 서브 틸리 세포 3. 박테리아의 많은 종은 유사한 셀형 이질성을 나타낼 수 있지만,이 현상은 특히 B.에서 연구되어왔다 서브 틸리 스. UPR 있습니다 특히, 유전자이러한 특정 B. 각에서 egulated 서브 틸리 스의 세포 유형이 확인되었습니다. 관심이 미생물의 표현형의 대부분은 직접 관찰하기 어렵거나 불가능하기 때문에 이러한 상향 조절 유전자를 확인하는 것은 여기에 설명 된 작업을 위해 필수적입니다. 예를 들어, 우리는 시각, 같은 고체 (1.5 %) 한천 플레이트에서 수영과 같은 특성을 감지 할 수는 없지만 B의 모집단 서브 틸리 세포는 그 조건 3에서 편모를 생산하고 있습니다. 또 다른 예는 바이오 필름의 매트릭스 생산이다. 매트릭스 생산 (그것이 거시적으로 주름이 식민지의 결과로) 식민지의 형태로 시각화하지만, 특정 성장 매체에, 오직 성장 4의 배수 일 이후에 할 수 있습니다. 그러나 유전자가 분화하는 동안 상향 조절되는 알고, 우리는 이러한 종류의 세포로 세포 분화를위한 마커 역할을 전사 기자를 구성 할 수 있습니다. 리포터 구조 이러한 형광 transcriptional 기자 세포 형 특정 유전자가 형광성 단백질, 예를 들어, 리포터 유전자의 생산을 구동하기위한 프로모터로 구성. 예를 들면 P의 X 유전자 X의 프로모터 영역을 나타내는 P의 (세포 수영을 위해) 노파-YFP, P 타파-YFP (바이오 필름의 매트릭스를 생산하는 세포) 및 (세포 포자 형성된 경우) P sspB-YFP을 포함한다. 표현형의 기본 규정이 그대로 유지 될 수 있도록이 기자의 구조는 염색체에 중립 궤적에 통합 (그림 1과 아래 참조)된다. 셀이 표현형을 표현 그러나, 지금, 또한 형광 단백질을 표현한다. 이것은 우리가이 생리적 반응을 활성화 미생물을 선별 할 수 있도록, 특정 표현형의 행동의 활성화 쉽게 시각화 판독을 제공합니다. 그러한 리포터는 일반적으로 미생물에 사용되고 있지만, 그것들은 대체로 지문을 확인해 화면에 적용되지 않았다이 방법 전에 미생물 사이의 Y 대사 상호 작용은 5를 설명했다. 셀 타입 별 기자 균주의 설계 및 건설에 중요한 고려 사항이 있습니다. 구조의 다른 유형이 확실히 할 수 있지만 우리는 독점적으로 전사 형광 기자를 활용했다. 우리는 두 가지 이유, 그러나, 우리의 화면에서 세포 유형의 차별화를위한 마커로 번역 융합의 사용을 권장 : 교란 원시 세포 유형 특정 단백질을 떠나 1) 욕구, 2) 인식이 확산, 세포 넓은 형광 (번역 융합과 공통) 세포 내에서 지역화 puncta에보다 감지하기 쉬울 것입니다. 리포터 유전자 선택 판독으로 전사를 사용하기로 결정 한 후, 리포터 유전자 (예 : LacZ를, 형광, 또는 루시 페라 제)를 선택해야합니다. LacZ를는 특별한 필요 최소한의 이점을 갖는다감지하는 장비를 개인별하지만, 환경 미생물 사이에 잘​​못된 반응의 더 높은 가능성이있다. 우리 손에, 락 토양 미생물 사이에 생물 +의 배경 수준 (, 데이터가 표시되지 토양 미생물의 10 %가 X-GAL 판에) 락 + (파란색이었다 &gt;&gt;) 엄청나게 높았다. 우리는 이것을하지 않았지만 그것은 매체에 X-gal을 농도를 적정하면, 이것은 X-GAL 리포터의 사용을 허용하도록 최적화 될 수있다. 루시 페라 탐지 높은 감도를 제공하며, 대부분의 직교 리포터 : 환경 미생물이 본질적으로 발광되는 거의 기회가있다. 그러나, 우리는 대부분의 멀티 웰 플레이트 만 지역화 된 영역을 스캔하도록 설계되었습니다로 어려운, 전체 페트리 접시에 걸쳐 발광 검출을 허용 우리 기관에서 장비를 식별 할 수 있습니다. 또한도 동시에 물리적 인 허용하는 방식으로 발광 식민지를 시각화하는 합병증이있을 수 있습니다유도 생물의 olation. 수탁자를 사용하여이 가능하게 한 수 있지만, 우리는 대신 B에서 작동하는 입증 된 형광 전사 기자를 사용하기로 결정 서브 틸리는, 검출 및 토양 생물 중 하위 위양성 비율의 적절한 감도를 제공하고, 시각화 및 격리 절차를 모두 쉽게 사용할 기기의 사용을 허용. 형광 선택 선택한 특정 형광 물질이 세균의 종류에 따라 달라집니다, 당신이 사용하는 한천 성장 매체, 그리고 특정 형광 필터를 사용하면 사용할 수 있습니다 설정합니다. 우리의 장비로, 우리는 발견 B. 두 서브 틸리 자신과 YFP (노란색 형광 단백질) 필터를 사용했을 때 그들이 우리의 손에 GFP (녹색 형광 단백질)에 그 기자가 우수하고, 전시 적은 형광 배경에 성장 된 한천을 식민지. 형광 단백질의 코돈 사용은자주도 당신의 세균 종에서 일을하거나, 구성 적 프로모터를 사용하여 명시 적으로 테스트하기 위해 문헌에서 알려진 형광을 선택하는 것이 중요하고, 진핵 생물에 최적화. 항상 발전 형광 단백질 변형 많은 수의 소스를 명시 적으로 실험 구에 적합한 형광 단백질을 선택에 대한 지침을 제공하는 일부 7,8의 숫자에서 검토 한 이는 6 현재 사용할 수 있습니다. 발기인 선택 프로모터의 선택은 크게 셀 형식이나 관심의 표현형에 따라 달라집니다. 같은 B. 같은 생물에 대한 서브 틸리 스, 일부 세포 형 특정 리포터 유전자는 문헌에 설립되었습니다. 다른 균주를 들어, 마이크로 어레이 또는 전사 데이터를 검사하는 것은 매우 조건에서 상향 조절되는 유전자에 대한 정보를 제공 할 필요가 어디에 관심 내가 당신의 세포 유형의 적하 목록. 최근의 연구는 B의 전사를 카탈로그 기와의 마이크로 어레이 (10)를 사용하여 104 서로 다른 성장 조건에서 서브 틸리 스. 이 논문은 유전자가 매우 적게 잘 특성화 표현형을위한 귀중한입니다, 다른 조건에서 상향 조절 된에 대한 포괄적 인 정보를 제공합니다. 오히려 그 모든 유전자에 대한 정확한 프로모터 영역을 맵핑하는 것보다, 우리는 일반적으로 단순히 프로모터와 유전자의 상류 순서 200-500 BP를 사용합니다. 정확한 순서의 길이는 게놈 문맥에 따라 달라집니다 필요한 오픈 리딩 프레임을 이웃 상류 코딩 영역을 포함하지 않도록 할 때 짧은 영역이 사용됩니다. 중립 궤적 및 통합 당신의 균주에서 기자 구조는 형광 전사 기자의 피로를 설계 마지막 질문이되어 유지하는 방법. 박테리아에서, 그 유전자는 자주 유지항생제 선택을 사용하여 플라스미드에. 그러나, 환경 미생물을 죽이는없이 공 배양 중에 항생제를 사용하는 것이 가능하지 않을 수있다. 플라스미드가 안정적으로 당신의 종의 박테리아를 유지하는 경우에, 당신의 박테리아가 심사하여 기자를 준비하는 항생제의 존재 플라스미드 매개로 기자를 포함 성장 가능하고 희망의 공 배양 자체 동안 항생제를 제거 할 수 있음을 플라스미드 것 형광 충분히 가능하도록 유지된다. 플라스미드는 쉽게 세균에 손실됩니다, 또는 스트레스 조건에서 손실 된 경우, 이것은 실행 가능한 옵션이되지 않습니다. 많은 경우에, 최적의 솔루션도 전형의 부재하에 리포터의 안정적인 유지 보수를 허용 박테리아 염색체 상으로 리포터 구조체를 통합하는 것이다. 목적 유전자의 정상적인 표현이나 규정을 방해하지 않도록 통합을 위해, 우리는 염색체에 자궁외 사이트에 통합하는 것이 좋습니다 캘리포니아N의 역할을 &quot;중립 궤적.&quot; B.에서 서브 틸리이 통합 사이트가 유전자 것을 - 변이 된 때 - (통합 체는 항생제 선택하지 않고 확인 할 수 있도록) 특정 최소한의 미디어 표현형을 전달, 아직 리치 미디어의 성장과 포자 형성 속도를 변경하지 않고, amyE, 라카와 같은 유전자를 포함, thrC, pyrD, 된 gltA 및 SACA (전분을 이용할 수있는 능력을 반송, β-galactosides, 트레오닌, 우라실, 글루타메이트, 수크로오스, 각각) 11-13. 이러한 유전자의 통합은 B에서 몇 년 동안 안정적으로 사용되었지만 서브 틸리 스 (특히 amyE와 라카에서), 유사한 지식은 많은 다른 박테리아 종의 유전자를 사용하지 못할 수도 있습니다. 파지 부착 사이트의 사용은 중성 염색체 통합 사이트에 대한 훌륭한 대안 : 많은 종의 특정 14-16,뿐만 아니라 TN7 첨부 사이트 (AT &amp; T의 TN7)와 같은 일반적인 통합 사이트가많은 세균 종 (17, 18)에서 확인 및 유전자 삽입을 위해 사용되어. 환경 미생물 우리는 우리의 공동 배양 화면에 대한 환경 미생물의 직접 소스로 흙을 사용합니다. 토양 미생물의 높은 다양성을 포함하고, 이러한 생물의 대부분은 천연 제품의 풍부한 원천입니다. (토양 세균의 사전 분리없이) 우리의 형광 전사 기자의 변형과 접시에 직접 배치 토양의 액체 현탁액을 사용함으로써, 우리는 매우 실험적인 접근 방식을 단순화합니다. 토양 어느 수확​​ 후 즉시 이용 될 수도 있고, 미래의 사용을 위해 -80 ° C에 냉동. 즉시 사용이 잘 동결 살아남지 못할 것이다 것을 포함하여 미생물의 다양성이 잠재적으로 성장 할 수있는 장점을 가지고 있습니다. 그것은 사용되어야 스크린 판의 수를 증가, 이들 샘플로부터 경작 토양 미생물의 농도를 알 수없는 단점이있다. 델ayed 사용 콜로니 최적화 수가 각 화면 접시에 성장 될 수 있도록, 각각의 토양의 소스 CFU / ㎖가 미리 결정될 수있는 이점을 갖는다. 그러나, 토양 생물이 동결 생존 할 수 있어야합니다. 큰 계통 발생 학적 다양성이 우리의 행렬 유도 화면에서 확인 된 히트에서 관찰되었다 (토양 소스 즉) 검사되는 유도 풀을 다양 화하면 동일한 토양에 대한 깊이있는 심사보다 새로운 종간의 상호 작용을 식별에 더 효과가 나타나는 것을 추가 토양 소스는 오히려 더 철저하게 같은 토양 소스 (EA 생크와 R. 콜터, 하버드 의과 대학, 게시되지 않은 결과를) 심사보다 조사 하였다. 개요 우리가 여기에서 설명하는 방법은 기술적 요구 사항의 관점에서 간단합니다. 그것은 포함한다 : 1) B에 형광 전사 기자 구축 서브 틸리 나관심의 다른 박테리아 종, 2),이 기자가 활성화되지 않은되는 조건을 식별 3) (우리의 경우 토양에 있지만, 다른 소스 대신에 사용될 수있다)이 기자의 변형 및 상영하는 생물의 분취 량을 준비 4)이 혼합 고체 미디어, 5) 식별 및 추정이 생물을 유도 분리, 6)이 생물이 실제로 보조 화면이 표현형을 활성화 않는 것이 확인에 대한 미생물의 두 세트. 일단 확인이 생물과 그 대사 산물은 세균 생리학과 미생물의 상호 작용을 연구하기 위해, 박테리아의 행동을 조절하고, 잠재적 인 미래의 치료 화합물 등의 새로운 발판 역할을하는 화학 도구와 우리를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>분광 광도계</td><td></td><td></td>: <td>OD600 absorbance 값을 측정할 수 있는 모든 분광 광도계.</td></tr><tr><td>Luria broth, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>대체 미디어 소스가 필요할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>유리 구슬, 3mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 팁, 원형</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>유리 막대</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>형광 해부 입체 현미경</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>저자는 EXFO X-cite 120 형광 광원, 장역 통과 YFP 필터 큐브, 아크로맷 0.63X 대물렌즈, 10X 접안렌즈 및 Axio HRC HR 디지털 카메라. 대부분의 스크리닝은 2.0-3.2X에서 포커싱 마운트로 수행되었습니다. 형광 기능이 있는 모든 해부 입체경은 사용 중인 FP에 대한 올바른 필터가 있는 경우 괜찮습니다. 명시야와 형광 사이를 쉽게 전환할 수 있는 셔터와 위와 아래에서 조명을 허용하는 스테이지가 있는 것이 가장 좋습니다. 이미지를 캡처하려면 부착된 카메라도 필요합니다.</td></tr></tbody></table>

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

자연 속에서, 박테리아는 거의 독립적으로 존재하지 않으며 대신 대사 산물을 분비하여 지역 환경을 변경 다른 미생물의 다양한 배열에 의해 둘러싸여 있습니다. 이러한 대사 물질은 미생물 이웃의 생리 및 분화를 조절하는 잠재력을 가지고 스타일 복잡한 미생물 군집의 유지 가능성에 중요한 요소들이다. 우리는 화학적으로 매개 된 미생물의 상호 작용을 식별하는 형광 기반의 공동 배양 화면을 개발했다. 화면이 고체 미디어 환경 미생물과 형광 전사 기자의 변형을 결합하고 식민지가 공동 배양에서 성장 할 수 있도록 포함한다. 그것은 관심의 특정 표현형 표현하면 선택된 균주는 형광 있도록 형광 전사 기자 설계 (즉 바이오 필름 ​​형성, 포자 형성, 독성 인자 생산, 등.) 검사는 성장 조건에서 수행 갔지이 표현형 다시 표현 (따라서 기자의 변형은 일반적으로 비 형광입니다)되지 않습니다. 환경 미생물이 표현형을 활성화 대사 산물을 분비 할 때, 한천을 통해 확산 및 형광 기자의 구조를 활성화합니다. 이 유도 - 대사 산물을 생산하는 미생물 탐지 할 수 : 그들은 형광 식민지에 가장 인접 비 형광 식민지입니다. 따라서,이 화면은 기자의 변형에서 특정 생리적 반응을 활성화 확산 대사 산물을 생산 환경 미생물의 식별을 할 수 있습니다. 이 책은 방법에 대해 설명합니다 :) 적절한 공 배양 검사 조건을 선택, b)는 기자와 검사에 대한 환경 미생물을 준비, C) 공동 배양 화면을 수행, D) 추정은 생물을 유도 분리, 전자) 보조 화면에 자신의 활동을 확인합니다. 우리는 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)에있는 바이오 필름의 매트릭스 생산을 활성화 토양 생물에 대한 화면이 방법을 개발 </EM&gt;하지만, 우리는 또한 다른 유전자 다루기 쉬운 박테리아에이 방법을 적용하기위한 고려 사항에 대해 설명합니다.

이 화면은 B.의 생리를 변경 화합물을 분비하는 토양 미생물을 확인하는 데 사용 하였다 서브 틸리 스. 여기에 기재된 결과는 B.의 행렬 생성 세포 유형에 집중 이 박테리아의 강력한 biofilm 형성에 필요한 단백질과 엑소 폴리 사카 라이드를 생산 서브 틸리 스,. 우리는 우리의 형광 기자의 구조 (P 타파-YFP)의 타파 - sipW - TASA 오페론의 프로모터를 선정했다. 이 오페론의 매트릭스 단백질의 구조적 요소를 인코딩하고 생물막 매트릭스 (23)의 생산 중에 상향 조절된다. 우리의 매트릭스 기자 (그림 1)은 이전에 19 기술로 건설되었다. 이전 작업 결과에 따르면 B. 서브 틸리는 자체 제작 쿼럼 센싱 같은 분자 surfactin뿐만 아니라 다른 토양 박테리아 (20)에...

박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

다음 실험의 전반적인 목표는 분비된 화합물에 의해 매개되고 박테리아 유전자 발현의 변화를 일으키는 서로 다른 미생물 간의 상호 작용을 확인하는 것입니다. 이는 환경 미생물을 한천 페트리 플레이트의 콜로니로 사용하는 형광 전사 리포터를 포함하는 박테리아 균주를 배양함으로써 달성됩니다. 주황색 원은 환경 미생물의 군체를 나타냅니다.파란색 원은 리포터의 군체이지만, 고체 배지의 성장은 이러한 군체가 생산하는 대사 산물이 한천을 통해 확산되고 인근 리포터 군체에서 유전자 발현을 활성화할 수 있도록 합니다. 여기에 표시된 별과 함께 표시된 잠재적 히트는 리포터에서 유전자 발현을 변경하는 화합물을 분비할 수 있는 콜로니입니다. 이러한 유기체는 공동 배양 스크린 플레이트에서 분리됩니다.이러한 잠재적 유도 물질은 리포터에서 박테리아 유전자 발현을 변경하는 분자를 분비하는 유기체인지 확인하기 위해 2차 검사에서 재검사합니다. 이 방법은 미묘한 간균과 토양 유기체의 생물막 형성 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하지만, 포도상 구균 또는 슈도모나 종의 독성 발현에 영향을 미치는 미생물 상호 작용과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 실제로, 이론적으로 유전적으로 다루기 쉬운 미생물에서 리포터의 유전자 발현을 변경하는 미생물 상호 작용을 식별하는 데 적용될 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 선택한 유기체에 대한 형광 리포터 구조를 생성한 후 주걱을 사용하여 토양과 원뿔형 튜브를 수집하기 전에 노출된 표면 토양의 상단 0.5cm를 제거하여 토양을 수집합니다. 토양 1g당 10밀리리터의 비율로 0.85%멸균 식염수를 첨가하여 토양 슬러리를 만들고 1분 동안 와류로 처리하여 토양 입자에서 박테리아를 제거합니다.토양 슬러리를 1분 동안 침전시킨 후 상부 수성층을 새 튜브로 옮기고 텍스트 프로토콜에 따라 리포터와 토양 샘플을 희석하고 리포터 시공물을 단독으로 활성화하지 않는 조건에서 공동 배양 스크린 플레이트의 중앙에 각각 50마이크로리터를 스폿합니다. 또한 토양 샘플만 플레이트링하고 리포터만 대조군으로 플레이트합니다. 각 플레이트에 약 23mm의 멸균 유리 구슬을 추가하고 플레이트를 벤치 상단에 유지하고 앞뒤로 흔들어 셀을 펼칩니다.액체가 흡수될 때까지 회전하면서 플레이트를 뒤집고 구슬을 에탄올이 들어 있는 폐기물 비커에 버립니다. 형광을 사용하여 공동 배양 플레이트를 배양한 후 플레이트 상단에서 시작하여 플레이트를 시야를 가로질러 밝은 점으로 앞뒤로 천천히 움직입니다. 한 번 완전히 쓸어낸 후 플레이트를 90도 돌리고 이 과정을 반복합니다.형광 반점이 감지되면 명시야 조명을 천천히 켜고 형광이 박테리아 집락과 관련이 있는지 확인합니다. 추정되는 유도 유기체를 분리하기 위해, 이는 형광 집락에 근접한 비형광 집락이 될 것입니다. 시야의 중앙에 배치하십시오 view 그리고 주로 사용하는 손으로 접근할 수 있고 형광등은 켜진 상태로 두십시오.Brightfield를 천천히 켜서 형광 집락과 주변 유도 유기체를 모양별로 식별하고 배치합니다.유리 막대를 사용하여 멸균된 원형 200마이크로리터 젤 로딩 팁을 집어 연필처럼 잡습니다. 바깥쪽 손바닥을 s에 대십시오.tage 작업 표면에 고정시킵니다. 그런 다음 다른 손을 손의 안쪽 엄지 손가락 쪽에 올려 피펫 팁을 플레이트 표면 위에 유지하면서 피킹 도구를 안정화합니다.그것을 시야로 옮기고 선택하려는 식민지 위의 중앙에 놓습니다. 팁은 초점에서 벗어날 것입니다. 손의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 피펫 팁을 집을 집을 위해 천천히 아래로 돌립니다.아주 가볍게 터치하여 피킹 도구를 회전시키지 않고 팁이 접촉하는 다른 콜로니의 수를 최소화하려고 합니다. 새 접시의 한 부분에 팁을 줄무늬로 만듭니다. 콜로니를 채취한 후 분석 지침에 따라 플레이트를 배양합니다.군체가 보이면 입체경을 사용하여 플레이트에서 단일 또는 여러 유형의 유기체가 자라고 있는지 확인하고 각 모르포 유형을 새 플레이트에 줄무늬를 만들고 자랄 때까지 배양합니다. 추정 유도 물질이 실제 유도 물질인지 테스트하려면 기자와 비 형광 부모 균주의 잔디밭을 준비하십시오. 플레이트가 건조된 후 멸균 이쑤시개를 사용하여 테스트 콜로니에서 세포를 채취합니다.빈 접시에 패치를 붙인 다음 두 개의 잔디 접시에 패치합니다. 대안적으로, 멸균 플라스틱 수의사에서 1밀리리터의 액체 배지에 추정되는 유도 유기체를 현탁시키고, 각 현탁액의 OD를 정규화한 후 현탁액의 OD 600을 측정하여 0.5 스폿의 OD 600에 도달하고, 각 현탁액의 1마이크로리터를 3개의 플레이트 각각에 상쇄합니다. 마지막으로, 유기체가 자라도록 한 후 해부 현미경으로 형광을 사용하여 형광 리포터 균주를 활성화하지만 부모의 통제 균주는 활성화하지 않는 추정 유도 유기체를 식별합니다.여기의 스크리닝은 형광 전사 리포터를 사용하여 b에서 미묘한 생물막 매트릭스의 구조적 구성 요소의 유전자 발현을 변경하는 화합물을 분비하는 토양 유기체를 식별하는 데 사용되었습니다. 이상적으로, 각 공동 배양 플레이트는 밀접하게 배치된 개별 군체인 토양 군체에 대한 리포터의 일대일 비율을 포함해야 합니다. 여기에서는 갈색 원으로 표시되는 토양 군체에 비해 파란색 원으로 표시되는 리포터 군집의 비율이 높으면 공동 배양 플레이트에서 실제 유도 유기체를 정확히 찾아내는 데 대한 신뢰도가 높아지는 방법을 설명합니다.유도하는 토양 유기체는 리포터를 활성화하는 화합물을 분비합니다. 여러 리포터 군체는 토양 대 리포터 비율이 더 높은 플레이트에 유도되어 별이 나타내는 다른 추정 유도 인자와 빨간색으로 표시된 실제 유도 인자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 영양소 함량은 성장 군집 형성의 정도를 제어하고, 접종물의 희석은 결과 군체가 적절하게 분산되었는지 여부를 결정합니다.이 공동 배양에서 볼 수 있듯이 이미지 B는 미묘하게 토양의 수많은 미생물에 반응하여 형광 생물막 매트릭스를 생성합니다. 우리가 조사한 토양의 경우 Ptap A YFP 매트릭스 리포터의 적중률이 높았습니다. 이는 유사한 스크린에서 발표되지 않은 결과와 대조적입니다.포자 형성 및 역량을 사용하여 기자가 거의 또는 전혀 타격을 확인하지 못했습니다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 HI 비율은 매우 가변적이며 사전에 예측하기 어려울 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 잠재적인 유도 콜로니가 분리를 위해 선택되기 전과 후의 공동 배양 스크린 플레이트의 두 가지 예입니다.패치 및 스팟 방법 모두의 음성 및 양성 결과가 여기에 표시되며, 2차 검사에서 검사된 집락의 약 50%가 진양성입니다. 이러한 절차에 따라서, 추가적인 질문에 답하기 위해 다른 방법들을 수행할 수 있는데, 예를 들어, 유도 유기체의 계통발생학적 동일성을 결정하기 위한 16 s SR DNA 염기서열분석, 또는 활성 화합물의 화학적 동일성을 결정하기 위해 NMR에서 HPLC 질량 분석법을 사용한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Speare, L., et al. Vibrio fischeri 분리주 간의 경쟁적 상호 작용을 정량화하기 위한 공동 큐베이션 분석. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 박테리아 균주가 공유 환경에서 어떻게 경쟁하는지 연구하는 데 사용되는 공동 배양 분석을 보여줍니다. 이러한 상호 작용을 유도하는 접촉 의존적 또는 접촉 독립적 사멸과 같은 메커니즘을 식별하기 위해 미생물학에 널리 적용됩니다.

박테리아 균주 간의 경쟁적 상호 작용을 연구하기 위한 공동 배양 분석

출처: Nathoo, N., et al. 식물/미생물 분자 상호 작용 및 신호 전달의 동시 및 체계적 분석을 위한 수경 공동 재배 시스템. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 멸균 조건에서 식물-박테리아 상호 작용을 연구하기 위한 수경 공동 재배 시스템을 보여줍니다. 식물 묘목은 멸균된 산성 성장 배지로 옮겨져 배양되고 Agrobacterium을 접종하기 전에 오염 여부를 검사합니다. 활성화된 박테리아는 식물 뿌리에 부착되어 T-DNA를 식물 세포로 전달하며 박테리아 집락화를 강화하는 분자 변화를 촉진합니다.

식물 숙주와 상호 작용하는 박테리아의 분자 반응을 연구하기 위한 공동 배양 시스템

출처: 템킨, M. I. 외 미생물 상호작용 연구를 위한 고처리량 공동 배양 분석법. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 코리네박테리움 프로핀쿰과 포도상구균 간의 미생물 상호작용을 연구하기 위한 시험관 내 검사를 시연합니다.

공동 배양에서 미생물 상호작용을 연구하기 위한 시험관 내 분석법

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

이 프로토콜에 제시된 공동 문화 상호 작용 분석은 저렴하고 높은 처리량이며 간단합니다. 이 계산은 공동 배양에 있는 미생물 상호 작용을 관찰하고, 상호 작용 패턴을 확인하고, 인간과 환경 병원체에 대하여 관심있는 미생물 긴장의 억제 잠재력을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

이 프로토콜은 광독립영양 설탕 분비 시아노박테리아 및 종속영양 효모를 포함한 공동 배양의 설정 및 정량적 모니터링을 위한 포괄적인 지침을 제공합니다.

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

배우세요 화학적 매개 종간 상호작용을 공배양과 형광 리포터를 사용하여 검출하는 방법을. Bacillus subtilis 유전자 발현 변화를 실시간으로 관찰하여 미생물 생태학 연구에 활용할 수 있습니다.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

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