Name: 바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 배우세요 이중 유입구 마이크로유체 유동 셀을 사용하여 바이오필름과 화학적 환경 간의 상호작용을 특성화하는 방법을. 포도당 농도 기울기 하에서 바이오필름 발달을 연구하고 형광 추적자를 활용한 용질 수송 및 유동장 분석 기법을 익힐 수 있습니다.

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우리는 P.를 제공하기 위해 워싱턴 대학 (시애틀, WA)에서 매트 PARSEK 감사합니다 녹농균 및 E. 스트림 소프트웨어에 대한 액세스를 제공하는 캔터베리 (뉴질랜드) 대학의 대장균 균주와 로저 Nokes. 이 작품은 국립 보건원, 알레르기의 국립 전염병 연구소에서 보조금 R01AI081983에 의해 지원되었다. 공 초점 영상은 노스 웨스턴 생물 이미징 시설 (BIF)에서 수행 하였다.

1. 흐름 전지 설치 및 접종 주 :.에 노래 등 기술 이중 입구 미세 유체 흐름 세포를 사용하여 2014 년 14 생물막 성장한다. 이 플로우 셀은 잘 정의 된 매끄러운 화학적 구배를 생성 할 수있다. 플로우 셀 설계는 이전에 설명 된 노래도 1에 도시 된 셀 제조되는 흐름 등., 2014 (14). 여기서는 상세히 P. 우리의 방법을 사용하여 녹농균 및 E. 대장균은 바이오 필름을 형성하지만, 다른 종은 너무 적합 할 수있다. 우리는 P. 사용 구성 적으로는 녹농균 생물막 개발 모델 생물로서, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 GFP를 PAO1-. 또한, 우리는 E.을 사용 대장균 DH5α는 P. 혼합 종 생물막 (biofilm)을 형성한다 녹농균. P. 녹농균 및 E. 콜라이 균주를 LB 아가 플레이트상에서 성장시켰다. <ol><li> 에 (PDMS) 결합 흐름 세포 사용하여 폴리 디메틸 실록산을 준비14에 기술 된 바와 같이 산소 플라즈마 처리를 통해 유리 커버 슬립. 흐름 셀 챔버의 크기는 0.24 mm (길이 × 폭 × 깊이) × 23mm × 13 mm의입니다. </li><li> 준비 FAB 성장 매체 (15)를 수정했습니다. 흐름 세포 내에서 영양 그라데이션에서 바이오 필름의 성장을 관찰하기 위해, 하나의 입구에 0.6 μM 포도당 15 매체 FAB을 수정하고, 다른 입구를 통해 어떤 탄소원없이 FAB 매체를 소개 소개합니다. 소독 필터 (기공 크기 = 0.2 μm의) FAB 매체에 추가하기 전에 글루코스 원액 (60 mm)이다. 또한주기 1 FAB 매체 오토 클레이브 (액체, 15 분 121 ° C, 17 PSI)을 사용하기 전에. </li><li> 유동 시스템을 소독. 접종하기 전에, 총 흐름 (매체 병, 튜브, 기포 트랩, 유동 세포) 플로우 셀의 상류에 위치 (일회용 및 사전 멸균) 플라스틱 삼방 밸브를 제외하고, 사이클 1을 사용하여 오토 클레이브. (방법 3 밸브는 셀 (C)을 주입하기 위해 사용된다ulture, 형광 추적 및 마이크로 비드.) 조립시 오염을 방지 알루미늄 호일 또는 고압 증기 멸균 전에 오토 클레이브 가방과 함께 모든 튜브 및 커넥터를 막지합니다. </li><li> 흐름 시스템을 연결합니다. 신중 흐름 전지 시스템의 구성 요소를 조립 (유동 시스템 어셈블리 비디오 참조)과 정밀하게 유량을 제어하는​​ 연동 펌프를 통하여 플로우 셀에 성장 배지를 제공한다. </li><li> P.의 식민지를 전송하여 접종 세포 배양을 준비 녹농균 또는 E. LB 플레이트에서 3 LB 배지 ㎖의 225 rpm으로 37 ° C에서 문화 O / N을 흔들 대장균. 최종 OD 600 멸균 수 1 ㎖ 중의 O / N 세포 배양을 희석 = 0.01로 접종. (문화 및 오염을 피하기 위해 층류 후드에서 박테리아 희석). </li><li> 등가 OD (600)를 1ml 1 = 0.01 각각의 세균에 대해 : 혼합 종 생물막으로 실험을 위해, (1)의 비율로 두 세균 배양 물을 희석. </li><li> 플로우 셀을 접종한다. 삼방 밸브로부터 플로우 셀 흡입구 균액 1ml를 주입한다. 주입 후, 균체 커버 유리에 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 흐름을 일시 정지. (흐름 세포가 일시 중단 세포가 커버 슬립에 정착 할 수 있도록 아래로 커버 슬립면이 배치되어 있는지 확인합니다.) </li><li> 1 시간 후, 흐름을 재개하고 3 일간 각 입구 0.03 ㎖ / 분의 일정한 속도로 플로우 셀에 성장 배지를 펌핑. </li></ol> 공 초점 현미경을 사용하여 영양소 그라디언트에 응답 2. 특성화 바이오 필름 개발 참고 : P. 녹농균은 구조적으로 발현 GFP 군데 있지만, E. 할 수 있습니다 혼합 종의 바이오 필름에서 대장균이 대조 염색에 의해 촬영해야합니다. <ol><li> 공 초점 현미경을 사용하여 3 일 생물막 (biofilm)을 준수하십시오. 대표 결과, 63X의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 생물막을 관찰합니다. 이미징에 앞서, 마크커버 유리 측의 격자 이중 입구 유동 셀. (이 그리드의 목적은 실험자가 플로우 셀 챔버 내에 이미징 영역을 찾을 수 있도록하는 것이다.) </li><li> 이러한 STYO (62), 990 μL에 원액 (1 ㎜)의 물을 소독 한 다음 천천히 주사기로를 사용하여 희석 얼룩을 주입 등 녹색 형광 핵산 얼룩 등의 세포 투과 적색 형광 핵산 얼룩의 10 μl를 희석, Counterstain과려면 상류 삼방 밸브로부터 플로우 셀 챔버. 정체 유동 세포를 유지하고 30 분 동안 어두운 데에서, 다음 15 분 동안 결합​​되지 않은 얼룩을 씻어 흐름을 재개. </li><li> 공 초점 이미징을 수행합니다. 여기에 대한 488 nm의 아르곤 레이저와 GFP (500-535 nm의)과 (녹색 형광 핵산 얼룩에 대한, 650 ~ 750 ㎚) 핵산 얼룩을위한 채널을 수집 방출을 활성화합니다. 밝고 깨끗한 이미지를 가지고 두 채널에 대한 이득 및 오프셋을 조정합니다. 선택 XYZ 동시 영상 모드. IDEN하기 위해 Z-컨트롤 노브를 사용하여필드 생물막의 하단과 상단을 검사에서 발견. 3-D 이미지를 취득하는 스택 0.5 ㎛ 인 Z-단계를 설정한다. (화상 취득 네 라인 평균을 사용하여 높은 화상 품질을 보장​​하기 위해). </li><li> 세 개에서 공간적 플로우 셀 내의 생물막 개발 패턴 화상 생물막 매핑 자세히 길이 (X) 흐름 세포 유입을 따라 거리를,도 1에 도시 된 바와 같이 세 개의 횡 방향 (y)에, 부과 영양 그라데이션 상대 위치 . </li></ol> 보수적 형광 추적기의 주사 3. 특성화 내부 용질 전송 참고 사항 : Cy5에 같은 보수적 형광 트레이서는, 생물막 내부 용질 수송 패턴을 특징 짓는 데에 이용 될 수있다. <ol><li> 원액으로 ㎖의 10 ㎎ / 최종 농도 Cy5에 물 (모노 반응성 NHS 에스테르) 녹인다. -20 ° C 냉장고에 Cy5의 주식 솔루션을 저장합니다. 참고 : Cy5의 빛 - sensit이기 때문에필자, 상점, 희석 어두운 Cy5의 용액을 주입. </li><li> 형광 탐침의 주사에 앞서, (63X 대물 렌즈)와 공 촛점 현미경으로 3 일 생물막의 3-D 화상을 스택. (생물막 식민지의 넓은 지역 염료 전송의 시계열 관측에 적합하다.) (그림 5A 참조) 또한 이미지에 잘 구분 식민지와 Z 평면을 선택합니다. </li><li> 각 Cy5에 주입 실험을 위해, 20 ㎍ / ml의 Cy5의 농도를 갖는 주사 용액을 수득 물을 998 μL의 멸균 Cy5의 스톡 용액 2 μl를 희석. </li><li> 흐름을 일시 중지 및 3 방향 밸브를 통해 주사기를 사용하여 플로우 셀의 상류에 Cy5의 용액을 주입하는 펌프를 중지. (이는 주입하면서 유로 들어가는 기포를 방지하는 것이 중요하다. 버블 트랩 다시 주입 동안 열려 유지되어야한다.) </li><li> Cy5의 용액을 주입 한 후, 3 방향 밸브를 조정, 거품 트랩을 닫고 다시 시작플로우 셀에 주입 Cy5의 솔루션을 제공하는 펌프. </li><li> xyt하는 공 초점 영상 모드를 전환합니다. 동시 촬영 모드에서 Cy5에와 GFP 채널을 활성화합니다. (레이저 강도 이득 및 오프셋) Cy5의 강도에 촛점 설정을 조정 정량 중요한 신호를, 포화 방지하기 위해. (높은 시간 해상도는 염료 침투를 가시화하는 것이 바람직하다. 그러나, 빠른 스캔 이미지 품질을 감소시킨다.) 이미징의 시간 해상도 및 화상 품질의 균형을 적절한 주사 속도와 라인 평균을 선택한다. 이 프로토콜을위한 네 가지의 라인 평균 0.15 Hz의 프레임 레이트를 사용한다. </li><li> (아직 0.03 ㎖ / 분의 유속으로)로 플로우 셀을 제공하는 Cy5의 흐름을 재개. 동시에 시계열 공 초점 영상을 시작합니다. </li><li> 반경 방향으로 2-D 원형 생물막 콜로니 내에 Cy5의 강도를 평균하여 Cy5의 침투를 정량화. 제 생물막 클러스터의 에지를 식별, 평균 다음 클러스터의 2-D 섹션 거리 맵을 생성그리고 최종적 Cy5의 강도의 평균 반경 패턴 침투 곡선 (도 6 참조)를 생성한다. <ol><li> 계산 3.8 단계 실현하기 위해, BioSPA (바이오 필름의 공간 패턴 분석) 소프트웨어 패키지 (게시되지 않은, 소프트웨어 패키지 및 수동 요청시 사용 가능) 또는 다른 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. </li><li> BioSPA를 사용하려면 먼저 BioSPA로 설정 이미지를 가져옵니다. 그런 다음 이진 이미지를 만들기 위해 GFP와 Cy5의 채널에 대한 적절한 임계 값을 선택합니다. 분석 / 계산 메뉴에서 고급 분석하고 확산 분석을 선택합니다. 클러스터의 에지를 정의하는 관심 영역 (ROI)의 영역으로서 하나의 클러스터를 선택하는 다각형 도구를 사용하여 GFP 채널을 사용한다. </li><li> 더블 확산 분석을 수행하기 위해 선택한 생물막 클러스터를 클릭합니다. 확산 분석 결과를 저장하고 검량선을 이용하여 Cy5의 농도와 Cy5의 강도를 교정. <ol><li> Cy5에의 conce 위에 Cy5의 강도를 측정, Cy5의 농도 검량선을 생성하려면공 초점 현미경 아래 ntration 구배. (Cy5의 강도와 농도는 선형 관계가 있습니다.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 현황 형광 발색 입자의 주변 환경 유동장 특성화 주 : 형광 마이크로 비드와 같은 형광 물질, 생물막 주위 유동장을 특성화하는데 사용될 수있다. 생물막 주위 유동장 입자 유속계 추적 소프트웨어를 사용하여 입자 위치의 시계열 관측치로부터 계산 될 수있다. 여기에 표시된 결과는 스트림 2.02 소프트웨어 패키지 (16) (소프트웨어 다운로드 및에서 사용 가능한 사용자 설명서 얻었다 <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> 0.2 %의 최종 고형분 농도 0.5 ml의 최종 부피의 멸균 형광 마이크로 비드 (직경 ~ 1 ㎛)를 희석. 소용돌이는 마이크로 비드가 있는지 확인잘 분산되어있다. </li><li> 주입 및 단계 3.3-3.5에서 절차에 따라 유동 셀에 희석 형광 마이크로 비드를 제공합니다. 입자 경로의 정확한 추적이 (이 종이 입자 조회 결과 0.01 ㎖ / 시간) 상대적으로 낮은 유속을 사용할 수있게한다. </li><li> 하나의 Z-슬라이스에서 입자의 움직임을 추적하고 시계열 이미지를 취할 모드를 xyt에 촛점 설정을 전환합니다. (1 Hz의 프레임 레이트는 본 문서에서 나타낸 대표적인 결과를 사용 하였다.) 반복 입자 주입 및 이미지를 상이한 Z 위치에서 3-D 흐름 필드를 생성한다. </li><li> 전처리 시계열 (가능한 소프트웨어 다운로드 및 사용 설명서가 ImageJ에 배경 형광 신호 (이미지 세트의 처음에서 취득 된 화상 신호)를 감산함으로써 공 초점 화상 <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">을 http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 또는 다른 프로그램. </li><li> ImageJ에에서 이미지 세트의 첫 번째 이미지를 열고 이미지 세트를 가져옵니다. 프로세스에서 / 이미지 칼슘lculator, 이미지 세트로부터 첫 번째 이미지를 뺀다. 사전 처리 된 이미지 설정을 저장합니다. </li><li> 스트림 2.02의 흐름 벡터, 수입 시계열 공 초점 이미지를 계산합니다. &quot;열기 프로세스보기&quot;에서 선택하고 &quot;입자를 식별&quot;실행합니다. 입자를 식별하기 위해 적절한 임계 값을 사용합니다. 1 μm의 입자의 최소 및 최대 직경 임계 값 0.5, 5 μm의를 사용합니다. </li><li> 그런 다음 &quot;열기 프로세스보기&quot;에서 선택하고 입자 경로를 생성하기 위해 &quot;PTV 분석 파이프 라인&quot;을 실행합니다. 그들은 입자의 움직임을 표현 있는지 확인하기 위해 입자 경로를 확인합니다. 마지막으로, 선택하고 흐름 벡터지도를 생성하기 위해 &quot;속도 필드 만들기&quot;를 실행합니다. </li></ol>

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생물막 화학 그라디언트에 대한 응답으로, 주변의 흐름 미세 환경에 생물막 성장, 그리고 내부 전송 제한으로 인한 생물막 이질성의 효과 : 우리는 세 가지 중요한 바이오 필름 - 환경 상호 작용을 특성화하는 방법의 제품군을 보여 주었다. 우리는 먼저 생물막 개발 잘 정의 된 화학 구배를 부과하는 신규 한 마이크로 유체 유동 셀의 사용을 나타내었다. 플로우 셀 내에 잘 정의 된 화학 그라디언트를 생성하기 위해, 모두 동일한 흡입구 용 유량을 유지하는 것이 중요하다. 연동 펌프가 잘 같은 속도로 성장한다 매체를 제공하는 두 흐름 채널 조정되어 있는지 확인합니다. 또한 생물막 성장하는 동안 유로의 막힘이없는 것을 확인합니다. 화학 그라디언트 크게 생물막 내 생물막 성장과 종 (species) 간의 상호 작용에 영향을 미치지 않음이 흐름 세포 쇼 듀얼 종의 바이오 필름의 성장의 관찰. 화학 그라디언트에 공통적전송 제한, 화학 결합 및 반응, 미생물의 흡수 및 대사 18-20의...

세포 외 고분자 매트릭스 1로 묶인 세포 집합체 - 미생물 표면과 형태의 바이오 필름에 부착합니다. 바이오 필름은 세포 대사 2,3 내부 용질의 전송 제한 및 공간 변화의 조합으로 인한 극적인 공간 이질성을 가지고 있기 때문에 바이오 필름은 매우 다르게 각각의 미생물 세포에서 작동합니다. 산소와 영양소 농도는 크게 바이오 필름 ​​및 유체 및 추가 생물막 2 내에 고갈 얻을 주변 사이의 인터페이스에서 감소. 생물막 호흡과 단백질 합성 공간적 변형, 국소 산소 및 영양분이 가능 여부에 대한 응답으로서 일어날 수있다. 수생 및 토양 환경에서 대부분의 박테리아는 생물막에 거. 천연 바이오 필름은 탄소와 질소 순환 및 금속 4,5 감소를 포함하여 중요한 생지 화학 과정을 수행한다. 임상, 바이오 필름 형성이 응 답이다장기간 폐 요로 감염 6 지나치지. 바이오 필름에 세포가 자신의 플랑크톤 대응 (6)에 비해 항생제에 매우 높은 저항을 가지고 있기 때문에 바이오 필름 ​​관련 감염은 매우 문제가있다. 바이오 필름은 다양한 설정에 중요하기 때문에, 연구의 상당량 생물막 활동 및 생물막 공간적 이질성 및 주변의 미세 환경을 제어하는​​ 환경 적 요인을 이해에 집중되어왔다. 이전의 연구 개발 생물막 강하게 환경 요인들에 의해 조절되는 것을 발견 하였다 : 생물막 다양한 유동 조건 하에서 상이한 모폴로지 개발; 산소와 영양소의 가용성에 영향을 미치는 바이오 필름 형태; 및 유체 전단 응력은 표면에 플랑크톤 세포의 부착과 생물막 7-9에서 세포의 분리에 영향을 미칩니다. 또한, 외부 유동 조건은 기판 INT의 전달에 영향을 미친다O 및 바이오 필름 ​​(10) 내의. 생물막의 성장은 또한 물리적 및 화학적 조건을 둘러싼 바꾼다. 예를 들어, 생물막의 성장은 산소와 영양분이 고갈의 로컬 리드; 바이오 필름은 주변 환경 (11)으로부터의 무기 및 유기 화합물을 축적; 생물막 클러스터는 흐름과 증가 표면 마찰 12,13 전환. 생물막들은 매우 복잡한 방식으로 주변 환경과 상호 작용하기 때문에, 동시에 생물막 특성 및 환경 조건에 대한 정보를 얻기 위해 중요하며, 다 분야 접근법 종합적 생물막 인바 상호 작용을 특성화하기 위해 이용 될 필요가있다. 여기에서 우리는 부과 영양 그라데이션에서 단일 종 및 듀얼 종 생물막 내 미생물 성장에 공간 패턴을 특성화하고 지역 화학 및 유체 미세 환경의 결과 수정을 관찰하기 위해 통합 된 방법의 일련을 제시한다. 우리는 전나무ST는 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰하는 최근에 개발 된 이중 입구 미세 유체 흐름 세포의 사용을 기술한다. 우리는 그 다음 영양 조건 범위 하에서 생물막 세균, 녹농균 및 대장균, 두 종의 성장을 관찰하는 미세 유체 흐름이 셀의 사용을 입증한다. 우리는 생물막 식민지에 형광 추적 전파의 현장 시각화 정량적으로 생물막 (biofilm)에 용질 수송의 패턴을 평가하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 초점 현미경 하에서 수행 마이크로 입자 추적 속도계는, 생물막의 주위에 성장하는 지역 흐름 필드를 취득 할 수있는 방법을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>연동 펌프</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>펌프 튜빙 0.50&nbsp; mm OVC, 오렌지/옐로우</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>스위블 남성 루어 잠금 장치가 있는 세 방향 스톱콕</td><td>Smiths Medical&nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>Sylgard 184 태양 전지 캡슐화 태양 전지판</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>Pyrex Medium Bottle, 1&nbsp; L, GL45 VWR</td><td></td><td>16157-191</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>C-FLEX 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>1ml TB 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>폴리머 튜빙</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>멸균 Intramedic Luer Stub 어댑터</td><td>Clay Adams</td><td>427564</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>HACH</td><td></td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>주사기 필터 - 멸균 (0.2 &mu; m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>플로우 셀 설정 및 접종</td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 무수</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>일염기성 인산칼</td>륨 <td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S7653</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M8266</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C5670</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>황산 칼슘 이수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C3771</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>철 (II) 황산염 헵타 하이드레이트</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>망간 (II) 황산염 일 수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M7634</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>구리 (II) 황산염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>451657</td><td>성장 매체</td></tr> 황<tr><td>산 아연 헵타 하이드레이트</td><td>시그마 Aldrich</td><td>Z0251</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>코발트 (II) 황산 헵타 하이드레이트</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C6768</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>몰리브덴산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>243655</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마 알드리치</td><td>B6768</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>포도</td>당 시<td>그마 알드리치</td><td>D9434</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>루리아 베르타니 육수</td><td>시그마 알드리치</td><td>L3022</td><td>성장 매체</td></tr><tr><td>TCS SP2 컨포칼 현미경 라이</td><td>카</td><td></td><td>형광 이미징</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>형광 이미징</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>형광 이미징</td></tr><tr><td>적색 형광(580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>형광 이미징</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>이미지 처리</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>이미지 처리</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>이미지 프로세싱</td></tr><tr><td>스트림 2.02</td><td>University of Cantebury</td><td></td><td>이미지 프로세싱</td></tr></tbody></table>

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

바이오 필름은 복잡한 구조를 가지고 중요한 공간 이질성을 생산 표면에 부착 된 미생물 커뮤니티입니다. 생물막 개발이 강하게 주변 유동 및 영양 환경에 의해 조절된다. 바이오 필름 성장은 복잡한 흐름 필드와 용질 수송 패턴을 생성하여 로컬 미세 환경의 이질성을 증가시킨다. 바이오 필름 ​​및 로컬 마이크로 서식지 사이에 생물막 (biofilm)과의 상호 작용에서 이질성의 개발을 조사하기 위해, 우리는 녹농균의 모노 종의 바이오 필름 ​​및 P.의 듀얼 종의 바이오 필름을 성장 미세 유체 흐름 세포에 영양 그라디언트에서 녹농균과 대장균. 우리는 흐름 세포 내에서 영양소 그라디언트의 작성 및 성장과 이러한 조건에서 바이오 필름 개발을 시각화에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 광학적 방법의 시리즈를위한 본 프로토콜은 DISTRI 흐름, 생물막 구조에서 공간 패턴을 정량화하기시킴 주위에 바이오 필름, 대량 전송을 통한 생물막 식민지 내에서. 이러한 방법은 바이오 필름과 서식지의 이질성의 공동 개발에 대한 포괄적 조사를 지원합니다.

이중 입구 마이크로 유체 유동은 유동 셀 챔버 내에 두 용액의 혼합에 의해 형성 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰 할 수있다. 그 결과 화학 그라데이션 이전 염료 주입에 의해 관찰과 노래 등. (14)에 의해 구체적으로 분석되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이 부드러운 농도 기울기는, 횡 방향으로 형성했다. 농도 프로파일은 입구 근처 험했다 의한 확산 (도 1)의 하류에있어 완화. 영양 그라데이션에서 바이오 필름 개발을 관찰하기 위해, 우리는 유일한 탄소원으로 하나의 입구에 추가 포도당으로 정의 된 최소한의 성장 매체 (FAB 매체)를 사용했다. 다른 모든 영양소가 균일 분산 된 상태에서이 플로우 셀 챔버 내의 포도당 구배를 수득 하였다. P.의 성장 녹농균 PAO1 생물막 강하게 포도당의 로컬 배달 (그림 2)에 상관 관계가 있었다.횡 글루코스 농도 ...

생물막은 주변 환경과 복잡한 상호 작용을 합니다. 생물막-환경 상호 작용을 종합적으로 조사하기 위해 여기서는 생물막 개발을 위한 이질적인 화학적 환경을 조성하고, 국소 유속을 정량화하고, 생물막 군집 내부 및 주변의 질량 수송을 분석하는 일련의 방법을 제시합니다.

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

본 절차의 전반적인 목표는 통합된 방법들을 사용하여 바이오필름과 주변 환경의 상호작용을 규명하는 것입니다. 포도당 포함 배지와 포도당 제거 배지가 유체 칩을 통해 펌핑되어 포도당 농도 구배를 생성하는 이중 입구 미세유체 흐름 셀 시스템을 구축합니다. 시스템에 박테리아를 첨가하고 며칠 동안 바이오필름이 형성되도록 합니다.그 후 3D 공초점 현미경으로 바이오필름을 촬영하여 용질 수송 특성을 분석합니다. 바이오필름 내의 유동장을 분석하기 위해 형광 추적자를 유동 시스템에 주입하고 타임랩스 이미징을 수행하며, 형광 마이크로비즈를 주입하고 타임랩스 이미징을 수행합니다. 결과 데이터에 대한 용질 수송 및 입자 추적 분석을 통해, 단일 장치 내의 다양한 화학적 환경에서 바이오필름 프로세스를 평가하는 데 있어 이 방법의 유용성을 입증합니다.이 방법들의 주요 장점은 바이오필름 환경 상호작용의 여러 측면을 동시에 평가할 수 있다는 점입니다. 여기에서 보고된 방법들은 자연 환경에서의 바이오필름 형성 또는 바이오필름 관련 감염에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 층류 후드(laminar flow hood) 내에서, LB 플레이트에 있는 P. aeruginosa PAO1-GFP 콜로니 하나와 E. coli DH5α 콜로니 하나를 각각 3 mL의 LB 배지가 담긴 별도의 튜브로 옮깁니다.배양물을 37 °C에서 225 RPM으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 이 유동 시스템은 이중 입구 미세유체 셀을 기반으로 하며, 유동 챔버 내에서 두 용액을 혼합하여 형성된 명확한 화학적 구배 하에서 바이오필름 성장을 관찰할 수 있게 합니다. 유동 중에 횡방향으로 매끄러운 농도 구배가 형성됩니다.확산의 결과로, 농도 프로파일은 입구 근처에서 가파르게 나타나며 하류로 갈수록 완만해집니다. 실험 당일에 유체 시스템을 주의 깊게 조립하십시오. 먼저 튜빙을 연동 펌프에 고정한 다음, 튜빙의 한쪽 끝은 glucose가 포함된 FAB 배지 900 milliliters가 들어 있는 배지 병에 연결하고, 다른 쪽 끝은 버블 트랩에 연결합니다.이 과정을 반복하여 glucose가 포함되지 않은 fab 900 milliliters가 담긴 두 번째 배지 병을 두 번째 버블 트랩에 연결합니다. 다음으로, 유량 셀(flow cell) 입구 직전에 3방향 밸브를 삽입하고 각 버블 트랩을 유량 셀에 연결합니다. 마지막으로, 유량 셀 출구를 폐액 병에

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 biofilm 형성을 조사하기위한 간단한 세미 양적 방법을...

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

출처: 미켈 게녹, C. 외. 공초점 및 전자현미경을 이용한 섬유성 곰팡이 군락의 박테리아 바이오필름 정성적 다척도 분석에 관한 새로운 방법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 콜로판 형성과 방사형 성장을 지원하기 위해 처리된 셀로판 막 위에 곰팡이 배양물을 준비하는 과정을 보여줍니다. 그 후 상호작용 분석에 대한 토양 박테리아 세포의 배양 및 준비 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 박테리아 세포가 곰팡이 집락에 어떻게 부착하여 바이오필름을 형성하는지를 보여주어 박테리아-곰팡이 간 상호작용 연구를 가능하게 합니다.

바이오필름 형성을 위한 곰팡이-박테리아 공동 배양 확립

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

진화 시나리오되지만 (공간적 분리)의 역할은 공간 분포의 조정을 허용하는 제어 실험실에서 미생물 단순한 시스템을 사용하여 조사 할 수있다. 설립자 셀 밀도를 수정하여, 다양한 구색 수준은 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 식민지 바이오 필름에 형광 표지 된 박테리아 균주를 사용하여 시각화 할 수 있습니다.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

시각적 클러스터링 함께에서 cytometry 수생 biofilms 공부는 쉬운--사용 하 고 빠른 방법을 제공 합니다. 그것은 biofilm 특성, biofilm 커뮤니티 구조에 변화의 탐지 및는 biofilm에 포함 하는 비 생물 적인 입자의 탐지에 사용할 수 있습니다.

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

미생물 생물막은 서로 복잡한 구조를 형성하고 매우 규모에 의존하는 공간 패턴으로 발전합니다. 여기에서는 3D 광학 일관성 단층 촬영(OCT) 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위한 실험 시스템(하드 및 소프트웨어)을 소개합니다. 이 도구 세트는 공간과 시간에 생물막 형태 형성의 비침습적 및 다중 스케일 특성화를 허용합니다.

대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영

녹농균 생물막 구조에 대한 항균 유도 변화는 낭포성 섬유증 및 만성 폐 감염 환자로부터 배양한 임상 분리물 간에 다릅니다. 컨포칼 현미경 검사 후 COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 항감염제의 효능을 평가하기 위해 개별 분리체에 대한 생물막 구조(예: 표면적, 두께, 바이오매스)의 변화를 정량화할 수 있습니다.

COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

다양한 rhizosphere 토양에서 시너지 효과가 있는 다종 생물막 군집을 구축하기 위한 빠르고 표준화된 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 이는 복잡한 rhizosphere 토양 미생물군을 조사하고 시뮬레이션하도록 설계된 고유한 프로토콜입니다.

Rhizosphere 토양에서 Multispecies Biofilm Communities를 구축하는 접근 방식

배우세요 이중 유입구 마이크로유체 유동 셀을 사용하여 바이오필름과 화학적 환경 간의 상호작용을 특성화하는 방법을. 포도당 농도 기울기 하에서 바이오필름 발달을 연구하고 형광 추적자를 활용한 용질 수송 및 유동장 분석 기법을 익힐 수 있습니다.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

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