바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 이를 수행하기 위해 통합된 방법을 사용하여 주변 환경과의 생물막 상호 작용을 특성화하는 것입니다. 이중 주입구 미세유체 플로우 셀 시스템은 포도당 함유 및 포도당이 없는 배지가 플로우 셀을 통해 펌핑되어 포도당 구배를 생성하는 구조로 구성됩니다. 박테리아가 시스템에 추가되고 생물막이 며칠에 걸쳐 발생하도록 합니다.

그런 다음 생물막을 3D 컨포칼 현미경으로 이미지화하여 솔루 수송을 특성화합니다. 생물막 내에서 형광 추적자를 흐름 시스템에 주입하고 타임랩스 이미징을 수행하여 생물막 집락 주변의 유동장을 특성화하고 형광 마이크로비드를 주입하고 타임랩스 이미징을 수행합니다. 결과 데이터의 용질 수송 및 입자 추적 분석은 단일 장치 및 단일 실험 세트에서 다양한 화학 환경에서 생물막 프로세스를 평가하는 데 있어 이 방법의 유용성을 보여줍니다.

이 방법의 주요 장점은 생물막 환경 상호 작용의 여러 측면을 동시에 평가할 수 있다는 것입니다. 여기에 보고된 방법은 자연 환경 또는 생물막 관련 감염에서 생물막 형성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 층류 후드에서 작업, posa PAO 1 GFP 끝의 식민지, LB 플레이트에서 e coli DH 5 알파의 식민지를 lb 국물 3 밀리리터를 포함하는 별도의 튜브로 이동합니다.

섭씨 37도에서 하룻밤 동안 225RPM으로 흔들면서 배양물을 배양합니다. 이 플로우 시스템은 플로우 챔버 내에서 두 가지 용액을 혼합하여 형성된 잘 정의된 화학적 구배에서 생물막 성장의 관찰을 용이하게 하는 이중 입구 미세유체 셀을 기반으로 합니다. 흐르는 동안 가로 방향으로 부드러운 농도 구배가 형성됩니다.

확산의 결과, 농도 프로파일은 입구 근처에서 가파르고 다운스트림에서 더 느긋합니다. 실험 당일에는 흐름 시스템을 조심스럽게 조립하십시오. 먼저 튜브를 연동 펌프에 고정한 다음 튜브의 한쪽 끝을 포도당이 함유된 900ml의 FAB 배지가 들어 있는 중간 병에 연결하고 다른 쪽 끝을 버블 트랩에 연결합니다.

이 과정을 반복하여 포도당이 없는 900ml의 팹이 들어 있는 두 번째 중간 크기의 병을 두 번째 버블 트랩에 연결합니다. 다음으로, 플로우 셀 주입구 바로 앞에 3방향 밸브를 삽입하고 각 버블 트랩을 플로우 셀에 연결합니다. 마지막으로 플로우 셀 배출구를 폐기물 병에 연결합니다.

부유 셀이 커버 슬립에 가라앉을 수 있도록 커버 슬립 면이 아래로 향하도록 플로우 셀이 배치되었는지 확인합니다. 유량 시스템을 조립한 후 각 입구에 대해 시간당 10ml의 유속으로 연동 펌프를 켜서 시스템을 채웁니다.매체를 사용하면 팹 매체가 하나의 입구에만 제공되는 포도당과 함께 두 개의 입구에 도입됩니다. 다음으로, 후드에서 작업하여 두 박테리아 배양액을 1밀리리터의 멸균수 중 1:1의 비율로 각 박테리아에 대해 0.01의 등가 OD 600으로 희석하여 플로우 셀을 접종하고, 멸균 플라스틱 주사기를 사용하여 500마이크로리터의 접종물을 3방향 밸브를 통해 각 플로우 셀 주입구에 주입합니다.

주입 후 펌프를 중지하고 세포가 부착된 후 1시간 동안 박테리아 세포가 커버 유리에 부착되도록 하고, 펌프를 각 주입구에 대해 분당 0.03밀리리터로 설정하고, 포도당 노출 구배 아래에서 생물막이 발생하는 실온에서 3일 동안 시스템이 흐르도록 합니다. 3일이 지난 후. 마커와 자를 사용하여 이미징을 준비하기 위해 플로우 셀의 커버 유리 쪽에 그리드를 그립니다.

이것은 대장균을 관찰하기 위해 얼룩을 방지하기 위해 이미징 영역을 찾는 데 도움이 됩니다. 먼저 카운터 얼룩은 빛에 민감하므로 조명을 꺼서 작업 영역을 어둡게 합니다. 주사기를 사용하여 1ml의 희석된 세포 투과 적색 형광 핵산 염색제를 유동 챔버 상류의 3방향 밸브에 천천히 주입합니다.

흐름을 중지합니다. 플로우 셀(flow cell)을 30분 동안 어두운 곳에 정체된 상태로 유지합니다. 30분이 지난 후.

분당 0.03밀리리터로 흐름을 재개하고 15분 동안 결합되지 않은 얼룩을 씻어냅니다. 그런 다음 흐름을 중지하고 63 x 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 생물막을 관찰합니다. 여기에 표시된 것처럼 잘 분리된 생물막 군체가 있는 충분한 양의 바이오매스를 포함하는 시야를 찾습니다.

그런 다음 적절한 채널에서 3D 이미지 스택을 캡처하여 플로우 셀 이미지 내에서 바이오필름 발달의 공간적 패턴, 플로우 셀 주입구를 따라 3개 이상의 세로 또는 X 거리, 부과된 영양 구배를 기준으로 3개의 가로 또는 Y 위치에서 바이오필름을 매핑합니다. 생물막 내의 solu 수송 패턴을 특성화하려면 flow cell부터 시작하십시오. 3일간의 생물막 현상 후 다시 어둠 속에서 작업했습니다.

펌프를 중지하여 흐름을 일시 중지하고 버블 트랩을 열어 사출 압력을 해제합니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 1ml의 희석된 공상 과학 추적 용액을 플로우 셀의 상류에 있는 3방향 밸브 중 하나에 주입합니다. 공상 과학 용액을 주입 한 후 버블 트랩을 닫습니다.

3방향 밸브를 조정하고 분당 0.03밀리리터로 펌프를 재시작하여 공상 과학 용액을 플로우 셀로 전달합니다. 다음으로, 컨포칼 이미징 모드를 프레임 속도가 0.15Hz인 XYT로 전환합니다. 염료 침투를 말로 표현하기 위해서는 높은 시간 해상도가 선호되지만 빠른 스캔은 이미지 품질을 저하시킵니다.

따라서 스캔 속도와 라인 평균을 설정하여 이미징의 시간 해상도와 이미지 품질의 균형을 맞추십시오. 이미징 매개변수가 설정되면 펌프를 다시 시작하여 흐름을 재개합니다. 분당 0.03밀리리터의 속도로 sci five가 동시에 플로우 셀로 전달됩니다.

타임랩스 컨포칼 이미징을 시작합니다. 타임랩스 이미징이 완료되면. 동봉된 문서의 지침에 따라 확산 분석을 수행했습니다.

생물막 주변의 유동장을 특성화하려면 형광 1마이크로미터 마이크로비드를 멸균된 물에 0.2%의 최종 고체 농도와 0.5ml의 최종 부피로 희석합니다. 그런 다음 vortex를 사용하여 마이크로비드가 잘 분산되었는지 확인하고 흐름을 일시 중지한 다음 희석된 형광 마이크로비드를 주입하여 플로우 셀(flow cell)에 전달합니다. 이전과 마찬가지로 유속을 시간당 0.01밀리리터로 변경합니다.

낮은 유속으로 인해 입자 경로를 정확하게 추적할 수 있습니다. 컨포칼 설정을 XYT 모드로 전환하고 하나의 Z 슬라이스에서 입자 이동을 추적하도록 소프트웨어에 지시합니다. 1Hz의 프레임 속도를 사용하기 전과 같이 시계열 이미지를 캡처합니다.

입자 주입 절차를 반복하고 다른 Z 위치에서 이미지를 촬영합니다. 이미징을 완료한 후 함께 제공되는 문서의 지침에 따라 유동 벡터를 계산하여 포도당 구배 하의 생물막에서 박테리아 상호 작용을 연구합니다. Posa GFP 및 E coli는 카운터 염색을 통해 이중 종 생물막에서 분화되었습니다.

cyto를 사용하여 flow chamber의 9개 이미징 영역 각각에서 62개의 이미지를 획득했습니다. 여기에 표시된 오버레이에서 posa GFP는 녹색 또는 노란색으로 표시되고 대장균은 빨간색으로 표시됩니다. Posa는 포도당 농도가 높은 지역에서 생물막 바이오매스를 지배했고 대장균은 포도당 농도가 낮은 지역에서 우세했습니다.

따라서 두 종은 뚜렷한 생태 학적 틈새를 차지했습니다. 이러한 결과는 복잡한 환경에서 생물막 개발 활동 및 상호 작용을 연구하는 데 있어 이중 입구 미세유체 흐름 셀의 유용성을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 이중 주입구 마이크로 유체 플로우 셀을 사용하여 화학적 구배에서 생물막을 성장시키는 방법과 개발 후 형광 입자 또는 체이서를 주입하여 생물막 개발을 위한 환경 파라미터를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이러한 방법은 환경 및 임상 미생물학 분야의 연구자들이 미생물 군집과 주변 환경 간의 복잡한 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.