망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법를 통해를 Transcleral 후방 접근
December 7th, 2016
망막하 주사는 단백질 및 바이러스 벡터와 같은 큰 치료제를 광수용체와 망막 색소 상피에 전달하는 가장 일반적인 기술입니다. 최소한의 부수적 손상과 빠른 회복 시간으로 망막하 공간을 성공적으로 표적으로 삼는 마우스의 대체 방법이 여기에 설명되어 있습니다.
이 연구의 전반적인 목표는 바이러스 벡터, 약리학적 제제를 표적으로 삼거나 마우스의 망막하 공간으로 만능 줄기세포를 유도하는 데 사용할 수 있는 새로운 망막하 주사 기술을 설명하는 것입니다. 이 방법은 망막 변성에 대한 새로운 치료 개입의 효능 평가와 같은 시력 과학 및 안과 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 효능, 최소한의 손상, 망막 구조 및 기능의 빠른 회복으로 망막하 공간에 물질을 전달하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.
절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Sachin P입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 쥐의 수염을 다듬어 시각화를 용이하게 하고 순환하는 물 패드로 동물의 체온을 섭씨 37도로 유지합니다. 다음으로, 2.5%의 페닐에프린 점안액으로 동공을 확장시킨다.
그런 다음 메틸셀룰로오스 점안액을 바르면 건조함을 방지하고 마취로 인한 일시적인 백내장을 최소화할 수 있습니다. 수술 전에 기구를 소독하십시오. 그 후, 희석된 플루오레세인을 생물 안전 캐비닛에 준비합니다.
주사기에 적절한 양의 플루오레세인을 채웁니다. 다음으로, 동물이 깊이 마취되었는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행하고, 주입할 눈이 위를 향하고 해부 현미경에서 명확하게 보이도록 마우스를 배치합니다. 끝이 가는 집게로 측두결막을 부드럽게 꼬집습니다.
그런 다음 구부러진 Vannas의 가위를 사용하여 약 90도의 둘레 절개를 만듭니다. 밑에 있는 테논 캡슐에 대해 절차를 반복합니다. 그런 다음 끝이 가는 집게로 주변 연결 문제를 절제하면서 지구를 비강으로 회전시킵니다.
시신경에서 약 0.5mm 떨어진 주사 부위를 향해 작업하고 후안와동이 방해받지 않도록 세심한 주의를 기울입니다. 중요한 단계는 안구 자체나 관련 구조를 손상시키지 않고 안구 회전이 필요한 주사 부위를 노출시키고 특히 안와 혈액 주머니의 손상을 방지하는 것입니다. 이 절차에서는 22.5도 안과용 칼날로 안컵을 부드럽게 긁어 주사 부위의 공막을 작게 절개합니다.
이 절개 부위는 바늘 끝이 공막을 통과할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 다음으로, 비스듬한 33 게이지 바늘을 경사가 망막을 향하고 망막과 평행하게 각을 이루도록 경화절개술에 삽입합니다. 플런저를 균일한 압력으로 천천히 눌러 원하는 양의 0.01%플루오레세인을 주입합니다.
바늘이 망막하 공간에 있을 때 플런저를 누르는 동안 약간의 저항이 느껴집니다. 바늘이 망막을 뚫으면 저항이 없지만 바늘이 공막이나 RPE를 관통하지 않으면 저항이 높습니다. 또 다른 중요한 단계는 망막하 공간을 대상으로 하는 주사입니다.
이것은 신경 감각 망막을 통해 유리체강으로 침투하지 않고 이루어져야 합니다. 역류를 최소화하기 위해 바늘을 빼기 전에 몇 초 동안 기다리십시오. 그런 다음 멸균 식염수로 눈을 헹구고 눈이 정상 위치로 다시 회전했는지 확인합니다.
그런 다음 주사된 눈의 각막 표면에 삼중 항생제 안과 크림을 두껍게 바릅니다. 그런 다음 복구를 위해 마우스를 깨끗한 독방 케이지에 넣습니다. 마취 회복 중 호흡과 체온을 모니터링하고 흉골 누운 상태를 유지할 수 있는지 확인합니다.
수술 후 통증 관리를 위해 카프로펜의 피하 주사를 포함하여 추가로 적절한 수술 후 모니터링 및 치료를 수행합니다. 다음은 주입 부위에서 돔 모양의 블렙을 3D로 재구성한 것입니다. 그런 다음 돔 모양의 bleb를 짙은 흰색으로 채워 망막 박리의 범위와 여백을 보여줍니다.
OCT의 망막 단면은 흰색으로 볼 수 있는 반면, RPE와 광수용체 수준에서 액체로 채워진 공간은 검은색으로 보입니다. 그리고 이 그림에서 최대 망막 박리 부위의 대표적인 OCTB 스캔은 주사 전, 주사 후 10분, 주사 후 4주에 대해 보여줍니다. 이 이미지는 0.3 마이크로리터 주입으로 인한 편평한 블렙의 형성과 분해능을 보여줍니다.
그리고 이 이미지는 0.5마이크로리터 주입에서 돔형 블렙의 형성 및 해상도를 보여주는 반면, 이 이미지는 1마이크로리터 주입에서 돔형 블렙의 형성 및 해상도를 보여줍니다. 마지막으로, 주사 부위에 심한 맥락막 흉터와 망막이 얇아지는 예가 있습니다. 망막은 기포 해상도 후에도 정상 기능을 유지합니다.
9개의 조명 강도에서 스코토픽 막대 매개 응답에 대한 파형은 0.3 마이크로리터, 0.5 마이크로리터 및 1 마이크로리터 주입에 대한 사전 주입 및 주입 후 4주에 대해 표시됩니다. 이 기술을 완전히 익히면 한쪽 눈당 10분에서 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시작하기 전에 눈의 건강을 평가하는 것이 중요합니다.
각막 또는 수정체 혼탁이 있는 눈 또는 이 절차가 매우 어려운 깊은 눈은 제외합니다. 이 절차에 따라 주사의 품질을 평가하기 위해 OCT 및 안저 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
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개요
이 연구는 마우스의 망막하 공간에 치료제를 전달하기 위한 새로운 망막하 주사 기술을 설명합니다. 이 방법은 망막 구조와 기능의 빠른 회복을 보장하면서 부수적인 손상을 최소화하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 시력 과학
- 안과학
배경
- 망막하 주사는 치료 제공에 일반적으로 사용됩니다.
- 기존 방법은 부수적인 손상과 더 긴 회복 시간을 초래할 수 있습니다.
- 이 연구는 개선된 결과를 가진 대체 기술을 제시합니다.
연구 목적
- 망막하 주사를 위한 새로운 기술을 설명합니다.
- 망막 퇴행에 대한 치료 중재의 효과를 평가합니다.
- 바이러스 벡터 및 약리학적 제제의 전달을 촉진합니다.
사용된 방법
- 마우스의 수염을 잘라 시각화를 위해 마취합니다.
- 순환 수 패드를 사용하여 체온을 섭씨 37도로 유지합니다.
- 2.5% 페닐에프린 안약으로 동공을 확장합니다.
- 훈련된 기술자가 절차를 시연합니다.
주요 결과
- 이 기술은 물질 전달에 높은 효율성을 허용합니다.
- 망막 구조에 대한 최소한의 손상이 관찰됩니다.
- 망막 기능의 빠른 회복이 이루어집니다.
결론
- 이 새로운 망막하 주사 기술은 연구에 효과적입니다.
- 안과 치료 전략을 발전시키는 데 약속을 가지고 있습니다.
- 추가 연구는 망막 퇴행에 대한 응용을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This transcleral posterior subretinal injection method addresses a key challenge in preclinical ophthalmology: delivering therapeutic agents to the subretinal space while minimizing surgical trauma and preserving retinal integrity. By avoiding retinal penetration and vitreous disruption, the technique enables more accurate assessment of drug efficacy in rodent models of retinal degeneration. This supports de-risking of target validation and lead identification efforts in vision science pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise delivery of viral vectors, pharmacological agents, or stem cells to the subretinal space for functional target validation in retinal disease models.
- Operational Value: Minimizes confounding tissue damage, allowing clearer interpretation of therapeutic effects on photoreceptors and RPE.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces consistent, reproducible subretinal delivery with quantifiable outcomes via OCT and fundus imaging.
- Operational Value: Standardizes injection depth and location (0.5 mm from optic nerve), reducing variability across experiments and operators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal assessment of retinal structure and function due to rapid retinal reattachment and minimal chronic scarring.
- Operational Value: Compatible with postoperative monitoring using OCT, fundus imaging, and ERG to evaluate therapeutic durability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling reliable delivery of candidate therapeutics to the subretinal space, a critical step before efficacy testing in degenerative retinal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing targeted delivery of agents to interrogate retinal pathways and cell-specific functions.
- Screening: Enables standardized preparation of disease models for compound screening with minimal procedural failure.
- Analytics: Generates clear OCT- and fundus-based readouts to quantify retinal detachment resolution and functional recovery over time.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical validation by preserving retinal architecture for accurate biomarker and functional assessments.
- Enterprise Reuse: Reusable across studies involving viral vectors, proteins, or cell-based therapies for retinal degeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing surgical artifacts that could mask or mimic therapeutic effects.
- Operational Value: Short procedure time (10–15 minutes per eye) and low failure rate improve throughput in preclinical studies.
- Strategic Value: Reduces biological noise in efficacy data, supporting better go/no-go decisions in target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by providing cleaner preclinical data on mechanism and durability.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise and fine motor control for sclerotomy and needle placement.
- Dependent on specialized instrumentation including Vannas scissors, 22.5° ophthalmic blade, and 33-gauge beveled needle.
- Necessitates standardized postoperative care including antibiotics, analgesics, and monitoring for retinal reattachment.
- Adaptation to other model systems may require adjustment of incision size and needle angle based on ocular anatomy.
- Limited to posterior segment access; not suitable for anterior segment or intravitreal delivery applications.
