Name: 망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법를 통해를 Transcleral 후방 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 쥐 망막하 공간에 치료제를 전달하는 새로운 경막외 주사 기법을 통해 안과학 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 망막 퇴행성 질환 치료 전략 개발에 활용될 수 있습니다.

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우리는 Harold and Pauline Price 안과 의장과 Jules Stein Eye Institute의 MBG, SN에 대한 NEI Core 보조금(EY00331-43)의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Sakaria 가족이 SN과 MGB에 기부한 후한 기부금과 안과에 대한 실명 방지 연구(Research to Prevent Blindness)의 무제한 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 망막하 주사의 초기 OCT 이미지를 입수해 주신 Berkeley School of Optometry의 Charlotte Yiyi Wang에게 감사드립니다.

동물 : 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학 (UCLA)에서 자란 야생 형 C57BL / 6J 마우스. 17주 세, 남성과 여성의 쥐를 포함 - 모든 동물 (11)이었다. 모든 마우스 그룹 수납 임의의 사료 및 물과 함께 12시 12분 / 암주기에서 유지시켰다. 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 UCLA 및 비전 연구 협회와 안과 정책의 제도적 지침에 따라 수행되었다. 참고 : 모든 약물과 주사 에이전트가 미국 약전 (USP) 등급이다. 1. 수술 준비 <ol><li> 식염수 믹스 100 ㎎ / ㎏ 케타민 8 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스가 더 발가락 핀치 또는 각막 터치 반사가 없도록 깊이로 마취를 관리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 순환 물 패드와 37.0 ° C에서 체온을 유지한다. </li><li> 2.5 % 페닐에 눈 D와 학생들을 팽창ROPS 및 트림 수염이 시각화를 용이하게한다. 수염 따라서, 위스커가 눈에 명확 블록 액세스하지 위스커의베이스 부분만을 제거한다 트리밍 마우스 상당한 감각 입력을 제공한다. 우리의 경험에 의하면, 마우스는이 절차 후 정상 회복을 보여줍니다. 메틸 눈을 적용하면 건조를 방지하고 마취 유도 과도 백내장 (13)을 최소화하기 위해 삭제합니다. </li><li> 수술 (즉, betadine와 에탄올 또는 뜨거운 구슬) 이전에 악기를 소독. </li><li> 시각화를 수행 할 경우 무균 환경에서 희석 형광을 (0.01 % 0.9 % 식염수를 사용하여) 준비 (즉, 바이오 안전성 캐비닛) (아래 섹션 3 참조). </li></ol> 2. 사출 현장 준비 <ol><li> 적절한 주입 부피 (예를 들어, 0.3-1.0 μL) 주사기 (예를 들어, 5 μL 주사기)을 준비한다. </li><li> 눈이 디에서 명확하게 볼 위로 향하게되도록 마우스를 배치현미경을 ssecting. </li><li> 부드럽게 뾰족한 집게로 시간적 결막을 꼬집어. 곡선 Vannas 가위를 사용하여 약 90 도의 원주 절개를합니다. </li><li> 기본 장부의 캡슐 단계를 반복 2.3. </li><li> 비강 지구를 회전하면서 뾰족한 집게로 주변의 결합 조직을 절제. 시신경 약 0.5 mm 일시 주사 부위를 향해 작동한다. 복고풍 궤도 동을 방해하지 않도록 세심한주의를 사용합니다. </li></ol> 3. 공막과 망막 주입 참고 :이 절차를 배우면서 0.9 %의 식염수에 0.01 %의 형광의 주입이 시각화 지원하기 위해 사용하는 것이 좋습니다. 형광의 지형 분포를 효과적으로 안저 화상 (아래 섹션 4 참조)과 함께 설명 될 수있다. <ol><li> 부드럽게 22.5도 안과 블레이드와 아이 컵을 긁는하여 주사 부위에 작은 공막 절개를합니다. 이 절개 수오단, 바늘 끝이 공막을 통과 할 수 있도록 충분히 커야 신분증. </li><li> 5 각도 경 사진 33 G 바늘 (삽입 -. 경사가 직면하고 망막에 각도 병렬로 공막에 10 °를 (원하는 볼륨을 주사 예를 들어, 학습 목적으로 0.01 % 플루 오레 0.3 ~ 1.0 μL). 참고 : 철저하게 각 주입하기 전에 적당한 용매 및 탈 이온수의 연속적인 세척과 청소하여 주사기의 불임을 유지한다. </li><li> 바늘을 이동하지 않고, 심지어 압력으로 천천히 플런저 (이상 ~ 3 초) 우울. 주 : 바늘이 망막 하 공간에있을 때, 상기 플런저를 누르면서, 약간의 저항이 느껴질 것이다. 바늘 공막 또는 RPE를 관통하지 않는 경우 바늘이 망막, 높은 저항을 천공하는 경우 최소한의 저항이 더 없을 것이다. </li><li> 역류를 최소화하기 위해 바늘을 인출하기 전에 몇 초 동안 기다립니다. </li><li> 멸균 완충 식염수로 눈을 씻어 눈 시간을 보장다시 정상 위치로 회전 할있다. </li></ol> 및 OCT 안저 영상에 의한 망막 박리 4. 평가 <ol><li> 즉시 주사의 품질을 평가하기위한 주사 후 적절한 시간에 간섭 단층 촬영을 수행하는 망막 구조를 평가하는 데 필요한 포스트 분사를 가리킨다. 주의 : 유사한 연구에서의 OCT 사용의 예는 이전에 7,14을 설명 하였다. <ol><li> 조정 및 주사 부위를 대상으로 OCT의 이미지를 맞 춥니 다. 주사 부위는 중간 선 및 시신경 헤드 시간 0.5 mm이어야한다. 최적의 중심 이탈이 프레임 밖으로 경우에만 필요 여부로 반복합니다. </li></ol></li><li> 망막 박리를 시각화하고 엉 - 얼굴 안저 영상 7, 14과 주입 영역을 염색. 참고 :의 OCT 이미징 시스템을 사용할 수없는 경우, 연습 벡터와 형광 소량의 주입은 형광 angio을 수행하는 안저 카메라로 시각화 수 있습니다동일한 여기 파장을 사용하여 필터를 차단 그래피로. 하이퍼 형광의 지역화 된 영역은 혈관 아래에 표시되고 망막 하 공간이 제대로 대상으로하면 혈관이 선명하고 뚜렷한 경계를해야합니다. 사출에서 여과포의 가장자리는 하이포 형광에 하이퍼의 전환에 의해 경계가 될 것입니다. 여러 악기는 마우스이 기능을 제공한다; 여기에 사용 된 장비는 다른 14 설명한다. </li></ol> 5. 수술 후 케어 <ol><li> 주입 된 눈의 각막 표면에 트리플 항생제 안과 크림의 두꺼운 코트를 적용합니다. </li><li> 복구를위한 깨끗한 독방 새장에 마우스를 놓습니다. 그들은 완전히 회복 될 때까지 수술을받은 마우스를 함께 사용하지 마십시오. </li><li> 마취 회복 중에 호흡과 온도를 모니터링합니다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지할 수있을 때까지 동물을 모니터링합니다. </li><li> 추가 적절한 수술 후 모니터링을 수행및 수술후 통증 관리 카프로 펜의 서브 피하 주사 (5 ㎎ / ㎏)을 포함한 치료. </li></ol> 전위도에 의해 망막 기능의 6 평가 (ERG) <ol><li> ERG 분석 미리 주입을 수행하고 적절한 시간에 망막 기능을 평가하기 위해 필요에 따라 포스트 분사. 주사는 망막 하 공간에 만들어진 경우, 망막 박리는 72 시간 내에 해결됩니다. <ol><li> 이전에 14,15을 설명한대로 전과 주입 후 망막 기능을 평가하기 위해 표준 ERG 기술을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 7. 3D 재건 및 여과포 볼륨 정량화 참고 : 고 대비가보기의 프레임 내에서 전체 분리를 포괄와 10월 스캔이 사용하기에 최적입니다. ImageJ에 / 피지 17,18 및 Imaris이 사용되었지만, 다른 소프트웨어를 사용할 수있다. <ol><li> 관심의 B 검사를 내보내기 ImageJ에 / 피지 및 작물 (이미지&gt; 자르기)은 OCT (SC)의 부분에 가져 오기는 사각형 선택 도구를 사용하여 모델링된다. <ol><li> 콘트라스트 조정 (이미지&gt;&gt; 밝기 / 명암 대비를 조정)과 선으로 두 부분을 연결하여 누락 된 경계를 묘사. </li><li> 광 수용체 층에 RPE에 걸쳐있는 줄 도구 (들고 이동)과 직선을 그립니다. 측정 (측정&gt; 분석) 라인의 길이는 단계 7.8에 대한 최대 박리의 크기를 얻을 수있다. </li></ol></li><li> 가져 오기 &quot;회색 RGB&quot;플러그인 및 MATLAB 컴파일러 런타임을 사용해서 (재료의 표 참조) 3 차원 재구성 소프트웨어 프레임립니다. </li><li> OCT를 스캔 (X, Y, Z)에서 교정 매개 변수를 사용하여 (이미지 속성 아래) 복셀 크기를 설정합니다. </li><li> 네 번째 채널을 만들기 위해, 각 채널에 동일한 가중치와 (이미지 속성 아래) &quot;RGB 회색에&quot;플러그인을 실행합니다. 원래 빨강 - 녹색 - 파랑 채널을 삭제합니다. </li><li> 콘트라스트 변화를 이용하여 그레이 채널을 전환. 저장 이미지. </li><li> 의 &quot;추가를 클릭합니다EW 표면의 &quot;3D-보기 탭에서 버튼을 표면을 만드는 가이드 4 단계 과정을 시작합니다. <ol><li> 표면 레벨 세부 사항 (4 단계의 1)를 설정합니다. 참고 : 우리의 경험에 12.0-8.0 가장 유효 범위이었다. </li><li> (배경 선택에 따라) 최대 영역 크기 7.1.2에서 측정 된 최대 박리의 크기보다 약간 이하로 설정합니다. 회색 채널 반전 (4 단계의 2) 표면을 작성하고 취소. </li><li> 망막의 외부 음의 공간과 분리의 표면이 접촉 (4의 3 단계)로 제공하지 않도록 최대 값으로 임계 값을 설정합니다. </li><li> 복셀의 개수는 필터의 종류를 설정하고 크기별로 분리 사이트 네가티브 공간을 격리. 표면 (4 단계 4)를 완료합니다. 참고 : 분리 표면의 볼륨이 통계 탭에서 볼륨 아래에 있습니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자 중 누구도 상업적 공개를 하지 않았습니다.

망막 주사 바이러스 벡터의 전달을위한 선택의 방법이며, 감광체와 기초 연구 및 임상 치료 모두에서 RPE를 조작하기위한 세포 유래 줄기 치료. 환자에서 망막 주사는 일반적으로 직접 시각화 바늘함으로써, 유리체에서 전방 공막과 망막의 뒤쪽 코어 유리체 절제술 및 침투를 수행하고 있습니다. 눈 수정체 이미 않는 백내장 형성 일찍 발생하는 가장 절제술 절차와 마찬가지로 일반적이다. 마우스에서, 망막 하 주사 전통적 유리체 포착 전체로 이어질 수 공막 망막 앞쪽 자주 눈의 후방 공간의 대부분을 차지하는 렌즈 모두 칼자국과 관련된 방법 및 transretinal 침투 완료 망막 박리. 마우스에서의 사후 - 접근 기술은 원치 않는 결과를 줄이고 EF를 해석 할 수있는 능력을 향상하여의도 된 조작의 fects. 여기에보고 된 망막 주입 기술의 장점은 최소한의 구조적 또는 기능적 효과 감소 부수적 인 피해를 포함 (예를 들어, 렌즈 칼자국을내는, 유리체 누출 또는 염증 흐리...

망막 주사는 광 수용체 및 기본 RPE 1, 2에 미치는 영향을 연구하기 위해 쥐의 망막에 세포 및 바이러스 에이전트를 전달하는 주요 수단이다. 마우스에서 대부분의 망막 주입 프로토콜은 transcorneal 또는 적도에 transcleral 주사 부위 앞쪽 (그림 1)를 사용합니다. 이 방법은 새김 눈과 렌즈의 결과 혼탁의 감각 신경 망막과 홍채, 망막 출혈, 망막 박리 실질적이고 지속적인 망막 부종 3-9의 유리체, 침투의 무결성의 중단을 포함하는 고유의 담보가 손상 될 수 있습니다. 실험 조작은 치료 적 개입 3,7,10,11의 효과를 평가하기 위해 이러한 효과를 극복해야한다. 이 연구는, 이러한 합병증을 피할 후방 transcleral 주입 방법의 상세한 설명 및 유효성을 제공 외상을 최소화 서브 타겟팅 높은 성공률을 갖는다망막 공간. 쥐의 망막 하 공간을 대상으로 주사 종종 수행하는 것이 매우 어렵고, 대부분의 연구자들은 벡터가 잘못된 위치로 전달하거나 상당한 망막 손상은 전체 망막 박리 (6), 예를 들어 존재하는 시도 실패 고주파 발생. 때문에 사출 합병증 분석에서 제외 눈의 수는 일반적으로 마우스 연구에서보고되지 않고, 우리의 경험에서 다른 연구자와 논의 실패 주사의 수가 50 %만큼 높을 수 및 경험에 따라 달라질 수 있으며 주사를 수행하는 연구자의 기능을 제공합니다. 주입의 성공은 일반적으로 직접 안저 화상 및 / 또는 광 결맞음 단층 촬영 7,9에 의해 평가된다. 생쥐의 망막 주사에 대한 높은 성공률과 쉽게 습득 방법은 실험을 촉진하고 레의 전임상 연구의 비용을 줄일 수 있습니다미국에서 실명의 주요 원인은 망막 질환에 대한 atments. 후방은 여기에 설명 transcleral 망막 주사 기술은 임상 및 임상 프로토콜 9,12-에서 적응이다. 주입 된 쥐에서 수행 된 비 침습적 진단 평가는 온화하고 매우 지역화 피해를 입증하고 추가 담보 렌즈, 망막과 망막 색소 상피 손상이 부족하다. 따라서 이러한 연구와 연관된 비용을 감소, - (90 % 이상 80) 또한, 비교적 적은 연습, 실험자 높은 성공률 이러한 결과를 얻을 수있다. 이 절차는 전임상 연구에서 감광체 및 / 또는 행 RPE 세포 바이러스 또는 약물 치료 적 개입을 제공하도록 쉽게 실험 간섭을 평가할 수있다.

<table><tbody><tr><td>해밀턴 모델 62 RN SYR</td><td>해밀턴</td><td>87942</td><td>주사기 x 1</td></tr><tr><td>해밀턴 바늘 33G, 1.0", 20도, 포인트 3 (304 스테인레스 스틸)</td><td>해밀턴</td><td>7803-05</td><td>바늘 x 6</td></tr><tr><td>반나 곡선 가위</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5mm 블레이드</td></tr><tr><td>22.5도 미세 수술 나이프</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>케타젝트&nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>케타민</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% 식염수 USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>항생제 연고</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>안과용</td></tr><tr><td>물 순환 펌프</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/펌프&nbsp;</td><td>전화번호: 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-시리즈</td><td>상업용</td></tr><tr><td>안저 카메라</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 유형 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 페닐에프린</td><td>파라곤 BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>안과</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>비트플레인</td><td></td><td>버전 8.1.2</td></tr><tr><td>이미지J</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&nbsp; 2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>메틸셀룰로오스</td></tr><tr><td>점안액(린스)</td><td>Bausch & </td><td></td> 롬 <td>식염수</td></tr><tr><td>용액 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>현미경</td></tr><tr><td>광원</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>광원</td></tr></tbody></table>

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법<i&gt;를 통해</i&gt;를 transcleral 후방 접근

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

망막 주사 성공적으로 직접 감광체로 노광 및 망막 색소 상피 (RPE)를 갖는 interphotoreceptor / 망막 구획 단백질의 치료 적 개입 바이러스제, 세포를 제공하는 사람과 설치류에서 모두 사용되었다. 플라스 미노 겐의 망막 주사뿐만 아니라 최근 전임상 및 임상 시험 고급 망막 질환과 개인에게 바이러스 성 벡터와 줄기 세포를 제공하는 안전 및 / 또는 효능을 증명하고있다. 망막 질환, 특히 유전 적 망막 이영양증의 마우스 모델은 이러한 치료를 테스트하기 위해 필수적이다. 설치류에서 가장 흔한 주입 절차 망막 전방 접근 작은 transcorneal transcleral 또는 절개를 사용하는 것이다. 이 방법, 주사 바늘은 기본 RPE 및 삽입에 영향을주지 감각 신경 망막을 관통 쉽게 닉 렌즈, 렌즈 혼탁 및 비 침습적 imagi의 손상을 유발NG. transcleral를 통해 망막 하 공간에 액세스, 후방 접근 방식은 이러한 문제를 피할 수 : 바늘은 망막 침투하지 않고, 시신경에서 약 0.5 mm 공막을 통과하고 유리체을 방해 방지 할 수 있습니다. 담보 손상 초점 공막 및 과도, 장액 망막 박리의 효과와 관련이 제한됩니다. 이 방법의 단순성은 안구 손상을 최소화 망막 재 부착 빠른 복구를 보장하고, 낮은 실패율을 갖는다. 망막과 망막 색소 상피에 최소한의 손상 효과의 명확한 평가와 치료제 자신의 직접적인 영향 수 있습니다. 이 원고는, 바이러스 벡터, 약리 에이전트를 대상으로 높은 효능, 최소한의 손상과 빠른 복구와 쥐의 망막 하 공간으로 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 줄기 세포에 사용할 수있는 새로운 망막 주입 기술에 대해 설명합니다.

접근 transcleral 망막 주사는 0.3 μL (N = 18), 0.5 μL (N = 8)과 0.01 %의 형광의 1.0 μL (N = 5)의 주사로 16 야생형 생쥐에서 31 건강한 눈을 수행 하였다 후방. 한쪽 눈으로 인해 구조 및 기능 분석을 방지 미리 기존의 각막 혼탁에 주입에서 제외 하였다. 모든 주입 눈이 보고서에 포함되어 있습니다. 의도하지 않은 망막 박리는 유리체에 감각 신경 망막 또는 누설의 천공은 검출되지 않았다하거나 관찰하는 눈에서 렌즈 칼자국을내는, 염증 반응, 포도막염, 또는 수술 후 감염의 증거였다. 망막 구조는 사전 주입 10 분 후 분사 간섭 단층 촬영하여 사주 후 분사 (도 2 및 3)을 평가 하였다. 9- 포인트 그리드, 최대 박리의 중심 위에 놓인 중심점, 10 분에 넣었다얼굴 스캔<...

망막하 주사는 단백질 및 바이러스 벡터와 같은 큰 치료제를 광수용체와 망막 색소 상피에 전달하는 가장 일반적인 기술입니다. 최소한의 부수적 손상과 빠른 회복 시간으로 망막하 공간을 성공적으로 표적으로 삼는 마우스의 대체 방법이 여기에 설명되어 있습니다.

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법<i&gt;를 통해</i&gt;를 Transcleral 후방 접근

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

본 연구의 전반적인 목표는 마우스의 망막 하 공간에 바이러스 벡터, 약물 또는 유도만능줄기세포를 전달하는 데 사용할 수 있는 새로운 망막 하 주입 기술을 설명하는 것입니다. 이 방법은 망막 변성에 대한 새로운 치료적 개입의 효능 평가와 같이 시각 과학 및 안과학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 효율성과 최소한의 손상, 그리고 망막 구조 및 기능의 빠른 회복을 통해 물질을 망막 하 공간으로 전달할 수 있다는 점입니다.본 절차의 시연은 저희 실험실의 테크니션인 Sachin P가 진행하겠습니다. 먼저, 시각화를 용이하게 하기 위해 마취된 마우스의 수염을 다듬고, 순환식 워터 패드를 사용하여 동물의 체온을 37 °C로 유지합니다. 그다음, 2.5% phenylephrine 점안액을 사용하여 동물의 동공을 확장시킵니다.그 다음, 건조를 방지하고 마취로 인한 일시적 백내장을 최소화하기 위해 메틸셀룰로오스 점안액을 투여합니다. 수술 전 기구를 멸균합니다. 이후, 생물안전작업대(biosafety cabinet)에서 희석된 플루오레세인(fluorescein)을 준비합니다.주사기에 적절한 양의 fluorescein을 채웁니다. 다음으로, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 동물이 깊게 마취되었는지 확인하고, 주사할 눈이 위를 향하며 해부 현미경으로 명확하게 보이도록 마우스를 배치합니다. 미세 팁 핀셋으로 측면 결막을 부드럽게 잡습니다.그 다음, 곡선형 Vannas 가위를 사용하여 약 90도 정도로 원주형 절개를 합니다. 하부의 Tenon낭에서도 동일한 절차를 반복합니다. 이후 안구를 비측으로 회전시키면서 미세 팁 핀셋으로 주변 결합 조직을 절제합니다.시신경에서 약 0.5 mm 떨어진 주입 부위 쪽으로 진행하며, 안와 뒤 정맥동(retro-orbital sinus)이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. 중요한 단계는 주입 부위를 노출시키는 것이며, 이때 안구 자체나 주변 구조물, 특히 안와 혈낭(orbital blood sac)이 손상되지 않도록 안구를 회전시켜야 합니다. 이 과정에서 22.5도 안과용 메스로 안구를 가볍게 긁어 주입 부위의 공막에 작은 절개를 만듭니다.이 절개창은 바늘 끝이 공막을 통과할 수 있을 정도의 크기로만 만들어야 합니다. 다음으로, 베벨(bevel)이 망막과 평행하게 향하도록 각도를 조절하여 33 gauge 바늘을 공막 절개 부위에 삽입합니다. 플런저를 일정한 압력으로 천천히 눌러 원하는 양의 0.01% fluorescein을 주입합니다.바늘이 망막하 공간에 위치하면 플런저를 누를 때 약간의 저항이 느껴진다는 점에 유의하십시오. 바늘이 망막을 관통하면 저항이 느껴지지 않으며, 바늘이 공막이나 망막색소상피(RPE)를 뚫지 못했을 경우에는 강한 저항이 느껴집니다. 또 다른 중요한 단계는 망막하 공간을 표적으로 하는 주입입니다.이 과정은 신경감각망막을 관통하여 유리체강까지 도달하지 않도록 수행해야 합니다. 역류를 최소화하기 위해 바늘을 뽑기 전 몇 초간 기다리십시오. 그 후, 멸균 식염수로 눈을 헹구고 눈이 정상 위치로 다시 회전했는지 확인하십시오.그런 다음, 주사한 눈의 각막 표면에 트리플 항생제 안연고를 두껍게 도포합니다. 그 후, 회복을 위해 마우스를 깨끗한 단독 케이지에 넣습니다. 마취 회복 중에 호흡과 체온을 모니터링하고, 흉식 자세(sternal recumbency)를 유지할 수 있는지 확인합니다.수술 후 통증 관리를 위해 carprofen 피하 주사를 포함하여 적절한 추가 수술 후 모니터링 및 치료를 수행합니다. 다음은 주사 부위의 돔 모양 수포를 3D로 재구성한 모습입니다. 이후 망막 박리의 범위와 경계를 나타내기 위해 돔 모양 수포를 진한 흰색으로 채웁니다.OCT의 망막 횡단면은 흰색으로 나타나며, RPE 및 광수용체 수준의 액체 충전 공간은 검은색으로 나타납니다. 또한 본 그림에서는 망막 박리가 최대인 지점에서 주사 전, 주사 후 10분, 그리고 주사 후 4주 차에 촬영한 대표적인 OCTB 스캔 영상이 제시되어 있습니다. 이 이미지는 0.3 µL 주입으로 인해 형성된 편평한 수포(bleb)의 생성 및 해소 과정을 보여줍니다.이 이미지는 0.5 µL 주입으로 인한 돔 모양 수포(bleb)의 형성 및 소실 과정을 보여주며, 반면 이 이미지는 1 µL 주입으로 인한 돔 모양 수포의 형성 및 소실 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 여기 주입 부위에 발생한 심각한 맥락막 흉터와 망막 박층화의 예시가 있습니다. 망막은 수포가 소실된 후 정상 기능을 유지합니다.9가지 조도 조건에서 0.3 µL, 0.5 µL 및 1 µL 주입 시의 주입 전과 주입 4주 후의 암소 간상세포 매개 반응 파형을 나타내었습니다. 이 기술에 숙달되면 안구당 10분에서 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때는 시작 전 안구의 건강 상태를 평가하는 것이 중요합니다.각막 또는 수정체 혼탁이 있거나, 본 절차를 수행하기 매우 어려운 함몰안의 경우에는 제외하십시오. 본 절차 이후, 주입 품질을 평가하기 위해 OCT 및 안저 영상 촬영과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

출처: Park, SW, et al. 생쥐 망막 색소 상피에서 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터의 윤부 접근법-망막하 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 마우스 모델에서 망막 색소 상피(RPE)에 바이러스 벡터를 망막하 주입하는 방법을 설명합니다. 마취 및 눈 준비부터 정확한 렌티바이러스 벡터 전달에 이르기까지 RPE에서 유전자 통합 및 발현을 보장하는 절차를 자세히 설명합니다.

마우스 모델에서 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막하 주사

출처: Parikh, S., et al. 경공막 후방 접근법을 통해 망막하 공간에 접근하기 위한 대안적이고 검증된 주사 방법. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 형광 염료를 마우스의 망막하 공간으로 전달하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 마우스를 마취하고, 눈을 준비하고, 망막하 공간에 접근하기 위해 정밀한 절개를 하고, 염료를 주입하여 제어된 망막 박리를 만드는 과정이 포함됩니다. 이 기술을 사용하면 염료를 표적으로 전달할 수 있어 망막 구조의 상세한 이미징 및 분석이 가능합니다.

마우스의 망막하 공간으로 형광 염료 전달

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

망막하 주사는 쥐의 눈에 있는 망막 색소 상피에 효과적인 유전자 전달을 위한 수술 기술입니다.  여기에서는 실험용 마우스에서 망막 색소 상피에 바이러스 벡터를 망막하 주입하는 쉽고 복제 가능한 방법을 설명합니다.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

이 프로토콜은 중앙 각막 절개와 전방으로의 긴 터널을 사용하여 쥐에서 안내 주사 기술을 설명합니다. 이 주입 방법은 부주의한 조직 손상을 유발할 위험을 최소화하여 정밀도와 재현성을 향상시킵니다.

부작용 위험이 낮은 쥐에 대한 카메라내 주사

이 논문은 쥐의 망막하 주사 방법을 설명하며, 주사 부위와 망막 박리 부위를 모두 제어하기 위해 수술 중 시각화를 활용합니다.

쥐의 망막하 주사 및 망막 박리에 대한 수술 중 시각화

이 연구는 성체 쥐의 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 방법론을 제시합니다. 또한, 성체 쥐의 시신경과 망막을 하향식으로 일괄적으로 수집하기 위해 독특한 조직 회수 방법이 도입되었습니다.

성체 쥐의 안구 치료 전달 및 고급 조직 회수(Ocular Therapeutic Delivery and Advanced Tissue Retrieval in adult rats)

망막하 주사는 광수용체 및 RPE 질환에 대한 치료제의 전임상 개발에 없어서는 안 될 기술입니다. 우리는 수술 중 성공률을 향상시키고 망막 손상을 최소화하는 마우스에서 최적화된 경공막 망막하 주사 기술을 설명합니다.

마우스에서 최적화된 최소 침습 경공막 망막하 주사 기술

학습하세요 쥐 망막하 공간에 치료제를 전달하는 새로운 경막외 주사 기법을 통해 안과학 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 망막 퇴행성 질환 치료 전략 개발에 활용될 수 있습니다.

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법

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