선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기 초파리 애벌레 크롤링 동작

이 절차의 전반적인 목표는 신경 회로의 발달을 연구하기 위해 선형 아가로스 채널에서 기어 다니는 유충 단계의 초파리를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 운동 패턴을 생성하는 신경 코드를 이해하고 운동 제어를 위해 신경 회로의 범위를 지정하는 주요 유전 및 세포 과정을 식별하는 것과 같은 신경 행동학 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유충 행동 레퍼토리를 제한하여 연구자가 단일 다중 패턴을 자세히 연구할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Zarion Marshall입니다. 먼저 유충의 건강을 평가하는 것이 중요합니다. 기록하기 3-4일 전에 성인 케이지의 수집 플레이트를 교체하십시오.

매일 그리고 하루 중 같은 시간에 이 작업을 진행하십시오. 접시에 있는 알과 새로 부화한 유충을 세십시오. 예상되는 알의 수는 500개에서 2, 000개 사이입니다.

필요에 따라 케이지에 있는 성인의 수를 조정합니다. 우리는 유충이 건강한지 확인하기 위해 24시간 후에 플레이트를 검사합니다. 대부분의 알은 유충으로 부화했어야 했고, 유충은 효모 페이스트 속으로 기어 들어갔어야 했습니다.

건강이 좋지 않다는 징후로는 부화하지 않은 알이 많거나, 효모 페이스트에서 멀리 떨어진 유충의 시체가 죽어있고, 복부에 면역 반응의 지표인 비정상적으로 어두운 반점이 있는 유충이 있습니다. 유충이 건강하지 않은 것처럼 보이면 갓 준비한 접시를 사용하여 케이지를 변경하고 성인 유전자형을 확인하십시오. 실험을 위해 1일에서 2일 된 플레이트에서 새로 부화한 두 번째 instar 유충을 수집합니다.

이러한 모든 단계를 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 선형 채널 PDMS 주조 금형이 있어야 합니다. 이소프로필 알코올로 주조 금형을 청소하십시오.

건조되면 곰팡이를 10cm 뚜껑이나 유사한 용기에 넣으십시오. 그런 다음 금형에 3% 아가로스를 채우고 섭씨 55도로 냉각합니다. 아가로스를 조심스럽게 부어 금형에 기포가 갇히지 않도록 합니다.

곰팡이는 아가로스로 덮여 있어야 합니다. 응고되면 금형에서 아가로스 채널을 제거합니다. 디스크 모양의 채널 가장자리를 다듬은 다음 채널을 물에 담그십시오.

최대 7일 동안 섭씨 4도의 물에서 보관할 수 있습니다. 채널을 사용하기 전에 실온으로 데우십시오. 유충의 너비와 일치하는 채널을 선택합니다.

채널의 너비는 100-300미크론이며 깊이는 모두 150미크론입니다. 그런 다음 깨끗한 면도날을 사용하여 준비된 디스크에서 단일 채널을 자릅니다. 집게를 사용하여 채널을 적절한 크기의 유리 덮개로 옮기고 홈이 있는 면이 위로 향하게 하여 미끄러지거나 밉니다.

다음으로, 가는 집게를 사용하여 유충을 쥐어짜지 않고 부드럽게 집습니다. 끝이 가늘게 된 붓도 잘 작동합니다. 쥐어짜면 구르거나 구부리는 것과 같은 통증 반사가 채널에서 유충의 행동을 지배할 수 있습니다.

이제 유충을 물에 잠깐 담가 씻은 다음 절단 채널에 넣고 부드럽게 제자리에 고정합니다. 채널에 들어가면 관심 구조를 쉽게 이미지화할 수 있도록 유충의 방향을 조정합니다. 그런 다음 채널의 양쪽 끝에 하나 또는 두 방울의 물을 떨어뜨려 채널을 물로 채웁니다.

기포가 갇히면 채널 측면을 부드럽게 들어 올려 제거하십시오. 유충의 방향을 추가로 조정하려면 채널을 부드럽게 살짝 밀어 유충을 굴립니다. 이제 유충을 이미지화할 준비가 되었습니다.

선형 채널의 유충은 리드미컬한 크롤링의 지속적인 시합을 수행합니다. 형광 프로브는 쉽게 검사할 수 있습니다. 예를 들어, GAL4 드라이버의 뉴런에서 GFP를 발현하는 유충은 크롤링 주기 동안 신경삭에서 나오는 형광 강도의 동적 변화를 보여줍니다.

근육 수축의 파동이 신체 축을 따라 통과함에 따라 중추신경계는 유충의 머리와 꼬리와 거의 동시에 앞으로 움직이고, 중추신경계는 초점면 안팎으로 움직여 신경삭의 형광을 변화시킵니다. 형광의 변화는 3 개의 유충에 대한 3 개의 크롤링 보폭에서 정량화되었습니다. 보폭 주기에 걸친 신경삭 형광의 역학은 표현형에 사용할 수 있는 재현 가능한 패턴을 따랐습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 행동을 위해 유충을 수집하고, 아가로스 채널을 준비하고, 유충을 채널에 로드하여 선형 크롤링 동작을 시각화하는 방법을 이해해야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 유충을 부드럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다.