Name: Hypoparathyroid 마우스를 만드는 두 기술 : 부갑상선 GFP 땀샘과 디프테리아 독소 매개 부갑상선 절제술을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 생취득성 저부갑상선증 마우스 모델을 만드는 두 가지 방법을. GFP 형광 유도 수술과 디프테리아 독소 매개 세포 특이적 제거 기법을 통해 갑상선 기능을 보존하면서 부갑상선을 정밀하게 제거하는 방법을 배우세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

국립 보건원에 의해 지원되었다이 작품은 구강 질환 열기 자금 SKLOD2015OF01 (RB)의 R01 - DK100584 및 중국 국가 중점 실험실을 부여합니다. 우리는 도움을 Wenping 조, Tadatoshi 사토, 그리고 켈리 Lauter 감사합니다.

이 연구는 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시작하기 전에이 동물 실험에 대한 적절한 기관의 승인을 얻습니다. 일부 기술은 지역 IACUC 요구 사항에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 1. GFP - PTX 마우스 <ol><li> 또한 상대에 대한 이전 십주 - 8시 PTHcre + 마우스 및 로사 - mTmG 마우스를 얻습니다. </li><li> C57BL / 6 배경으로 마우스를 얻기 위해 6 세대 C57BL / 6 마우스와 (FVB 배경 129 혼합)를 PTHcre + 마우스를 교잡. </li><li> Inbreed PTHcre + 생쥐 PTHcre + / + 마우스 (17)를 얻었다. 참고 : 유전자형을 수행 꼬리의 끝에서 DNA를 추출하여 PCR을 위해 그것을 사용합니다. 다음과 같이 PCR 프라이머는 이형 접합 및 PTHcre 형질 전환 유전자의 동형 접합체를 확인하십시오 : 정방향 프라이머 A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA을, 프라이머 A를 역 &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA을, F를orward 프라이머 B는 CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG는 프라이머 B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17 역. </li><li> 로사 - mTmG 마우스 (18)와 크로스 PTHcre + / + 마우스 16. 경우 4 주 오래 mTmG 새끼, PTHcre을 유아. </li><li> 0.6 밀리그램 / g의 체중에 tribromoethanol의 IP 주입 (AVERTIN)에 의해 mTmG 마우스, 또는 케타민 / 자일 라진과 같은 다른 에이전트 10 주 이전 PTHcre - 8 마취. 승인 된 프로토콜에 따라 수술 후 48 시간 동안 진통으로 부 프레 노르 핀 0.1 ㎎ / ㎏ 사우스 캐롤라이나 모든 12 시간을 사용합니다. 발가락 핀치 철수 반사 또는 다른 방법으로 마취의 적절한 깊이를 확인합니다. 앙와위에서 동물을 놓습니다. </li><li> 확장 및 단일 에지 블레이드를 사용하여 피부를 도용하여 복부 목 영역을 준비합니다. 포비돈 요오드 살균 패드로 면도 피부를 소독. </li><li> 수술 부위의 오염을 감소시키고 멸균 마이크를 사용하여 무균 수술 드레이프 동물 커버수술에 대한 rosurgical 악기. </li><li> 수술 용 메스로 피부에 2cm 길이의 절개를 잘라. 근막을 해부과 곡선 톱니 모양의 집게와 무딘 절개에 의해 옆으로 침샘을 누릅니다. </li><li> 할로겐 빛과 4를 사용하여 해부 현미경 - 5 배 배율을 잘라 날카로운 집게 팁을 사용하여 paratracheal 근육을 분리하고 호흡 관을 폭로. </li><li> 다음 기관에있는 좌우 엽으로 갑상선을 확인합니다. </li><li> 형광등을 광원을 전환하고 두 녹색 형광 부갑상선을 시각화. 참고 : 일반적으로 두 개의 부갑상선은이나 갑상선의 표면 근처에 위치하고 있습니다,하지만 때때로, 그들은 멀리 떨어져 있습니다. </li><li> 조심스럽게 수술 집게와 가위를 사용하여 녹색 부갑상선을 제거합니다. 지혈을위한 멸균 거즈를 사용하여 조심스럽게 모든 녹색 조직이 제거되었는지 확인 기관을 따라 확인합니다. </리&gt; <li> 6-0 polyglactin에게 910 봉합사를 사용하여 중단 봉합하여 paratracheal 근육을 닫습니다. 6-0 polyglactin에게 910 봉합사를 사용 홀스 테드 봉합하여 피부 절개를 닫습니다. </li><li> 선택적 : 유체 교체를 위해 마우스에 10 μL / g 체중 통상 0.9 % 멸균 식염수를 주입한다. </li><li> 체온 복구를위한 따뜻한 인큐베이터 (37 ° C)에 별도의 케이지에 수술 후 동물을 놓습니다. 쥐가 깨어과 가로 누운 위치에되면, 케이지 바닥에 일부 젤라틴 음식 펠릿 차우와 물을 넣어. </li><li> 2 시간의 수술 후 관찰 기간 후, 동물 시설에 마우스를 반환하고 수술 후 관리를위한 지역의 요구 사항을 따르십시오. </li><li> 삼일 부갑상선 후, 10 μL 꼬리 혈액을 수득 및 혈액 가스 시스템 칼슘 ++ / 산도 분석기와 같은 분석을 사용하여 이온화 칼슘 ++ 혈액을 측정한다. 혈액의 성공적인 부갑상선 결과는 칼슘 ++ 같거나 가짜로 작동하는 죄수의 -2SD보다 낮은 이온화트롤 마우스 (N = 30의 실험에서 1.20 밀리몰 / L). </li></ol> 2. PTH는-CRE-IDTR 마우스 <ol><li> 상대에 대한 이전 십주 - 8에서 PTHcre +와 DTR은 FL / FL 마우스를 얻습니다. </li><li> C57BL / 6 배경으로 마우스를 얻기 위해 6 세대 C57BL / 6 마우스와 (FVB 배경 129 혼합)를 PTHcre 마우스를 교잡. </li><li> PTHcre + (C57BL / 6 배경) 마우스 PTHcre + / + 마우스 (17)를 얻을 수 Inbreed. 참고 : 마우스 꼬리 끝에서 DNA를 추출하여 PCR에 사용 된, 유전자형을 수행합니다. 유전자형 프라이머 : 정방향 프라이머 A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, &#39;앞으로 프라이머 B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG는, 프라이머 B 역 TCAGATCACACCACACAGCA&#39;GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT (17) 프라이머 A를 역. </li><li> DTR과 PTHcre + / + 마우스 (16) 메이트 FL / FL PTHcre-IDTR 마우스를 얻기 위해 마우스 19. </li><li> diphtheri을 희석하여 DT 솔루션을 준비0.5 μg의 / ml의 농도로 멸균 식염수 독소 분말. -80 ° C에서 살균 필터 및 저장 분취. </li><li> 주입 실험 10 주 PTHcre-IDTR 마우스 - (8)을 선택합니다. 실온에서 해동 DT 분취은 복강 5 μg의 / kg (10 μL / g) 동물의 체중에 DT 관리. 최대 효율 최소 독성, DT 투여는 3 일 간격 (17)이 주입의 전체에 대해 반복된다. </li><li> 삼일 두 번째 주사 후, 각 PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR - mTmG 마우스에서 10 μL 꼬리 혈액을 혈액 칼슘 ++ 혈액 가스 시스템 칼슘 ++ / 산도 분석기를 사용하여 측정한다. 참고 : 우리는 피와 마우스는 칼슘 차량 주입 제어 마우스 (N = 22)의 평균보다 2SD에 해당 hypoparathyroid 마우스와 같은 ++보다 낮은 1.18 밀리몰 / L를, 이온화 정의합니다. </li></ol>

<ol><li>Brandi, M. L., Brown, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandi%2C+ML+%22Hypoparathyroidism%22">Hypoparathyroidism</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>van Abel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+renal+Ca%282%2B%29+transport+proteins+by+parathyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone.</a> Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).</li>
<li>Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+intermittent+PTH%281-34%29+and+PTH%287-34%29+on+bone+microarchitecture+and+aortic+calcification+in+experimental+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure.</a> Bone. 43, 1022-1030 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Ortiz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+deficiency+reduces+circulating+levels+of+FGF23%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Liao, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+Fibroblast+Growth+Factor+23+and+Biochemical+and+Bone+Histomorphometric+Alterations+in+a+Chronic+Kidney+Disease+Rat+Model+Undergoing+Parathyroidectomy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy.</a> PloS one. 10, e0133278(2015).</li>
<li>Fox, J., Care, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+calcium+and+low+phosphorus+diets+on+the+intestinal+absorption+of+water+in+intact+and+parathyroidectomized+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs.</a> Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).</li>
<li>Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+parathyroidectomy+of+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Selective parathyroidectomy of the dog.</a> Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).</li>
<li>Can, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+allotransplantation+in+rabbits+without+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation.</a> Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).</li>
<li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice%5BTitle%5D)+AND+%22j+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li>
<li>CRIVER. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures">http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures</a> (2010).</li>
<li>Sakai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+development+in+immobilized+bone+is+suppressed+by+parathyroidectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Metab%22%5BJournal%5D)">Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice.</a> J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).</li>
<li>Miao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+abnormalities+in+Pth-null+mice+are+influenced+by+dietary+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium.</a> Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).</li>
<li>Gunther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+parathyroid+glands+reveals+another+source+of+parathyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone.</a> Nature. 406, 199-203 (2000).</li>
<li>Hough, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+calcium-sensing+receptor+mutation+in+the+mouse+is+associated+with+cataracts+and+ectopic+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).</li>
<li>Hannan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calcilytic+Agent+NPS+2143+Rectifies+Hypocalcemia+in+a+Mouse+Model+With+an+Activating+Calcium-Sensing+Receptor+%28CaSR%29+Mutation%3A+Relevance+to+Autosomal+Dominant+Hypocalcemia+Type+1+%28ADH1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1).</a> Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).</li>
<li>Libutti, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+gland-specific+deletion+of+the+mouse+Men1+gene+results+in+parathyroid+neoplasia+and+hypercalcemic+hyperparathyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism.</a> Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).</li>
<li>Bi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+Toxin-+and+GFP-Based+Mouse+Models+of+Acquired+Hypoparathyroidism+and+Treatment+with+a+Long-Acting+Parathyroid+Hormone+Analog%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog.</a> J Bone Miner Res. , (2015).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Buch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-inducible+diphtheria+toxin+receptor+mediates+cell+lineage+ablation+after+toxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration.</a> Nat Methods. 2, 419-426 (2005).</li>
<li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 부갑상선에 선택적으로 GFP 발현과 유전자 변형 마우스를 사용하여 GFP 유도 부갑상선의 기술을 보여줍니다. PTHcre에서, mTmG 마우스, 이중 형광 (Cre 호텔 발현 세포 및 비 Cre 호텔에서 빨간 토마토의 녹색 GFP 세포를 표현) 명확하게 파악하고, 정확하게 갑상선을 제거하지 않고 모든 부갑상선을 제거 할 수있게. 우리는 형광 적색 비 부갑상선 조직을 식별 할 수있는 능력에 대해 이중 형광 mTmG 마우스의 사용이 선호되지만, 우리의 방법은 또한 토마토 레드 (B6.Cg-CT (ROSA) 26Sortm14 (같이 단일 형광 동물을 사용하여 잘 작동해야 CAG-tdTomato) Hze / J) 마우스입니다. 절차 수행 비교적 쉽게 마우스 당 약 20 분을 요구하고, 심각하고 지속적인 hypoparathyroid 표현형을 초래한다. 또한, GFP 양성 부갑상선의 또 다른 장점은 비정상적인 부갑상선의 검출 용이성이다. 우리의 연구는 보여쉽게 녹색 형광에 의해 우리의 마우스 모델에서 감지 B6 마우스 (그림 1)의 약 분기에 부갑상선의 mislocalization. 등 Thyro-부갑상선 반대로, 우리의 기술은 갑상선 호르몬 대체 및 칼시토닌을 생산하는 갑상선 C 세포의 제거 미지 효과 이후 필요에 갑상선의 제거를 방지한다. 형광 표지 된 부갑상선은 부갑상선의 절연을 필요로하는 다른 연구에 사용될 수 있습니다. 이 모델의 한계는 수술에 대한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 기본 미세 기술과 형광 광원과 해부 현미경이 필요합니다. 수술 않아도 hypoparathyroid 마우스를 생성하는 제 2 기술이 설명된다. 디프테리아 PTHcre - IDTR 마우스는 온화한 부갑상선 기능 저하증의 표현형을 전시, 단순히 마우스에 복강 DT 주입이 필요 독소 처리. 중요한 부분 FOR 용량의 최적화는이 모델을했다 생성하고식이 요법을 투여. DT의 과다 복용은 독성 주도하지만 낮은 복용량은 접근의 효능을 감소. 우리는 관리 5 μg의 / kg,에서 2 주사의 용량 연대 3 일 간격, 아니 / 최소한의 사망률 신뢰할 수 있고 안정적인 저 칼슘 혈증의 결과 것으로 판단. 궁극적으로, 우리는이 두 가지 방법은 인수 부갑상선 기능 저하증에 대한 유용한 마우스 모델을 제공 할 수 있기를 바랍니다. 새로운 지속성 PTH를 사용하여, 우리는 부갑상선 기능 저하증 (17)에 대한 새로운 약물의 효능을 결정하는 이러한 모델 모두의 첫 번째 사용을보고했다.

인간의 생리 및 질병이 작은 내분비 기관의 중요성을 이해 1880 (1) 인간과 Sandström에 의해 여러 다른 종의 부갑상선의 첫 번째 체계적인 설명, 이후 지속적으로 개선되었다. 부갑상선은 부갑상선 호르몬 (PTH), 칼슘 대사의 주요 레귤레이터를 분비한다. PTH는 인산 항상성 및 골대사 1,2 중요한 호르몬이다. 목 수술 중 부갑상선의 사고 제거 또는 손상 부갑상선 기능 저하증의 가장 흔한 원인, 낮은 혈중 칼슘, 낮은 PTH 및 고가 인 1을 특징으로하는 질환이다. 더 나은 연구에 안전하고 쉽게 접근 할 수 마우스 모델이 필요 부갑상선 기능 저하증 및 테스트 새로운 치료를 인수했다. 유전 다양한 도구가이기 때문에 마우스는 널리 연구에서 사용생체 내에서 정교한 기계적인 연구를 허용하는이 종로만 제공. 수술 부갑상선 (PTX)은 래트 2, 3, 4, 5, 더 큰 포유 동물 6, 7, 8에서 사용할 수 있지만 그러나, 기술적으로 인해 동맥의 작은 크기와 그 변수 해부학 적 분포의 마우스에서 매우 도전 9. 따라서, 등 Thyro-부갑상선 (복강 내 투여)는 일반적 갑상선 부갑상선과 함께 열이 제거 된 쥐에서 수행된다. 그러나, 낮은 갑상선 호르몬이 모델을 복잡 실험 잠재적 교란 요인이된다. 또한, 칼시토닌, 설치류 칼슘 항상성에 중요한 호르몬을 생산하는 갑상선 내에서 C 세포는 또한 제의 제거시 손실yroids 11. 부갑상선 기능 저하증의 몇몇 유전자 마우스 모델은 PTH 널 마우스 (12), GCM2 널 마우스 (13)와, 칼슘 감지 수용체 (CASR) 14 (15), 활성화 돌연변이와 NUF 마우스를 포함하는 존재한다. 그러나, 이들 유전 적 결함은 이미 배아 발달 동안 존재하고, 부갑상선 기능 따라서 이미 배아 발생 동안 손상된다. 이는 골격으로 장기의 발달에 영향을 미칠 수있다. 이것은 나중에 인생에서 질병을 획득 수술 후 부갑상선 기능 저하증 환자와 대조. 또한,이 마우스 모델의 일부는 상기의 사용 12, 13, 14을 복잡 조기 치사 감소 불임을 나타낸다. 우리는 두 개의 새로운 마우스 m를 개발인수 부갑상선 기능 저하증에 대한 odels. 갑상선을 제거하지 않고 부갑상선 쉽게 제거 수술을 위해 식별 할 수 있습니다, 특히 부갑상선에서 GFP를 발현 유전자 조작 마우스를 사용. 이 마우스는 ROSA mTmG 마우스로 5.5 킬로바이트의 PTH 프로모터 (16)의 제어하에 Cre 호텔의 재조합 효소를 표현하는 PTH-Cre 호텔 마우스를 교차에 의해 생성되었습니다. 그 결과 PTHcre, mTmG 마우스는 부갑상선 세포에서 구체적으로 녹색 형광 단백질을 발현. 두번째 마우스 모델은 동일한 PTH-Cre 호텔, 부갑상선에 특히 디프테리아 독소의 수용체 발현의 결과로 유도 DTR 마우스에서 STOP 카세트를 제거하는이 시간을 사용한다. DT의 전신 투여는 동물이 수술없이 hypoparathyroid 렌더링, 부갑상선 세포를 파괴한다. 본 연구에 제시된 두 마우스 모델은 3 개월 관찰 요정 위에 안정한 hypocalcemic 표현형을 입증OD. 절차가 수행하기 쉬운, 표현형이 재현하고 hypoparathyroid 마우스는 높은 생존율 (17)을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>ROSAmT/mG 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7676</td><td></td></tr><tr><td>PTH-Cre 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5989</td><td></td></tr><tr><td>iDTRmice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>6-0 polyglactin 910 봉합사 with needle</td><td>Ethicon, Inc</td><td>J510G</td><td></td></tr><tr><td>안전 단일 에지 면도날</td><td>American Safety Razor Company</td><td>66-0089</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>깃털 안전 면도기 Co., LTD</td><td>72042-11</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드 준비 패드</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>플라이 거즈</td><td>Busse. Inc</td><td>BHD707</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 염화나트륨 용액</td><td>HOSPIRA Worldwide, Inc</td><td>07983-09</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 29 G 인슐린 주사기</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>외과용 절개 드레이프</td><td>3M</td><td>6640EZ</td><td></td></tr><tr><td>Dumstar 생물학 집게</td><td>Roboz 수술 기구 Co., Inc</td><td>RS-4984</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 스프링 가위</td><td>Roboz 외과 기구 Co., Inc</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>MILTEX., Inc</td><td>V98-42</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromethanol</td><td>시그마-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸-2-부탄올</td><td>시그마-Aldrich</td><td>152463</td><td>2,2,2-Tribromethanol</td></tr><tr><td>디프테리아 독소 분말</td><td>시그마-Aldrich</td><td>D0564</td><td>를 용해하십시오.-80 &#176의 원액으로 1mg/mL의 0.9% 염화나트륨 용액에 용해시킵니다. C</td></tr><tr><td>Multicap 채혈 모세관</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td><td>855578</td><td>RapidLab 348 Ca<>s>up2+/pH 분석기를 사용한 iCa<sup2+ 분석용 /sup/pH 분석기</td></tr><tr><td>RapidLab 348 Ca2+/pH 분석기</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td>For iCa2+ 분석</td></tr></tbody></table>

hypoparathyroid 마우스를 만드는 두 기술 : 부갑상선 gfp 땀샘과 디프테리아 독소 매개 부갑상선 절제술을 사용하여

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

부갑상선 기능 저하증(HP)은 저칼슘혈증, 고인산혈증, 낮은 뼈 회전율로 이어지는 낮은 PTH 수치를 특징으로 하는 질환입니다. 이 질병의 가장 흔한 원인은 갑상선 수술 중 부갑상선을 우발적으로 제거하는 것입니다. HP에 대한 새로운 치료법이 필요하지만, 이를 테스트하려면 후천적 HP의 신뢰할 수 있는 동물 모델이 필요합니다. 
여기에서는 획득한 HP의 두 가지 마우스 모델 생성을 보여줍니다. GFP-PTX 모델에서, 부갑상선(PTHcre-mTmG)에서 특이적으로 발현된 녹색 형광 단백질(GFP)을 가진 마우스는 PTHcre+ 마우스와 Rosa-mTmGfl/fl 마우스를 교배하여 생성되었습니다. 녹색 형광 부갑상선은 형광 해부 현미경으로 쉽게 식별할 수 있으며 부갑상선 절제술은 20분 이내에 수행됩니다. 형광 유도 수술 후 생쥐는 심각한 저칼슘혈증을 보입니다. 전통적인 갑상선-부갑상선 절제술과는 달리, 이 정밀한 수술 방법은 갑상선과 갑상선 기능을 그대로 유지합니다. 수술이 필요하지 않은 두 번째 모델은 디프테리아 독소 접근법을 기반으로 합니다. 부갑상선에서 디프테리아 독소(DT) 수용체를 특이적으로 발현하는 PTHcre-iDTR 마우스는 유도성 DTR 마우스와 PTHcre 마우스를 교배하여 생성되었습니다. 따라서 부갑상선 세포는 디프테리아 독소(DT)에 민감하게 만들어지며 마우스에 DT를 전신적으로 주입하여 선택적으로 파괴될 수 있습니다. 그 결과 저칼슘성 표현형은 안정적입니다.

부갑상선의 위치 형광 해부 현미경으로 관찰 첫째, 우리는 54 PTHcre-mTmG 마우스의 부갑상선의 분포를 기록했다. 74 %는 (54분의 40) 마우스는 26 % (54분의 14) 쥐가 추가로 세 번째 부갑상선 (그림 1B, D, F)을 가지고 두 개의 녹색 부갑상선 (그림 1A, C, E)를했다. 단일 선 또는 세 개 이상의 땀 샘을 더 마우스는 관찰되지 않았다. 일반적으로, 부갑상선은 갑상선 (58 %, 122분의 71의 우수한 국경 근처에 위치하고도 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E를 (2), F (3)). 27 % (122분의 33) 분비가 갑상선의 열등한 국경 근처에 위치했다 (그림 1C (1), D (3), F (1)), 13 % (1백22분의 16)를 멀리 t에서 위치했다hyroid 선 (도 1B (3) E (1), F (2)). 우리의 연구 결과와 일치하고 부갑상선 (20)의 위치를 변화의 이전 연구 결과를 확장 할 수 있습니다. GFP-PTX 마우스 피부 절개를 폐쇄에 마취에서 전체 수술은 마우스 당 약 20 분 걸렸다. 3 개월의 관찰 기간 동안 수술 후 마우스의 생존율은 96.3 % (55분의 53)이었다. 92.4 % (53분의 49) GFP-PTX 마우스는이 SD 허위 작동 대조군 이하의 평균 하회 이온화 칼슘 농도를 나타내었다. GFP의-PTX 마우스 (저 칼슘 혈증, 낮은 PTH 및 혈청 인산)의 hypoparathyroid 표현형 3 개월의 전체 관측 시간 동안 안정 하였다. 중요한 것은, 갑상선 기능은 42 ± 24 대 = 3개월 수술 (TSH 후 가짜 운영 동물에서 차이가 없었다 (30) ± 15를 mU / L, P = 0.171; T4 = 30.0 ± 0.6 대 3.1 ± 0.9 μg의 / dL로, P = 0.707 (그림 2). PTH-CRE-IDTR 마우스 DT는 PTH-Cre 호텔 - IDTR 마우스를 개발 부갑상선 기능 저하증 (낮은 혈중 이온화 칼슘, 혈중 인, 그리고 부적절하게 낮은 정상 PTH 수준)을 주입. 우리는 이전에 측정 순환 PTH 이러한 마우스 (17)의 때문에 다소 온화한 표현형을 설명하는 몇 PTH 양성 세포는 디프테리아 독소에 의해 절제를 피할 것으로보고있다. GFP-PTX 마우스와 PTH-CRE-IDTR 마우스에서 부갑상선 기능 저하증 중요한 혈액의 Ca ++ 감소 및 혈청 PTH 수준은 모의 - 조작 된 마우스에서 발견 레벨 중 (Ca ++ = 1.05 ± 0.40 대에 비해 3 일 수술 후 GFP-PTX 마우스에서 관찰 </em&gt; 1.30 ± 0.03 밀리몰 / L, P &lt;0.05; PTH = 32 ± 22 대 580 ± 137 PG / ㎖, p &lt;0.05). 부갑상선 기능 저하증의 표현형은 3 개월의 관찰 기간 동안 안정 하였다 (그림 3A, 허가 (참조 # 17 재 인쇄)). 삼일 간격 최대 hypoparathyroid 표현형을 수득 DT의 최소량을 사용하여 최적 투여 량 및 요법에서 5 μg의 / kg DT 2 주사 후, DT는 PTH-CRE-IDTR의 마우스에 비해 유의 한 저 칼슘 혈증 및 감소 PTH 하였다 주입 90 일의 관찰 기간 내내 지속 차량 제어 마우스 중 (Ca ++ = 1.10 ± 0.07 밀리몰 / L 대 1.26 ± 0.05 밀리몰 / L, p &lt;0.05 = 218 ± 156 pg / ml 인 대 572 ± 164 PG PTH / mL로, P &lt;0.05) (그림 (b), (참조 번호 (17)로부터 허가 재판)). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> 그림 1 : <st룽&gt; 형광 해부 현미경 하에서 54 PTHcre-mTmG 마우스의 부갑상선의 다양한 위치의 대표 이미지. 마우스 중 하나를 두 개 (A, C, E) 또는 세 (B, D, F) 녹색 부갑상선했다. 대부분의 부갑상선이 우수한 국경 근처에 위치했다 (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) 또는 가까운 하부 경계 갑상선의 (C는 (1), D는 (3), F는 (1)). 드문 경우에, 일부는 ectopically에 있었다 (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> 그림 2 : TSH 및 GFP-PTX 마우스의 T4 수준. 3개월 GFP-PTX 후, 혈청 TSH와 T4의 measurem에 대한 얻었다<html> 엔트. GFP-PTX는 마우스 TSH 농도 (42 ± 24를 mU / L) (A)와 T4 농도를 보였다 (3.0 ± 0.6 μg의 / dL 이상) 제어 마우스 (TSH = 30 ± 15를 mU / L, P 차이가 없었다 (B) = 0.171, N = 11, T4 = 3.1 ± 0.9, P = 0.707, N = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> 그림 3 : GFP - PTX 마우스의 혈액 칼슘 ++ 및 PTH 수준 및 DT는 PTH-CRE-IDTR 마우스를 주조. (재 인쇄 - (*** p &lt;0.001, 8 N = 6)은 모두 GFP-PTX 마우스 (A) 및 DT는 PTH--IDTR CRE 안정한 저 칼슘 혈증을 나타내 마우스 (B)을 주입 3 개월간 관찰 기간 PTH의 수준을 저하 참조 # 17)에서 권한.에스 / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

후천성 부갑상선 기능 저하증이 있는 마우스는 부갑상선 기능 저하증에 대한 새로운 약물 요법을 연구하는 데 유용할 것입니다. 이러한 마우스를 만드는 두 가지 절차가 시연됩니다. GFP-PTX 마우스는 녹색 형광 부갑상선에 의해 유도되는 외과적 부갑상선 절제술에 의해 생성됩니다. 두 번째 비수술적 접근법은 디프테리아 독소 수용체의 부갑상선 특이적 발현을 기반으로 합니다.

Hypoparathyroid 마우스를 만드는 두 기술 : 부갑상선 GFP 땀샘과 디프테리아 독소 매개 부갑상선 절제술을 사용하여

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

이 절차의 전반적인 목표는 사용이 간편하고 안정적인 표현형을 나타내며 갑상선 기능은 온전하게 유지하는, 후천성 부갑상선 기능 저하증의 두 가지 마우스 모델을 제작하는 것입니다. 이 두 모델의 주된 장점은 형광 안내 수술이나 디프테리아 독소 수용체의 PTH 특이적 발현을 통해 마우스의 부갑상선을 정밀하게 제거할 수 있어, 인접한 갑상선에 영향을 주지 않고 세포를 선택적으로 표적화하여 파괴할 수 있다는 점입니다. 우리는 우리의 마우스 모델이 부갑상선 기능 저하증 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있기를 기대합니다.예를 들어, PTH 유사체 치료가 요중 칼슘 배설을 증가시키지 않으면서 정상 혈청 칼슘 수치를 유지하는 데 도움이 될 수 있을까요? 이러한 모델들은 부갑상선 기능 저하증의 다른 임상적 질문들을 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 부갑상선 기능 저하증으로 인해 골강도가 영향을 받는지, 그리고 치료에 따라 골강도가 변화하는지 등이 있습니다.이러한 질문들은 환자를 대상으로 답을 찾기 어렵지만, 이러한 마우스 모델을 통해 해결할 수 있습니다. 승인된 프로토콜에 따라 부갑상선에 특이적으로 GFP를 발현하는 8~10주령의 마우스를 마취하는 것으로 시작하십시오. 동물을 앙와위로 배치하고, 발가락 꼬집기 회피 반응의 부재 또는 다른 방법을 통해 적절한 마취 깊이를 확인하십시오.목의 복측 부위를 늘리고 털을 깎아 수술 준비를 합니다. 포비돈 요오드 소독 패드로 제모한 피부를 소독한 다음, 승인된 프로토콜에 따라 수술용 스크럽과 알코올 린스를 사용하여 절개 부위를 준비합니다. 그다음, 수술 부위의 오염을 줄이기 위해 멸균 수술포로 동물을 덮어줍니다.수술용 메스로 2 cm 길이의 종절개를 가한 후, 곡선형 톱니 포셉을 사용하여 근막을 박리하고 타액선을 옆으로 밀어냅니다. 그런 다음 해부 현미경을 통해 수술 부위를 관찰하면서, 끝이 날카로운 포셉의 팁을 이용해 기관 주위 근육을 절개 및 분리하여 기관을 노출시킵니다. 기관 옆에 위치한 갑상선의 우엽과 좌엽을 확인합니다.그 다음 광원을 형광광으로 전환하여 두 개의 녹색 형광 부갑상선 조직을 시각화합니다. 설치류는 일반적으로 두 개의 부갑상선만을 가지고 있습니다. 양측 갑상선 옆에서 두 개의 부갑상선을 식별할 수 없는 경우, 부갑상선이 이소성으로 위치했을 가능성이 있으므로 기관을 따라 세밀하게 탐색해야 합니다.다음으로, 외과용 포셉과 가위를 사용하여 녹색의 부갑상선 조직을 조심스럽게 제거하고, 기관을 따라 모든 녹색 조직이 제거되었는지 주의 깊게 확인합니다. 지혈을 위해 멸균 거즈를 사용합니다. 기관 주변 근육을 단속 봉합으로 폐쇄합니다.Halstead 봉합사를 사용하여 피부 절개 부위를 봉합합니다. 수술 후 동물은 체온 회복을 위해 가온 패드가 설치된 별도의 케이지에 넣습니다. 마우스가 깨어나면 케이지 바닥에 펠릿 사료와 물, 그리고 약간의 젤라틴 음식을 배치합니다.2시간의 수술 후 관찰 기간이 지나면 마우스를 동물 사육 시설로 돌려보냅니다. 부갑상선 절제술 3일 후, 혈액 가스 시스템, 칼슘 및 pH 분석기와 같은 분석기를 사용하여 꼬리 혈액 10 µL의 이온화 칼슘을 분석합니다. 부갑상선 절제술이 성공했다면, 혈중 이온화 칼슘 수치는 가짜 수술(sham operation) 대조군 마우스의 표준 편차 마이너스 2배 값과 같거나 그보다 낮게 나타날 것입니다.디프테리아 독소 분말을 멸균 식염수로 희석하여 0.5 µg/mL 농도의 디프테리아 독소 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 해당 용액을 멸균 여과한 후 분주합니다. 부갑상선에 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현하는 8~10주령 마우스에 체중 kg당 5 µg의 디프테리아 독소를 주입합니다.디프테리아 독소를 두 번째로 주입한 3일 후, 이전과 동일하게 꼬리 혈액 10 µL를 채취하여 이온화 칼슘을 분석합니다. 다음은 부갑상선에서 특이적으로 GFP를 발현하는 마우스의 부갑상선이 위치한 다양한 지점의 대표 이미지입니다. 마우스는 두 개 또는 세 개의 녹색 부갑상선을 가지고 있었습니다.대부분의 부갑상선은 갑상선의 상단 경계 또는 하단 경계 근처에 위치했습니다. 드문 경우로 일부 부갑상선은 이소성으로 위치하기도 했습니다. 본 마우스 모델의 장점 중 하나는 갑상선이 온전하게 유지된다는 점입니다.이 그림은 부갑상선 절제술 3개월 후 GFP-PTX 마우스의 TSH 수치를 보여줍니다. 이 그림은 T4 측정값을 보여줍니다. GFP-PTX 마우스의 TSH 농도와 T4 농도는 대조군 마우스와 차이가 없었습니다.이 이미지는 GFP-PTX 마우스의 혈중 칼슘 수치와 PTH 수치를 보여줍니다. 이 이미지는 디프테리아 독소를 주입한 PTHcre-iDTR 마우스의 혈중 칼슘 수치와 PTH 수치를 보여줍니다. GFP-PTX 마우스와 DT를 주입한 PTHcre-iDTR 마우스 모두 3개월의 관찰 기간 동안 안정적인 저칼슘혈증과 감소된 PTH 수치를 나타냈습니다.숙달되면 GFP 유도 부갑상선 절제술의 전체 과정은 약 20분 정도에 완료될 수 있습니다. 디프테리아 독소의 단일 주사는 적절히 수행될 경우 1분도 걸리지 않습니다. 이 절차 이후, 이 생쥐들은 부갑상선 기능 저하증이 발생하며 전임상 질환 모델로 사용될 수 있습니다.부갑상선 기능 저하증 치료에 있어 서로 다른 PTH 호르몬 유사체의 효능과 같은 문제들을 다룰 수 있습니다. 디프테리아 독소는 위험하므로, 작업자는 통상적인 디프테리아 독소 예방 접종을 받아야 함을 유의하십시오. 이러한 절차를 수행하는 동안에는 항상 마스크와 장갑과 같은 개인 보호 장구를 착용해야 합니다.

two-techniques-to-create-hypoparathyroid-mice-parathyroidectomy-using

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 갑상선암 세포를 마우스 모델의 갑상선에 orthotopic 접종하는 절차를 설명하며, 이는 발암을 평가하고 잠재적인 치료 전략을 발견하기 위한 귀중한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

Orthotopic Inoculation of Thyroid Cancer Cells into Murine Thyroid: A Procedure to Establish Orthotopic Thyroid Cancer Mouse Model(쥐 갑상선암에 갑상선암 세포의 정소성 접종: 정소성 갑상선암 마우스 모델 수립 절차)

퇴행성 갑상선 암의 동소 마우스 모델의 생성은 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 따라서 질병의 진행뿐만 아니라 화면 혁신적인 치료 개입을 연구하는 많은 임상 관련 설정을 생성, 면역 결핍 쥐의 갑상선에 인간의 퇴행성 갑상선 암 세포의 수술 위치를 사용합니다.

역 형성 갑상선 암의 동소 마우스 모델

의 intravital 현미경은 살아있는 동물의 다양한 생물학적 과정을 영상화 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 문서에서는, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘에서 이러한 분비 과립으로 세포 내 구조의 역학 이미징을위한 자세한 방법을 제시한다.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

현재까지 부갑상선 (PG) 식별 방법의 개발은 전임상 연구에서 동물 모델의 부족으로 인해 제한적입니다. 여기에서 우리는 수술 중 PG 이미징을 위한 간단하고 효과적인 쥐 모델을 설정하고 산화철 나노입자를 새로운 PG 조영제로 사용하여 그 효과를 평가합니다.

수술 중 부갑상선 영상촬영을 위한 간단하고 효과적인 쥐 모델 구축

여기에서는 경구 내시경 갑상선 절제술 전정 접근법에 대한 방법론을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

경구 내시경 갑상선 절제술 갑상선 절제술을 위한 전정 접근법

하시모토 갑상선염의 여러 유형의 동물 모델이 확립되었으며, NOD 마우스의 자발성 자가면역 갑상선염도 확립되었습니다. H-2h4 마우스는 HT 유도를 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 모델입니다. 이 기사에서는 이 접근 방식을 설명하고 SAT 쥐 모델을 더 잘 이해하기 위해 병리학적 과정을 평가합니다.

마우스 자발성 자가면역 갑상선염 모델 생성

후천성 부갑상선 기능 저하증(HypoPT)의 동물 모델은 HypoPT가 미네랄 이온 항상성에 미치는 영향을 이해하고 새로운 치료법의 효과를 검증하는 데 중요합니다. 여기서, 탄소 나노입자를 이용하여 부갑상선 절제술(PTX)에 의해 후천성 부갑상선기능저하증(AHypoPT) 쥐 모델을 생성하는 기술이 제시된다.

탄소 나노입자 보조 부갑상선 절제술을 통한 부갑상선 기능 저하증 쥐의 생성

겨드랑이 절개 없이 3개의 포트를 이용한 경구강 로봇 갑상선 전절제술과 양측 중심 지역 림프절 절제술은 초기 갑상선 유두암에 실현 가능하고 안전합니다. 여기에서는이 작업의 작동 기술을 제시합니다.

갑상선 유두암에 대한 경구강 로봇 갑상선 전절제술 및 양측 중앙 지역 림프절 절제술

이 프로토콜은 돼지로부터 부갑상선을 조달하기 위한 신속하고 치명적이지 않은 방법을 제시합니다. 이 절차는 마취를 통한 돼지 준비, 편측 흉선 회수, 흉선내 부갑상선의 생체 외 식별 및 추출의 세 가지 주요 단계로 구성됩니다.

살아있는 기증자 돼지로부터 부갑상선 조달 및 생체 외 식별

학습하세요 생취득성 저부갑상선증 마우스 모델을 만드는 두 가지 방법을. GFP 형광 유도 수술과 디프테리아 독소 매개 세포 특이적 제거 기법을 통해 갑상선 기능을 보존하면서 부갑상선을 정밀하게 제거하는 방법을 배우세요.

Hypoparathyroid 마우스를 만드는 두 기술 : 부갑상선 GFP 땀샘과 디프테리아 독소 매개 부갑상선 절제술을 사용하여

더 많은 동영상 탐색