Hypoparathyroid 마우스를 만드는 두 기술 : 부갑상선 GFP 땀샘과 디프테리아 독소 매개 부갑상선 절제술을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 사용하기 쉽고, 안정적인 표현형을 생성하며, 갑상선 기능을 그대로 유지하는 후천성 부갑상선 기능 저하증의 두 가지 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이 두 모델의 주요 장점은 형광 유도 수술 또는 디프테리아 독소 수용체의 PTH 특이적 발현을 통해 마우스의 부갑상선을 정밀하게 제거할 수 있어 세포가 인접한 갑상선을 방해하지 않고 선택적으로 표적화되고 파괴될 수 있다는 것입니다. 우리는 우리의 마우스 모델이 부갑상선 기능 저하증 분야의 핵심 질문에 답할 수 있기를 바랍니다.

예를 들어, PTH 유사체 요법이 소변 칼슘 배설을 증가시키지 않고 정상적인 혈청 칼슘 수치를 유지하는 데 도움이 될 수 있습니까? 이러한 모델은 부갑상선 기능 저하증의 다른 임상 질문을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 뼈의 강도는 부갑상선 기능 저하증에 의해 영향을 받으며 치료에 따라 변합니까?

이와 같은 질문은 환자가 대답하기 어렵지만 이러한 마우스 모델을 사용하여 해결할 수 있습니다. 8주에서 10주 된 생쥐를 마취하여 시작하여 승인된 프로토콜에 따라 부갑상선에서 GFP를 특이적으로 발현합니다. 동물을 누운 자세로 눕히고 발가락 꼬집기, 금단 반사 또는 기타 수단이 없는 상태에서 적절한 마취 깊이를 보장합니다.

복부 목 부위를 확장하고 털을 면도하여 수술을 준비합니다.면도한 피부를 포비돈 요오드 소독 패드로 소독한 다음 승인된 프로토콜에 따라 수술용 스크럽과 알코올 린스를 사용하여 절개 부위를 준비합니다. 다음으로, 수술 부위의 오염을 줄이기 위해 멸균 수술용 커튼으로 동물을 덮습니다.

수술용 메스로 세로 2cm 절개를 절단한 후 구부러진 톱니 모양의 집게를 사용하여 근막을 절개하고 타액선을 옆으로 밀어 넣습니다. 그런 다음 해부 현미경을 통해 수술 부위를 보면서 날카로운 집게 끝을 사용하여 기관주위 근육을 절개하고 분리하여 기관을 노출시킵니다. 기관 옆에 위치한 갑상선의 오른쪽과 왼쪽 엽을 확인합니다.

그런 다음 광원을 형광등으로 전환하고 두 개의 녹색 형광 부갑상선을 시각화합니다. 설치류는 일반적으로 부갑상선이 두 개뿐입니다. 갑상선 양쪽 옆에 있는 두 개의 부갑상선을 식별할 수 없는 경우, 외부로 떨어진 부갑상선을 의심하고 기관을 따라 부갑상선을 주의 깊게 찾아야 합니다.

그런 다음 수술용 집게와 가위를 사용하여 녹색 부갑상선을 조심스럽게 제거하고 기관을 따라 녹색 조직이 모두 제거되었는지 주의 깊게 확인합니다. 지혈을 위해 멸균 거즈를 사용하십시오. 중단된 봉합사로 기관주위 근육을 닫습니다.

Halstead 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 체온 회복을 위해 수술 후 동물을 보온 패드의 별도 케이지에 넣습니다. 쥐가 깨어나면 펠릿 차우와 젤라틴 음식과 물을 케이지 바닥에 놓습니다.

2시간의 수술 후 관찰 후 쥐를 동물 시설로 되돌려 보냅니다. 부갑상선 절제술 3일 후, 혈액 가스 시스템, 칼슘 및 pH 분석기와 같은 분석기를 사용하여 꼬리 혈액 10마이크로리터에서 이온화 칼슘을 분석합니다. 부갑상선 절제술이 성공적일 경우, 혈액 이온화 칼슘은 가짜 수술 대조군 마우스의 표준 편차 마이너스 2 이하가 될 것입니다.

디프테리아 독소 분말을 멸균 식염수로 희석하여 밀리리터당 0.5마이크로그램의 농도로 디프테리아 독소 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 멸균 필터는 용액과 alloquot를 필터링합니다. 8-10주 된 생쥐에게 체중 1kg당 5마이크로그램의 디프테리아 독소를 주입하여 부갑상선에서 디프테리아 독소 수용체를 특이적으로 발현합니다.

디프테리아 독소를 두 번째 주사한 후 3일 후, 이전과 같이 꼬리 혈액 10마이크로리터에서 이온화 칼슘을 분석합니다. 다음은 부갑상선에서 GFP를 특이적으로 발현하는 마우스에서 부갑상선의 다양한 위치에 대한 대표적인 이미지입니다. 생쥐는 두 개 또는 세 개의 녹색 부갑상선을 가지고 있었습니다.

대부분의 부갑상선은 갑상선의 상경계(superior bound) 또는 하경계(infer border) 근처에 위치했다. 드문 경우이긴 하지만, 일부 부갑상선은 이소성 위치에 있었다. 우리 마우스 모델의 장점 중 하나는 갑상선이 손상되지 않은 상태로 유지된다는 것입니다.

이 그림은 부갑상선 절제술 후 3개월 후 GFP-PTX 마우스의 TSH 수치를 보여줍니다. 이 그림은 T4 측정값을 보여줍니다. GFP-PTX 마우스는 대조군 마우스와 다르지 않은 TSH 농도 및 T4 농도를 보였습니다.

이 이미지는 GFP-PTX 마우스의 혈중 칼슘 수치와 PTH 수치를 보여줍니다. 이 이미지는 디프테리아 독소를 주입한 PTHcre-iDTR 마우스의 혈중 칼슘 수치와 PTH 수치를 보여줍니다. GFP-PTX 마우스와 DT 주입 PTHcre-iDTR 마우스 모두 3개월의 관찰 기간 동안 안정적인 저칼슘혈증을 보였으며 PTH 수치가 감소했습니다.

일단 숙달되면 GFP 유도 부갑상선 절제술은 전체 절차에 대해 약 20분 안에 완료할 수 있습니다. 디프테리아 독소를 한 번 주사하는 경우 제대로 수행되면 1분도 채 걸리지 않습니다. 이 절차에 따라 이 마우스는 부갑상선 기능 저하증이 발생하고 전임상 질병 모델로 사용할 수 있습니다.

부갑상선 기능 저하증 치료에서 다양한 PTH 호르몬 유사체의 효능과 같은 질문에 답할 수 있습니다. 디프테리아 독소는 위험하며 근로자는 일반적인 디프테리아 독소 예방 접종을 받아야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 절차를 수행하는 동안 마스크 및 장갑과 같은 개인 보호 장비를 항상 착용해야 합니다.