Name: 문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 배우세요 식물, 난균 및 곰팡이의 섬세한 조직을 SEM 관찰을 위해 준비하는 개선된 고정 프로토콜. 이 방법은 감염 과정의 핵심 측면을 시각화하여 미생물 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 보조금 협정 제이 책은 저자의 의견을 반영 634429.에서 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 (2020)의 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았고, 유럽위원회 (European Commission)가 정보로 만들어 질 수있는 사용에 대한 책임을지지 않습니다 거기에 포함. 우리는 또한 리얼 자르 딘 보타니 코, CSIC에 의한 재정 기여를 인정합니다. SR은 Saprolegnia가 번식 그녀의 연구 지원을위한 유럽 연합 (EU) [ITN-SAPRO-238550]에 감사합니다. 우리는 또한 친절에 대한 시스코 칼론 감사 샘플을 (그림 5)을 처리하기위한 Phellorinia의 herculanea 이미지와 B의 Pueyo을 제공하고자합니다. 모든 이미지는 마드리드에서 리얼 자르 딘 보타니-CSIC의 SEM 서비스에 의해 촬영되었다.

참고 :이 프로토콜은 모든 (4-6)에 공통의 절차를 설명하는 특정 생물 (섹션 1-3)과 3-3 헌신 6 가지 주요 섹션이 포함되어 있습니다. 별표 (*)는 실험자에 의해 수정 단계를 나타냅니다. 1. 개발의 연구 및 완전 성형 공장 구조 <ol><li> 수집 및 고정 <ol><li> 식물 물질은 흄 후드없이 액세스 할 수있는 장소에 수집되면, 도입 원심 분리기 튜브에서 70 % 에탄올에 담가 재료. 이상적으로, 에탄올 과도한 탈수를 방지하기 위해 FAA에서 48 시간 (1.1.1-1.1.3 단계) 후 재료를 담가. 흄 찬장은 식물 재료에 액세스 할 수있는 경우,이 단계를 무시하고 1.1.1를 계속합니다. </li><li> 알데히드 필터가 장착 된 연기 찬장에 포르말린 아세트산 알코올 (FAA) 정착액을 준비합니다. 70 % 변성 에탄올 85 부, 60 % 포름 알데히드 용액 10 부 및 빙초산 (5) 부분을 추가한다. 연방 항공국 준비단지 그것의 장기 보관으로, 재료를 고정하기 전에 40을 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 퓸 찬장에서 개인 넓은 입과 누수 방지 플라스틱 병에 FAA의 주식을 붓는다. 사용 가능한 샘플이있는만큼 병을 사용하여 샘플 식별 라벨을 만들 수 있습니다. </li><li> 그들은 곤충, 곰팡이, 또는 극단적 인 기상 조건에 의해 손상되지 않도록 보장 해결하기 위해 꽃이나 식물 분열 조직을 선택합니다. , 가지를 잘라 불필요한 물질을 제거하고, FAA 용액에 즉시 샘플을 입금. </li><li> 72-96 시간 후, 화학 폐기 플라스틱 용기에 FAA를 붓는다. 즉시, 잔여 FAA을 제거하기 위해 신선한 70 % 에탄올로 샘플을 세 번 씻는다. 고정 재료는 70 % 에탄올에 무기한 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 해부 및 탈수 <ol><li> NE, 초 미세 핀셋을 이용하여 실체 현미경을 70 % 에탄올에 고정 재료를 해부edles, 집게, 브러쉬, 마이크로 메스은 (조직의 최대 크기는 약 1cm 3 또는 편평한 재료 2cm이어야 함). 건조되는 조직을 방지하기 위해 에탄올로 덮여 페트리 접시에 시료를 해부. 더 나은 대조 흰색 조직을 볼 수 건조 검은 색 실리콘으로 덮여베이스와 페트리 접시를 사용합니다. </li><li> 임계점 건조기 (CPD, 그림 2a)에 대한 시료 용기의 해부 재료를 넣습니다. 이 시점에서, 70 % 에탄올과 페트리 접시에 용기를 체험하고, (종이와 연필로 만든) 샘플 식별 라벨을 포함한다. 추가 조작을위한보다 효과적인 건조를 들어, 동일한 용기에 젊고 성숙한 샘플을 혼합하지 마십시오. * </li><li> 용기에 뚜껑을 넣고 70 % 에탄올을 듬뿍 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 그들을 입금. 재료가 즉시 처리되지 않은 경우 하룻밤 튜브를 저장합니다. </li><li> 다음 에탄올 시리즈를 통해 해부 자료를 전송70 %, 90 %, 100 %, 100 % 밀폐 항아리 또는 원심 분리기 튜브에서의. 적어도 1 시간 동안 각 솔루션의 샘플을 남겨주세요. 100 % 에탄올 용액 중에 하룻밤 샘플 유지. </li><li> CPD (섹션 4)의 재료로 용기를 전송합니다. </li></ol></li><li> SEM 관찰에 대한 설치 및 준비 식물 조직 <ol><li> 주사 전자 현미경 샘플 홀더 (즉, 알루미늄 스텁) 아래 샘플 식별 번호를 기입합니다. 양면 테이프로 스텁의 상단을 커버. 시편 홀더 (그림 2b)에 스텁을 놓습니다. </li><li> 실체 현미경에서 신중하게 이미 CPD에서 건조 젊고 섬세한 샘플을 운반하는 컨테이너를 엽니 다. CPD 처리 후, 샘플은 정전기에 가볍고 민감한 될 수 있음을 명심하십시오. 샘플은 먼지 나 불순물을 피하기 위해 밖으로 촬영 한 후 컨테이너를 닫습니다. </li><li> , 스텁의 접착 표면에 시료를 넣어 미리 계획 원하는위치 (샘플 표면을 터치하면, 그것을 제거하는 것은 매우 어렵다). 이 시점에서 주요 절개를 수행하지 마십시오; 그냥 선택하기 쉬운 불필요한 조직을 제거합니다. palynological 연구의 경우, 꽃밥을 해부하고 스텁에 꽃가루를 노출을 엽니 다. </li><li> 이러한 수평 위치에 화서로 넣어 긴 샘플 (예를 들어, 2cm 길이). 가능하면, 극성, 측면에 대한 동일한 구조, 아래보기의 동양 샘플. 스텁에 샘플 사이에 충분한 공간을 둡니다. </li><li> 샘플을 즉시 처리 할 수없는 경우, *들이 재수 화 (도 2C)을 방지하기 위해 실리카 겔과 함께 밀폐 용기에 하룻밤 보호 유지한다. 코트 스퍼터 코터를 사용하여 SEM로 전송 샘플 (섹션 5 및 6). </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig2.jpg" /> 그림 2 : 샘플 manipulati 도구에 처리 SEM 관찰하기 전에. CPD 실에서 에탄올 / CO 2 교환을위한 전진 벽 (가) 철강 만든 시료 용기. (b) 플라스틱 시험편 홀더 내의 스틸 스텁. (c) 유리 용기는 습기와 먼지로부터 보호 샘플을 유지하기 위해 사용된다. 기본에서, 실리카 겔을위한 구획이있다. (d)에 중요한 포인트 건조기. 앞에서, 압력계, 전원 스위치, 온도 제어 장치 및 온도 표시 (왼쪽에서 오른쪽)이있다. CO 2 에탄올 교환에 대한 일반적인 작업 압력은 60 바 (800 PSI)입니다. 상부에서, 중앙 샘플 챔버의 측면에 네 개의 밸브 (입구, 드레인, 환기 및 배기 제어)이있다. 사진은 Y. 루이즈 - 레온과 MA 벨로에 의해 촬영되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &lt;<html> P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 다른 표면에 Saprolegnia가 번식 (Oomycetes)의 낭종 행동에 관한 연구 <ol><li> 낭종 성장 고정 <ol><li> (+) - - 포도당 (6g)과 균 학적 펩톤 (3g) * 펩톤과 포도당 (PG-1) D를 사용하여 미디어 (41)를 준비합니다. 수돗물 900 mL의 최대 추가, 121 ° C에서 40 분 압력솥. 이전에 멸균 용액 A의 50 ㎖ (의 NaH 2 PO 4, 0.13 M) 및 솔루션 B의 50 ㎖ (나 2 HPO 4, 0.13 M)을 따르십시오. </li><li> 펩톤, 포도당, (PG-1으로하지만 포도당과 오토 클레이브 전에 펩톤에 유럽 세균 한천 10g을 추가 할 준비가되어 PGA) 한천 매체에 유지 Saprolegnia가 번식의 parasitica의 균주의 재고 문화, 0.5 mL에 균사의 식민지를 성장 배양 접시에 20 ° C에서 24 ~ 48 시간 동안 PG-1 방울의. 멸균 된 C를 수돗물로 3 회 균사체를 세척하고 20 ℃에서 15 시간 동안 이들을 배양하여 포자 형성을 유도= &quot;외부 참조&quot;&gt; 42, 43. </li><li> 부드럽게 정지의 상단 부분을 피펫 팅에 의해 방출 된 보조 zoospores를 수집하고 1 ML의 부분에서 그들을 풀. 보조 낭종 (44)을 생산하는 텍싱에 의해 적극적으로 30 초에 대한 zoospores를 선동. </li><li> 이전에 (연어와 hake 물고기 비늘, 별도의 배양 접시 (P60)의 낭종의 등뼈의 차동 성장을 테스트하려면, 다른면 (즉, 탄소, 금, 구리 TEM 그리드에 보조 낭종 현탁액 0.5 mL를 넣어 표백)와 유리 커버 슬립) *. 표면에 낭종의 부착을 선호 70 분, 20 ° C에서 낭종을 품어. </li><li> 액체를 제거하고 낭종의 고정 각면에 2 % 글루 타르 알데히드 0.5 mL를 넣어. 1 시간 동안 흄 후드하에 실온에서 시료를 유지한다. </li><li> 글루 타르 알데하이드를 제거하고 에탄올 시리즈 (30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %를 통해 샘플을 탈수15 분 동안 각각의 에탄올 용액 5 ㎖를 첨가 90 %, 100 %, 100 %). 마지막으로 100 % 에탄올 용액에 일단 샘플을 밀봉 된 배양 접시에서 개월까지 저장할 수있다. 이 단계에서, 샘플은 CPD 건조 될 준비가된다. </li><li> 조심스럽게 CPD (4 절)에 적합한 홀더에 페트리 접시에서 그리드와 비늘을 전송합니다. 이 단계에서, 서로 분리 된 샘플을 보관할 때는 CPD 그리드 홀더 또는 적층 시편 홀더를 사용한다. 낭종은 항상 그리드에 위로 향하도록해야 함을 염두에두고, 핀셋 그리드와 비늘을 가져 가라. * </li></ol></li><li> SEM 관찰에 대한 설치 및 준비 낭종 샘플 <ol><li> 이전에 양면 카본 테이프로 덮여 아래에 표시 한 알루미늄 스텁에 그리드와 규모를 탑재합니다. </li><li> 스퍼터 코터 (섹션 5)에 샘플을 전송합니다. </li><li> 주사 전자 현미경 (섹션 6)에서 샘플을 관찰한다. </li></ol></li></ol>Phellorinia의 herculanea의 식물 표본 상자 진균 포자의 연구 <ol><li> 수분 보충과 포자의 탈수 <ol><li> 그들에게 호감 않도록주의하면서 ~ 0.5 cm 2 연필 표지 봉투를 형성, 여과지로 조심스럽게 각각의 샘플 랩. 종이 클립 여과지를 밀봉합니다. 페트리 접시에 충전 샘플을 옮기고 포자 주위 조직을 재수 화하기 위해 물 10ml에 그들을 몰입. </li><li> 즉시 전자 레인지 (약 20 초 600 W)에 샘플을 넣어. 물이 증발하기 시작하면 재료를 제거하고 실온에서 냉각되도록. </li><li> 다음 에탄올 시리즈를 통해 샘플 합격 : 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % 및 100 %. 시료의 양에 따라,이 단계 비이커 또는 원심 분리 튜브를 사용한다. 각각의 용액에서 15 분 동안 샘플을 남겨주세요. </li><li> CPD (섹션 4)에 샘플을 놓습니다. </li></ol></li><li> 설치 및 PSEM 관찰을 위해 포자를 수리, <ol><li> 봉투를 엽니 다. 양면 테이프로 이전에 제조 된 스텁에 포자를 따르십시오. 또는, *을 분쇄 않도록주의하면서, 스텁의 접착면에 포자를 수집합니다. </li><li> 샘플은 소수의 포자를 포함하는 경우, 이전 단계에 부가하여, 봉투 (~ 1mm 2)의 작은 조각을 잘라내어 새로운 스터브 *에 배치. </li><li> 스퍼터 코터 (섹션 5)로 조직을 놓습니다. </li><li> 주사 전자 현미경 (섹션 6)에서 관찰한다. </li></ol></li></ol> 임계점 건조기를 사용하여 재료 4. 건조 (CPD, 그림 2D) <ol><li> 통풍이 지역의 CPD를 사용하여 시스템의 모든 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 샘플 챔버가 비어하고 깨끗한 있는지 확인합니다. </li><li> 기계에 스위치와 온도 제어 시스템 테스트가 자동으로 수행되는지 확인합니다. CPD는 외부 냉각 조 시스템을 가지고 있다면, 스위칭 전에 수위를 확인에 T. </li><li> 에탄올과 이산화탄소의 교환을 위해서 일반적으로 사용되는 특정 CPD의 제조업체의 지침을 따르십시오. 안전을 위해, 기기의 사용을위한 훈련 사람의 감독 하에서이 단계를 수행한다. 이 급격한 압력 변화에 노출되어 있는지, 그것이 격렬하게 불어 있었다 기억하십시오. </li><li> 샘플을 꺼내 식물 조직과 협력하는 경우 단계 1.3를 계속 oomycetes 낭종 작업하는 경우 2.2 단계, 곰팡이 포자로 작업하는 경우 3.2 단계를 반복합니다. </li></ol> 5. 스퍼터 코팅기 (그림 3a)를 사용하여 골드로 샘플을 코팅 <ol><li> 스퍼터 코터를 확인합니다. 금 음극의 대상이 양호한 상태에 있는지 확인합니다. 필요한 경우 진공 챔버의 벽과 챔버 뚜껑을 청소하는 90 % 에탄올로 젖은 보풀이없는 천을 사용하십시오. </li><li> 현미경 샘플의 추가 식별을 위해 각 스텁 구멍 옆에 숫자 스퍼터 홀더를 표시합니다. 조심스럽게 SAMPL로드 스텁을 배치와 ES를 고정합니다. 불규칙한 표면 시료에 균일 한 코팅을 보장하기 위해 회전 행성 표본 단계를 사용합니다. </li><li> 이러한 작업 거리로 설정을 조정하는 제조업체의 지침에 따라, 운전 가스 압력 (예를 들어, × 10 -1 5-7 × 10 -1 밀리바) (예를 들어, 30mm.), 스퍼터링 시간 (예를 들어, 50의) 금 층 (예를 들어, 12 ㎚) 전류 (예를 들면, 15mA)와 전압 공급 (예를 들어, 600 V) (45)의 두께. </li><li> 스텁을 제거하고 SEM (6 절)에게 가져 가라. 또한, 실리카 겔 (그림 2C)와 밀폐 용기에 스텁을 배치합니다. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig3.jpg" /> 도 3 : 스퍼터 코터 (a) 및 주사 전자 현미경 (b). (a)는 진공 챔버 (왼쪽) 전면보기, 가스 valv전자, 타이머, 진공, 전류 제어합니다. (에서 왼쪽에서 오른쪽으로)을 SEM 주요 구성 요소의 (b)는 측면보기 : 샘플 실, 컨트롤과 컴퓨터 화면, 챔버의 모니터로 진공 열입니다. 사진은 Y. 루이즈 - 레온에 의해 촬영되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 스캐닝 6. 관측 전자 현미경 (SEM, 그림 3b) <ol><li> SEM은 시작 <ol><li> 시작 (식물 2 μm의과 곰팡이 oomycetes 4 μm의를 위해, 예를 들면), 동작 전압 (예를 들어, 15 kV의) 샘플의 높이를 목적 개구 직경 조정은 SEM을 설정하는 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 전자 빔 시스템의 올바른 정렬을 확인하고 축 정렬 및 제조 업체의 지시에 따라 stigmators을 설정합니다. t를 조정그 필드의 적절한 깊이를 얻기 위해 작동 거리. </li></ol></li><li> 이미지 캡처 <ol><li> 샘플의 집광 이미지를 얻고 출발점으로 사용. 최대 수준으로 확대 가까이 증가하고 다시 이미지에 초점을 맞 춥니 다. 같은 구멍으로 표면 요철 영역을 선택합니다. 정확한 난시 및 최적의 명암과 밝기를 조정합니다. </li><li> 고해상도로 SEM 이미지를 캡처. 이미지가 샘플이 청구됩니다 보여줍니다 경우 BSE 검출기를 사용합니다. 그렇지 않으면, SE 감지기를 설정합니다. 제조업체의 지침에 따라 검출기를 변경합니다. </li></ol></li></ol>

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표준 SEM 프로토콜에 대해, 여기에 제시된 절차는 비교적 빠른 따라하기 쉽고, 저렴한 방법 등이 있습니다. 샘플의 양 및 처리의 용이성에 따라, 양호한 품질의 이미지를 획득 4-5 일 걸린다. CPD 및 SEM 작업에 대한 적절한 안전주의 사항을 포함하는 절차는 취급이 용이하다. 특히주의 (1.1.3 및 프로토콜의 2.1.5에 단계 1.1.1 참조) 포르말린과 글루 타르 알데히드에주의해야한다. 샘플 손상 또는 이전 단계를 파괴하지 않고, 필요한 경우, 처리가 장시간 정지시킬 수 있으며, 특정 단계가 (예, 1.1.5, 1.2.3 및 1.3.5 단계)가있다. 비용면에서, 장치의 대부분은 몇 가지 제제 (예, CPD 알루미늄 스터브 용기 홀더)에 재사용 될 수 있고, 시약 비 비싼 화학 모든 상업적인 공급 업체에서 제공된다. 이 절차의 단점은알데히드 류 및 에탄올과 핵심 공급의 부족 및 기술의 제한에 대한 적절한 화학 폐기물의 필요성. 이러한 스...

생물학에서, 주사 전자 현미경을 사용 (SEM)의 구조의 진화, 비교 형태, 장기 개발, 집단 또는 종 (1)의 특성에 관한 연구로 확장되었다. 미세 구조의 두 개의 차원보기와 같은 micromorphology 및 계통 등의 분야는 20 세기 후반 이후 SEM 기술의 발전에서 이익을. 예를 들어, 1970 년대에 스퍼터 코팅 방법의 도입 비 - 전도성 조직 (2) (3)의 영상을 향상 같은 촬영 정점 꽃과 같은 민감한 물질 가능 관찰했다. SEM은 고진공 환경 4 지형 재현 시험편의 표면으로부터 방출 된 전자를 사용한다. SEM과 관련된 연구는 구조적인 문자의 추론과 growt의 재건에 모두 초점을 맞추고있다시간 처리합니다. 새로운 구조적 분류에 관련된 문자 나 유기체의 광범위한 계통은 SEM 관찰 결과로부터 발견되었다. 예를 들어, 식물의 특성은 10, 11, 제대로없이 시각화 할 수없는 나무 5, 오명 다양성 (6), 꿀샘과 꽃 형태 7, 8, trichome 정보 9, 꽃가루 입자의 옷을 입은 피트로, 종의 진단 또는 supraspecific 분류에 사용 SEM. 기존의 SEM 성공적인 관측도 오랜 포르말린 고정 생물 (12)에 대해 달성 된 식물 식물 표본 13 표본. 한편, SEM을 사용하여 성장 과정 재구성 연구는 장기 개발 14 infe 같은 주제의 다양한 참여박테리아 (15), 식물 뿌리의 생리 (16), 기생충 - 호스트 연결 메커니즘 (17), (18), 기생충 (19), mycoparasitism 및 항균 20, 21, 성장 기형 (22), 야생 및 돌연변이 개인 (23)의 비교 개발 및 전체 수명주기에 약물 효과에 의해 유도 ctions 24. 환경 주사 전자 현미경 (ESEM) (25)의 성장 공정에서 습식 생물학적 시료의 관찰 중요한 장점을 가질 수 있지만 섬세한 재료는 아직까지도 ESEM)의 저 진공 상태에서 손상 및 손실을 방지하기 위해 적절하게 처리 할 수있다 의 가치 형태 학적 관찰. 본 논문에서는 세 DIFF의 SEM 관찰을위한 특정 프로토콜의 리뷰샘플 erent 유형이 표시됩니다 : 꽃 분열 조직, oomycetes (Saprolegnia가 번식), 및 곰팡이 소재. 이러한 프로토콜은 특정한 어려움을 대체 해법이 발견 된 이전 SEM 기반 연구 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 경험을 컴파일한다. 비교 식물 발달 및 구조 연구의 경우, SEM의 사용은 1970 (34), (35)에 시작하고, 이후, 연구자들은 특정 꽃의 기능은 이전에 36 생각보다 불안정한 것을 발견했다. 꽃 개발의 재건 젊은 꽃 분열 조직과 개화 사이의 모든 단계의 캡처를 포함한다. 이 목적을 달성하기 위해, ESSE 인샘플 지형 세포벽 무결성 정착 이후의 탈수 후 손상되지 않도록 ntial. 젊은 꽃 분열 조직 세포 벽 붕괴에 특히 취약하다 (도 1A, 1B). 마찬가지로, nectaries에, 꽃잎, 암술과 sporangia와 같은 섬세한 구조는 효과적이고 undamaging 프로토콜을 필요로한다. 이 평가는 SEM 이미징 그대로 젊고 섬세한 조직을 유지하는 최적의 프로토콜을 요약 한 것입니다. 미생물과 식물에서 무척추 동물과 척추 동물 (37)에 이르기까지 호스트와 oomycetes (Stramenopiles) 기생충의 가장 다양하고 광범위한 그룹의 온의 경우, - 성장하고 젖은 환경에서 개발 포자가있다. 포자 표준 SEM 프로토콜에 적합하지 않은 적절한 기판을 필요로하기 때문에이 조건은 SEM 관찰에 대한 도전을 나타냅니다. oomycetes 중 Saprolegnia가 번식 종은 특히 관심있는 그들은 캘리포니아 때문에N aquacultures, 어업 및 수륙 양용 인구 38 심각한 감소를 야기한다. 예컨대 낭종 후크 등뼈 같은 Micromorphological 특성, 감염 제어 및 잠재적 치료 39 설정할 근본적인 Saprolegnia가 번식의 종류를 식별하는 것이 유용한 것으로 밝혀졌다. 여기서, 다른 기판에 낭종 척추 성장의 패턴과 비교하고 임계점 건조기 (CPD) 제조 이후의 SEM 관찰 용 시료를 조작하는 실험 프로토콜이있다. 세 번째 경우에, 버섯 Phellorinia의 herculanea (F)의 포자의 검사 후에 와서 흥미로운 연구 결과가있다. stellata 바. 노바 (주름 버섯 목) 31. 함께 포자로, 예상치 못한 보육 셀 그룹은 SEM에서 확인되었다. 이전의 전통적인 프로토콜 및 치료 재료, 간호사 세포 ou는왔다t 완전히 (그림 1C)을 축소. 포자에 관련된 특정 조직에 대한 자세한 추론은 여기서 설명 (그림 1D) 표준 방식으로 간단하지만 중요한 수정을 할 수있다. 이 리뷰에서의 SEM 관찰과 관련된 다양한 문제를 해결하는 데 사용할 수있는 상세한 SEM 프로토콜이있다 피자 식물, 휴대 붕괴와 분열 조직 축소, 낭종 쪽의 비 최적의 성장, 그리고 파괴 등 oomycetes 및 주름 버섯 목, 각각 임시 조직. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig1.jpg" /> 그림 1 : (A, C)과과 (B, D) 프로토콜 FAA-에탄올 CPD없이 처리 된 샘플의 비교. (A - B) Anacyclus의 clavatus, 중앙 개발의 꽃 봉오리. 버드 사 산화 오스뮴 46 &lt;처리/ SUP&gt; (a) 및 FAA-CPD 프로토콜 (b)로 처리 새싹. (C - D) Phellorinia의 herculanea (F)의 포자와 간호사 세포. stellata. 임의의 처리 (c)없이 여기 주름 버섯 목 (d)에 기술 된 프로토콜로 샘플을 건조. 오렌지 포자. 저울 : (AB) 100 μm의 (CD) 50 μm의. 사진은 Y. 루이즈 - 레온에 의해 촬영되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>특정 공급 업체</td><td></td> 없음 <td>피부 자극, 눈 자극</td></tr><tr><td>알루미늄 스텁</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16221</td><td>www.tedpella.com</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Polaron Quatum Technologies</td><td>CPD7501</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Merck</td><td>1,083,421,000</td><td></td></tr><tr><td>양면 셀로테이프</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>에탄올 절대</td> 특정 <td>공급업체 없음 특정 공급업체 없음</td><td></td><td>가연성</td></tr><tr><td>유럽 세균 한천</td><td>Conda</td><td>1800.00</td><td></td></tr><tr><td>www.condalab.com 여과지</td><td>특정 공급 업체</td><td></td><td></td>겸</tr><tr><td>자</td><td>없음 특정 공급 업체</td><td></td><td></td>포르</tr><tr><td>말린 4 %</td> <td>특정 공급 업체</td><td></td> 없음 <td>유해, 급성 독성, 피부 감작, 발암성. 가연성</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>유리 밀폐 용기&nbsp;</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>글루타르알데히드 25% DC 253857.1611&nbsp; (엘)</td><td>디스마델 S.L.</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>www.dismadel.com Mycological 펩톤</td><td>Conda</td><td>1922.00</td><td>www.condalab.com</td></tr><tr><td>바늘</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>페트리 접시</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>플라스틱 용기</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr> 뚜껑<tr><td>이 있는 샘플 홀더&nbsp; 임계점 건조기용&nbsp;</td><td>테드 펠라, Inc.</td><td>4591</td><td></td></tr><tr><td>www.tedpella.com 메스</td><td>특정 공급 업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>SEM</td><td></td><td></td><td></td>솔루션 A를 위한</tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Hitachi</td><td>S3000N</td><td></td></tr> 소프트웨어<tr><td>: NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution B: Na2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시편 홀더</td> 특정 <td>공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>스퍼터 코팅기</td><td>Balzers</td><td>SCD 004</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>특정 공급업체</td><td></td><td></td>없음</tr><tr><td>투과전자현미경(TEM) 그리드</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>G200(정사각형 메쉬)</td><td>www.emsdiassum.com</td></tr><tr><td>핀셋</td> 특정 <td>공급업체 없음</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (sem) 프로토콜을 스캔

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

주사 전자 현미경 (SEM)으로 관찰 용 생물학적 시료를 처리 일반적인 문제는 세포 붕괴 습식 미세 환경과 세포 파괴로부터의 샘플의 처리를 포함한다. 주사 전자 현미경에서 이미지 캡처를위한 샘플 처리의 주요 과제 중 일부를 극복 여기에 설명되어 섬세한 샘플을 처리하기 위해 특정 프로토콜을 젊은 꽃 조직, 난균 강 낭종 및 예제 등의 곰팡이 포자 (주름 버섯 목) 사용. FAA 고정 꽃 분열 조직은 (포르말린 - 기타 - 아세트산)과 중요 포인트 건조기 (CPD)으로 처리가 세포 벽이나 왜곡 기관을 축소 표시되지 않았습니다. 이러한 결과는 꽃 개발의 재건을 위해 중요하다. 예를 들면 글루 타르 알데하이드로 고정 난균 강 낭종 등의 습식 미세 환경에서 샘플 유사한 CPD 기반 치료, 스와의 다른 유형에 대한 진단 특성의 차이 성장 (예를 들어, 낭종 쪽)을 테스트하는 최적bstrates. 곰팡이 포자 부착 간호사 세포의 파괴는 재수, 탈수 및 CPD 처리, 이러한 세포의 추가 기능 연구를위한 중요한 단계 후 피해야한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 저비용과 성장 과정을 재구성 및 진단 특성을 연구하기 위해 좋은 품질의 이미지의 취득을위한 급속 대안을 나타낸다.

꽃 개발 및 개발의 고정 및 완전 성형 공장 구조 여기에 설명 된 FAA-CPD 프로토콜을 사용하여, 젊고 성숙한 식물 조직은 최적의 고정 및 SEM 이미징 탈수 있습니다. 새싹의 지형과 모양이 축소 세포 (도 1B, 1D,도 4a-F)에 의해 왜곡되지 않기 때문에 이러한 꽃 개발과 같은 프로세스는 복원 할 수 있습니다. 복잡한 형상을 가진 구조물을 성공적으로 도달 달리 부품 (도 4g-I, 5E)의 회복을 가능하게 전도성 재료 (스퍼터 코팅기의 금속)의 균일 한 층으로 피복 될 수있다. 심하게 탈수 및 코팅, (그림 4 층, 5A를,도 5b)을 달성 할 수있는 경우에 사용하는 습식 미세 환경에서 오는 샘플 좋은 품질의 이미지는 전자 전류 과충전합니다. 이러한 꽃가루 벽면 ...

주사 전자 현미경 관찰을 위한 생물학적 샘플 처리의 문제에는 세포 붕괴, 습한 미세 환경의 샘플 처리 및 세포 파괴가 포함됩니다. 꽃 분열 분열체, 난균 낭종 및 곰팡이(Agaricales)와 같은 까다로운 샘플을 준비하는 데 적합한 저렴하고 비교적 빠른 프로토콜이 여기에 컴파일되고 자세히 설명되어 있습니다.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

이 방법론의 목표는 주사 전자 현미경(SEM)에서 최적의 관찰을 위해 식물, 난균류 및 곰팡이의 섬세한 조직을 처리하는 것입니다. 이 방법은 실질적으로 모든 곰팡이, 미생물, 균류 및 감염, 군집 및 숙주에 부착하는 방법에 관한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 개선된 방법론의 기술은 수생 생태계에서 mi-toh-mins가 어디에 있는지 샘플을 고정하는 것입니다.이 기술의 가장 큰 장점은 비싸고 쉽게 사용할 수 있는 리소스를 사용하여 감염의 주요 측면을 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 단계가 기존 프로토콜에서 크게 수정되었기 때문에 매우 중요합니다. 그리고 발표된 방법은 세부 사항 없이 일반적인 절차를 설명합니다.시작하려면 알데히드 필터가 장착된 흄 찬장에서 포르몰과 아세트산 알코올 또는 FAA 고정제를 준비합니다. 70% 변성 에탄올 85부, 60% 포름알데히드 용액 10부, 빙초산 5부. 흄 찬장 아래에서 FAA 재고를 개별 용기에 붓습니다.고칠 꽃 또는 식물 분열 분열을 선택하여 곤충, 곰팡이 또는 극한의 기상 조건에 의해 손상되지 않도록 합니다. 가지를 자르고 원치 않는 물질을 제거한 다음 샘플을 FAA 용액에 즉시 침전시킵니다. 72시간에서 96시간 후, FAA를 화학 물질 처리를 위해 플라스틱 용기에 붓습니다.즉시 신선한 70% 에탄올로 샘플을 세 번 세척하여 잔류 FAA를 제거합니다. 고정 재료는 70% 에탄올에 무기한 저장할 수 있습니다. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 에탄올로 덮인 페트리 접시에 샘플을 해부합니다.바닥을 마른 검은색 실리콘으로 덮은 페트리 접시를 사용하여 대조되는 흰색 조직을 더 잘 볼 수 있습니다. 조직을 별도의 용기로 옮긴 다음 70% 에탄올이 함유된 페트리 접시에 담그십시오. 용기에 뚜껑을 덮고 70% 에탄올이 듬뿍 들어간 플라스틱 원심분리기 튜브에 넣습니다.절개된 물질을 밀폐 용기 또는 원심분리기 튜브의 에탄올 시리즈를 통해 이송합니다. 각 용액에 샘플을 최소 1시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 샘플을 100% 에탄올 용액에 밤새 보관하십시오.에탄올 시리즈에 이어 재료가 담긴 용기를 CPD로 옮깁니다.SEM 샘플 홀더 아래에 샘플 식별 번호를 씁니다. 그런 다음 스텁 상단을 양면 테이프로 덮습니다.스텁을 표본 홀더에 놓습니다. 실체 현미경으로 CPD에서 이미 건조된 젊고 섬세한 샘플이 들어 있는 용기를 조심스럽게 엽니다. CPD 처리 후에는 샘플이 더 가벼워지고 정전기에 민감해진다는 점을 명심하십시오.먼지나 불순물을 피하기 위해 샘플을 꺼낸 후에는 용기를 닫으십시오. 스텁의 끈적 끈적한 표면에 샘플을 놓고 원하는 위치를 미리 계획하십시오. 샘플이 표면에 닿으면 제거하기가 매우 어렵습니다.이 시점에서 대대적인 해부를 시도하지 마십시오. 집기 쉬운 원치 않는 조직을 제거하기만 하면 됩니다. 화분학 연구를 위해 꽃밥을 해부하고 열어 그루터기에 꽃가루를 노출시킵니다.재수화를 방지하기 위해 실리카겔이 있는 밀폐 용기에 샘플을 밤새 보호하십시오. spotter-coater를 사용하여 샘플을 코팅하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SEM으로 전송합니다. 별도의 페트리 접시에서 낭종 척추의 차등 성장을 테스트하려면 0.5ml의 2차 낭종 현탁액을 다른 표면에 넣습니다.표면에는 탄소, 금 및 구리 투과 전자 현미경 그리드가 포함될 수 있습니다. 이전에는 표백된 연어와 메를루사 물고기 비늘, 유리 덮개가 미끄러졌습니다. 낭종을 섭씨 20도에서 70분 동안 배양하면 낭종이 표면에 부착되는 데 유리합니다.액체를 제거하고 낭종을 고정하기 위해 각 표면에 0.5ml의 2%글루타르알데히드를 첨가합니다. 샘플을 1시간 동안 흄 찬장 아래 실온에 보관하십시오. 글루타르알데히드를 제거하고 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수하고 각 에탄올 용액을 5ml씩 15분 동안 첨가합니다.마지막 100% 에탄올 용액에 한 번 넣으면 샘플은 밀봉된 페트리 접시에 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 페트리 접시의 그리드와 스케일을 CPD 그리드 홀더 또는 스태킹 표본 홀더와 같이 샘플을 서로 분리된 상태로 유지하는 CPD에 적합한 홀더로 조심스럽게 옮깁니다. 핀셋으로 그리드와 스케일을 잡고, 낭종이 항상 그리드를 향해야 한다는 점을 명심하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다른 표면에서 난모세포의 거동을 관찰하기 위해 난모세포의 SEM 샘플 준비를 수행하기 전에 CPD를 사용하여 재료를 건조하십시오. 각 샘플을 약 0.5-1제곱센티미터 연필 라벨이 붙은 봉투를 형성하는 여과지로 조심스럽게 감쌉니다. 샘플을 부수지 않도록 주의하십시오.여과지를 종이 클립으로 밀봉합니다. 그런 다음 포장된 샘플을 페트리 접시에 옮기고 10ml의 물에 담가 포자 주변 조직을 재수화합니다. 즉시 샘플을 전자레인지에 넣으십시오.물이 증발하기 시작하면 재료를 제거하고 실온에서 식히십시오. 그런 다음 샘플을 에탄올 시리즈에 통과시킵니다. 샘플의 양에 따라 이 단계에서는 비커 또는 원심분리기 튜브를 사용하십시오.각 용액에 샘플을 15분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 CPD에 배치합니다. SEM 관찰을 위해 포자를 장착하려면 엔벨로프를 엽니다.그런 다음 스텁의 끈적 끈적한 표면으로 포자를 수집하고 부수지 않도록주의하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 샘플의 금 코팅과 SEM 관찰을 수행합니다. 여기에 표시된 것은 오스뮴 테트록사이드로 처리되고 이 비디오에서 시연된 FAA CPD 프로토콜을 사용하여 준비된 anacyclus clavatus의 꽃 봉오리입니다.또한 이 비디오에서 입증된 것처럼 처리된 곰팡이 포자뿐만 아니라 처리하지 않은 phellorinia herculanea의 건조된 샘플도 표시됩니다. 이 그림은 SEM에서 포착된 초기, 중기 및 후기 화훼 발달을 보여줍니다. 이 이미지는 어린 레킴(reh-cim)의 평면도입니다.여기에 표시된 것은 gynesium 분화 중 꽃 봉오리와 anthesis의 꽃입니다. 일부 구조는 SEM에서 이미징을 위해 고정 및 보존하기 어려울 수 있습니다. 예를 들어 습한 환경에서 오는 것, 장식이 있는 것, 인듀멘타가 있는 것 등이 있습니다.여기에 표시된 것은 유리, 탄소, 구리, 금, 메를루사 비늘 및 연어 비늘에 있는 saprolegnia parasitica의 가시의 차별적인 성장 패턴입니다. 이것은 saprolegnia parasitica의 무성 생활 주기를 보여주는 비디오입니다. 무성 생애주기는 이러한 유기체가 수생 또는 습한 환경에서 분산되는 데 중요합니다.더욱이, 이 단계에서 생산된 동물원 스푸어는 saprolegnials목의 기생 종에서 감염의 주요 단위를 나타냅니다. 이 기술을 마스터하면 3일에서 5일 안에 완료할 수 있지만 제대로 수행된 것입니다. 우리는 마드리드의 왕립 식물원(Royal Botanical Garden)에서 이 기간 동안 외부에서 사용할 수 있도록 제공하는 SEM 요법을 완료하기 위해 돈을 사용했습니다.이 비디오를 시청한 후 연구원들은 SEM 관찰을 위해 섬세한 생물학적 물질을 효과적으로 수집하고 고정하는 방법을 알게 될 것입니다. 세포 파괴, 장기 왜곡 또는 습한 환경에서 시료의 잘못된 보존은 이 절차를 통해 쉽게 극복할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 SEM을 통한 관찰은 표면의 고배율 연구로 제한된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.또한 CPD 처리 전에 씰은 충격적인 변화 및 공기와의 직접적인 접촉으로부터 안전하게 보관되어야 합니다. 개발 후, 이 기술은 식물학 분야의 연구자들이 감염 과정, 특히 어업에 관심 있는 종에서 포자 구조를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차에 따라 투과 현미경 또는 TM과 같은 다른 방법을 수행하여 특정 장기나 세포 또는 꽃가루에서 세포 구성의 내부 구조가 어떻게 되어 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.포르말린과 글루타르알데히드를 조작하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 찬장 아래에서 작업하고 마스크, 실험실 가운 및 장갑을 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

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스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

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고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

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목공 딱정벌레의 부속물을 위한 주사 및 투과 전자 현미경의 시료 제조 방법

여기서, 우리는 관심 있는 지역을 표적으로 하기 위하여 직렬 블록 면 및 집중된 이온 광선 주사 전자 현미경 을 능등하게 결합하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 3차원으로 효율적으로 검색하고 넓은 시야에서 드문 이벤트를 찾을 수 있습니다.

직렬 블록 얼굴 및 집중된 이온 빔 검사 전자 현미경 검사법을 사용하여 표적으로 한 연구 결과

여기에서, 우리는 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)를 사용하여 섬세한 조직 견본을 화상 진찰을 위한 상세한 처리 프로토콜을 제시합니다. 세 가지 다른 처리 방법, 즉, hexamethyl disilazana (HMDS) 화학 건조, 간단한 공기 건조 및 임계 점 건조는 각각 경질 계란 껍질, 초기 발달 단계에서 배아 및 곰팡이 배양을 준비하기 위해 설명됩니다.

전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

Micro-CT는 식물 구조를 3차원으로 분석할 수 있는 비파괴 도구입니다. 현재 프로토콜은 기생 식물 구조 및 기능을 분석하기 위해 마이크로 CT를 활용하기 위한 샘플 준비를 설명합니다. 특정 제제와 결합 될 때이 방법의 장점을 강조하기 위해 다른 종이 사용됩니다.

Micro-CT 스캐닝을 활용하여 기생 식물-숙주 상호작용 분석

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

우리는 미생물군 및 생물막과 함께 식물 및 곰팡이 바이오매스를 포함하는 매우 이질적이고 섬세한 샘플을 시각화하기 위한 최적화된 주사 전자 현미경 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜을 사용하면 미생물군 조직의 공간적 차원을 설명할 수 있습니다.

Attine Ants' Gardens의 미생물군: 주사 전자 현미경을 통한 미생물 풍경 시각화

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

배우세요 식물, 난균 및 곰팡이의 섬세한 조직을 SEM 관찰을 위해 준비하는 개선된 고정 프로토콜. 이 방법은 감염 과정의 핵심 측면을 시각화하여 미생물 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

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