문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

이 방법론의 목표는 주사 전자 현미경(SEM)에서 최적의 관찰을 위해 식물, 난균류 및 곰팡이의 섬세한 조직을 처리하는 것입니다. 이 방법은 실질적으로 모든 곰팡이, 미생물, 균류 및 감염, 군집 및 숙주에 부착하는 방법에 관한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 개선된 방법론의 기술은 수생 생태계에서 mi-toh-mins가 어디에 있는지 샘플을 고정하는 것입니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 비싸고 쉽게 사용할 수 있는 리소스를 사용하여 감염의 주요 측면을 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 단계가 기존 프로토콜에서 크게 수정되었기 때문에 매우 중요합니다. 그리고 발표된 방법은 세부 사항 없이 일반적인 절차를 설명합니다.

시작하려면 알데히드 필터가 장착된 흄 찬장에서 포르몰과 아세트산 알코올 또는 FAA 고정제를 준비합니다. 70% 변성 에탄올 85부, 60% 포름알데히드 용액 10부, 빙초산 5부. 흄 찬장 아래에서 FAA 재고를 개별 용기에 붓습니다.

고칠 꽃 또는 식물 분열 분열을 선택하여 곤충, 곰팡이 또는 극한의 기상 조건에 의해 손상되지 않도록 합니다. 가지를 자르고 원치 않는 물질을 제거한 다음 샘플을 FAA 용액에 즉시 침전시킵니다. 72시간에서 96시간 후, FAA를 화학 물질 처리를 위해 플라스틱 용기에 붓습니다.

즉시 신선한 70% 에탄올로 샘플을 세 번 세척하여 잔류 FAA를 제거합니다. 고정 재료는 70% 에탄올에 무기한 저장할 수 있습니다. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 에탄올로 덮인 페트리 접시에 샘플을 해부합니다.

바닥을 마른 검은색 실리콘으로 덮은 페트리 접시를 사용하여 대조되는 흰색 조직을 더 잘 볼 수 있습니다. 조직을 별도의 용기로 옮긴 다음 70% 에탄올이 함유된 페트리 접시에 담그십시오. 용기에 뚜껑을 덮고 70% 에탄올이 듬뿍 들어간 플라스틱 원심분리기 튜브에 넣습니다.

절개된 물질을 밀폐 용기 또는 원심분리기 튜브의 에탄올 시리즈를 통해 이송합니다. 각 용액에 샘플을 최소 1시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 샘플을 100% 에탄올 용액에 밤새 보관하십시오.

에탄올 시리즈에 이어 재료가 담긴 용기를 CPD로 옮깁니다.SEM 샘플 홀더 아래에 샘플 식별 번호를 씁니다. 그런 다음 스텁 상단을 양면 테이프로 덮습니다.

스텁을 표본 홀더에 놓습니다. 실체 현미경으로 CPD에서 이미 건조된 젊고 섬세한 샘플이 들어 있는 용기를 조심스럽게 엽니다. CPD 처리 후에는 샘플이 더 가벼워지고 정전기에 민감해진다는 점을 명심하십시오.

먼지나 불순물을 피하기 위해 샘플을 꺼낸 후에는 용기를 닫으십시오. 스텁의 끈적 끈적한 표면에 샘플을 놓고 원하는 위치를 미리 계획하십시오. 샘플이 표면에 닿으면 제거하기가 매우 어렵습니다.

이 시점에서 대대적인 해부를 시도하지 마십시오. 집기 쉬운 원치 않는 조직을 제거하기만 하면 됩니다. 화분학 연구를 위해 꽃밥을 해부하고 열어 그루터기에 꽃가루를 노출시킵니다.

재수화를 방지하기 위해 실리카겔이 있는 밀폐 용기에 샘플을 밤새 보호하십시오. spotter-coater를 사용하여 샘플을 코팅하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SEM으로 전송합니다. 별도의 페트리 접시에서 낭종 척추의 차등 성장을 테스트하려면 0.5ml의 2차 낭종 현탁액을 다른 표면에 넣습니다.

표면에는 탄소, 금 및 구리 투과 전자 현미경 그리드가 포함될 수 있습니다. 이전에는 표백된 연어와 메를루사 물고기 비늘, 유리 덮개가 미끄러졌습니다. 낭종을 섭씨 20도에서 70분 동안 배양하면 낭종이 표면에 부착되는 데 유리합니다.

액체를 제거하고 낭종을 고정하기 위해 각 표면에 0.5ml의 2%글루타르알데히드를 첨가합니다. 샘플을 1시간 동안 흄 찬장 아래 실온에 보관하십시오. 글루타르알데히드를 제거하고 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수하고 각 에탄올 용액을 5ml씩 15분 동안 첨가합니다.

마지막 100% 에탄올 용액에 한 번 넣으면 샘플은 밀봉된 페트리 접시에 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 페트리 접시의 그리드와 스케일을 CPD 그리드 홀더 또는 스태킹 표본 홀더와 같이 샘플을 서로 분리된 상태로 유지하는 CPD에 적합한 홀더로 조심스럽게 옮깁니다. 핀셋으로 그리드와 스케일을 잡고, 낭종이 항상 그리드를 향해야 한다는 점을 명심하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다른 표면에서 난모세포의 거동을 관찰하기 위해 난모세포의 SEM 샘플 준비를 수행하기 전에 CPD를 사용하여 재료를 건조하십시오. 각 샘플을 약 0.5-1제곱센티미터 연필 라벨이 붙은 봉투를 형성하는 여과지로 조심스럽게 감쌉니다. 샘플을 부수지 않도록 주의하십시오.

여과지를 종이 클립으로 밀봉합니다. 그런 다음 포장된 샘플을 페트리 접시에 옮기고 10ml의 물에 담가 포자 주변 조직을 재수화합니다. 즉시 샘플을 전자레인지에 넣으십시오.

물이 증발하기 시작하면 재료를 제거하고 실온에서 식히십시오. 그런 다음 샘플을 에탄올 시리즈에 통과시킵니다. 샘플의 양에 따라 이 단계에서는 비커 또는 원심분리기 튜브를 사용하십시오.

각 용액에 샘플을 15분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 CPD에 배치합니다. SEM 관찰을 위해 포자를 장착하려면 엔벨로프를 엽니다.

그런 다음 스텁의 끈적 끈적한 표면으로 포자를 수집하고 부수지 않도록주의하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 샘플의 금 코팅과 SEM 관찰을 수행합니다. 여기에 표시된 것은 오스뮴 테트록사이드로 처리되고 이 비디오에서 시연된 FAA CPD 프로토콜을 사용하여 준비된 anacyclus clavatus의 꽃 봉오리입니다.

또한 이 비디오에서 입증된 것처럼 처리된 곰팡이 포자뿐만 아니라 처리하지 않은 phellorinia herculanea의 건조된 샘플도 표시됩니다. 이 그림은 SEM에서 포착된 초기, 중기 및 후기 화훼 발달을 보여줍니다. 이 이미지는 어린 레킴(reh-cim)의 평면도입니다.

여기에 표시된 것은 gynesium 분화 중 꽃 봉오리와 anthesis의 꽃입니다. 일부 구조는 SEM에서 이미징을 위해 고정 및 보존하기 어려울 수 있습니다. 예를 들어 습한 환경에서 오는 것, 장식이 있는 것, 인듀멘타가 있는 것 등이 있습니다.

여기에 표시된 것은 유리, 탄소, 구리, 금, 메를루사 비늘 및 연어 비늘에 있는 saprolegnia parasitica의 가시의 차별적인 성장 패턴입니다. 이것은 saprolegnia parasitica의 무성 생활 주기를 보여주는 비디오입니다. 무성 생애주기는 이러한 유기체가 수생 또는 습한 환경에서 분산되는 데 중요합니다.

더욱이, 이 단계에서 생산된 동물원 스푸어는 saprolegnials목의 기생 종에서 감염의 주요 단위를 나타냅니다. 이 기술을 마스터하면 3일에서 5일 안에 완료할 수 있지만 제대로 수행된 것입니다. 우리는 마드리드의 왕립 식물원(Royal Botanical Garden)에서 이 기간 동안 외부에서 사용할 수 있도록 제공하는 SEM 요법을 완료하기 위해 돈을 사용했습니다.

이 비디오를 시청한 후 연구원들은 SEM 관찰을 위해 섬세한 생물학적 물질을 효과적으로 수집하고 고정하는 방법을 알게 될 것입니다. 세포 파괴, 장기 왜곡 또는 습한 환경에서 시료의 잘못된 보존은 이 절차를 통해 쉽게 극복할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 SEM을 통한 관찰은 표면의 고배율 연구로 제한된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 CPD 처리 전에 씰은 충격적인 변화 및 공기와의 직접적인 접촉으로부터 안전하게 보관되어야 합니다. 개발 후, 이 기술은 식물학 분야의 연구자들이 감염 과정, 특히 어업에 관심 있는 종에서 포자 구조를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차에 따라 투과 현미경 또는 TM과 같은 다른 방법을 수행하여 특정 장기나 세포 또는 꽃가루에서 세포 구성의 내부 구조가 어떻게 되어 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

포르말린과 글루타르알데히드를 조작하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 찬장 아래에서 작업하고 마스크, 실험실 가운 및 장갑을 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.