Name: 새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 균사에 세균 바이오필름 형성을 공촛점 및 전자현미경으로 다중 스케일 분석하는 방법을. 미생물 상호작용과 생태학적 역할 이해에 기여합니다.

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이 연구는 프랑스 국립 연구국(French National Research Agency)의 지원을 받아 ARBRE 연구소(ANR-11-LABX-0002-01), 게놈 과학 프로그램의 식물-미생물 인터페이스 과학 초점 영역, DOE 과학국의 생물 및 환경 연구실(Office of Biological and Environmental Research)의 지원을 받았습니다. Oak Ridge National Laboratory는 DE-AC05-00OR22725 계약에 따라 미국 에너지부의 UT-Battelle, LLC에서 관리합니다.

세균 및 진균 배양 1. 준비 <ol><li> 곰팡이 문화의 준비 <ol><li> 페트리 접시 같은 직경 셀로판 막을 준비하고, 30 분 동안 EDTA (탈 이온수 1g / L)에서 그들을 끓인다. 탈 이온수로 시트를 씻어 두 번을 오토 클레이브. </li><li> 곰팡이 한천을 접종하여 곰팡이 사전 문화를 준비는 EDTA 사전 처리 셀로판 막으로 덮여 적절한 한천 배지에 연결합니다. 콜로니를 지름 약 1cm을 얻기 위해 최적 성장 온도에서 인큐베이션. <ol><li> L. 바이에 S238N 들어 + diNH4 타르트 레이트 0.5 g, KH 2 PO4 1 g, 황산 0.5 g · 7H 2 O, 말토오스 D 5 g 이루어지는 Pachlewski P5 한천 배지 5 일 동안 25 ° C에서 부화 포도당 D + 20 g, 10 % 티아민 염산 1 ㎖, 1 희석 1/10 ml의 미량 원소 용액 (6 g / L 황산 제일철 0.27 g / 리터 몰리브덴 trioxyde; 8.45 g / L 붕산 5 g / L 남자ganese 황산; 5g / L의 구리 황산; 2.27 g / L 황산 아연)의 탈 이온수 1 L로 만들었다; 한천 20g; pH가 5.5. </li></ol></li><li> 진균 예비 배양에서 콜로니의 직경 확장을 촉진 저탄소 한천 배지를 함유하는 EDTA 전처리 셀로판 막으로 덮여 새로운 아가 플레이트에 접종. <ol><li> 페트리 접시를 접종 부드럽게 메스 예비 배양에서 곰팡이 콜로니 (셀이 같은 생리적 상태에 있음)과 새로운 한천 플레이트에 균사를 전송하는 외부 영역을 긁어. </li><li> 새로운 식민지는 직경 약 1cm가 될 때까지 최적 성장 온도에서 품어. L. 바이 컬러의 S238N를 들어, P20 한천 배지 (딘 4 타르트 레이트 0.25 g에 5 일간 25 ° C에서 그들을 품어, KH 2 PO 4 0.5 g, 황산 4 · 7H 2 O 0.25 g, 포도당 D + 1 g을 10 % 티아민 염산 0.5 ㎖; 1/10 희석 미량 용액 (CF 1.1.2 0.5ml를.1) 탈 이온수 1 L로 만들었다; 한천 20g; 산도 5.5). 참고 : 인해 셀로판에 예비 배양, 배양 제는 중앙 플러그 한천 매체를 포함하지 않을 것이다. 이 플러그는 한천과 분석에 편견을 만들 수 있습니다 영양분을 소개하기 때문에 한천 플러그는 생물막의 추가 분석을 위해 제거해야합니다. 만 진균이 단계에 대한 우려 유지 및 한천 플레이트에 전달하고,이 포자 또는 냉동 주식에서 전파되는 곰팡이 필요하지 않습니다되는 종. </li></ol></li></ol></li><li> 세균 배양의 준비 <ol><li> (사용되는 균주에 따라, 또는 임의의 다른 적절한 매질) 액체 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 25 ㎖를 적절한 한천 배지에서 배양 2-3 개별 박테리아 콜로니를 수집하고 접종 멸균 루프를 사용한다. P.가 BBc6을 fluorescens를 들어, 부드러운 흔들림 28 ° C (~ 150 RPM)에서 하룻밤 문화를 품다. 참고 : 변형을 사용하여이 현미경 관찰에 앞서 이중 염색 (곰팡이 및 박테리아)을 수행하기 때문에 이러한 회피 GFP 등의 형광 단백질, 태그, 바람직하다. 타이밍 교반 속도, 배양 온도는 사용 균주 늦은 지수 성장 배양 물을 수득되는 목적에 따라 다르다. </li></ol></li></ol> 곰팡이 식민지에 박테리아의 생체 외 바이오 필름에서 N 2. 준비 <ol><li> 원심 분리기 박테리아 3 분 5,000 XG에 문화와 멸균 0.1 M 인산 칼륨 완충액 (25 g /의 L의 KH 2 PO 4, 2.78 g / LK 2 HPO 4, 산도 5.8) 25 ㎖에 펠렛을 일시 중지합니다. 일단이 단계를 반복하고 같은 버퍼와 109 세포 / ml로 최종 세균 농도를 조정합니다. </li><li> 박테리아 현탁액 (또는 대조군 멸균 0.1 M 인산 칼륨 완충액) 5 ㎖로 6 웰 마이크로 플레이트를 채운다. </li><li> 봉 형님의 셀로판 막 컷멸균 면도날과 등 문화 각 막에 단일 곰팡이 식민지와 셀로판의 사각형을 얻었다. 조심 집게를 사용하여 고체 배지에서 균사 함유 셀로판 사각형 분리 세균 현탁액을 함유하는 마이크로 플레이트의 웰에 셀로판 함유 균사의 제곱 옮긴다. </li><li> 곰팡이의 식민지가 여전히 셀로판에 부착하는 동안 부드럽게 마이크로 흔들어; 다음 접시에 곰팡이 식민지를 떠나 셀로판 시트를 제거합니다. </li><li> 연구 된 미생물에 적합한 온도에서 교반과 (~ 60 RPM)와 마이크로 플레이트를 품어. 주의 : 항온 처리 시간을 분석 할 수있는 바이오 필름과 스테이지의 설정 속도에 의존한다. P.를 들어 BBc6 / L를 fluorescens. 바이 컬러, 초기 단계의 바이오 필름을 얻기 위해 30 분 동안 20 ° C에서 배양 16 시간까지 바이오 필름을 성숙 얻을. </li></ol> 바이오 필름 형식 3. 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 분석이온 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 강한 염 용액 (NaCl을, 17g / L) (17) 5 ㎖로 채워진 새로운 6 웰 마이크로 플레이트에 전송하여 곰팡이를 씻어, 균사에 정전 기적으로 부착 플랑크톤 세균과 박테리아를 제거하려면, 부드럽게 1 분간 흔들어. </li><li> 부드럽게 2 분간 흔들어, 멸균 0.1 M 인산 칼륨 완충액 5 ㎖를 함유하는 새로운 6 웰 마이크로 플레이트에 진균 전송하고 신선한 인산 칼륨 완충액에 곰팡이 옮긴다. </li><li> 얻어진 부분은 진균 콜로니의 절반이 포함되도록, 포타슘 포스페이트 버퍼를 유지하면서 진균 콜로니의 일부를 절단하는 메스 묘화한다. </li><li> 샘플을 염색하기 적합한 형광 염료 (분석의 목표에 따라)을 함유하는 멸균 수로 채워진 페트리 접시로 전송하고, 어둠에서 부화. <ol><li> 진균 네트워크 시각화 예를 들어, 사용 콩고 레드 (0.1 % 최종 COncentration, 배양 5 분) 형석 알렉사 633 (10 μg의 / ml의 최종 농도에 접합, 밀 배아 agglutin (WGA) 렉틴 인큐베이션 10 분) 또는 FUN1 (10 μM 최종 농도, 인큐베이션 10 분). </li><li> 시판되는 수많은 세포 투과 DNA 염료 중에서 DNA 특이 적 형광 프로브 균체 Counterstain과 비 형광 표지 된 세균을 사용하는 경우. 예를 들어, DAPI (0.25 μg의 / ml의 최종 농도, 인큐베이션 10 분)를 사용한다. </li><li> 매트릭스 단백질을 시각화하기 위해, 단백질 얼룩 (21)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 염색 후, 멸균 0.1 M 인산 칼륨 10 ㎖를 함유하는 페트리 접시 뚜껑에 전달함으로써 시료를 씻어 가볍게 1 분간 흔들어. </li><li> 반 페트리 접시 뚜껑에 슬라이드를 잠수함과 섬세 슬라이드 위에 떠하기 위해 절단면을 가지고. 그런 다음 천천히 샘플을 부드럽게 슬라이드에 정착 할 수 있도록 완충 용액에서 슬라이드를 제거합니다. <li> 마지막으로, 샘플 안티 페이드 장착 매체의 10 μL를 추가하고, 유리 커버 슬립으로 커버. 참고 : 슬라이드가 준비되면, 현미경 분석 가능한 빨리 수행되어야한다 (최대 30 분 이내) 생물막 구조에서 변형을 방지한다. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경 분석 <ol><li> 이미징 소프트웨어에 결합 된 10 배 또는 40 배 대물 렌즈와 공 초점 레이저 현미경 슬라이드를 검사합니다. 주 : 여기에서, 멀티 빔 스캐닝 공 초점 현미경 (405), 488, 및 561 nm의 여기 레이저하는 하나로 이루어질 PMT 검출기 및 10X 및 40X 0.3 NA 1.2 NA 목적 장착 사용 하였다. <ol><li> 요청 된 데이터의 유형 및 상기 시간 제약에 적합한 파라미터를 이용하여 촬상을 수행한다. 사용되는 얼룩에 제조업체의 recommendati에 따라 레이저 여기 / 방출 파장을 사용하여기능. 곰팡이 식민지와 바이오 필름의 글로벌 3D 뷰를 얻기 위해 타일 스캔 및 Z-스택 기능의 조합을 사용합니다. 주 : 그림 3의 이미지는 다음 매개 변수를 사용하여 취득한 : 8 비트 / 픽셀, 평균 = 2, = 1.58 마이크로 초는 타일 온라인 스티치 (10 % 적용, 임계 값 = 0.7)와 5 × 5 이미지의 스캔 픽셀 체류를; Z-단계 = 2 μm의. </li></ol></li><li> 3D 데이터 시각화를 들어, 많은 무료 또는 상용 소프트웨어 (이러한 3D 렌더링을위한 많은 옵션을 제공합니다) 중 하나를 사용하십시오. <ol><li> 예를 들어, 시야 채널 빼기 2D 최대 강도 돌기로서 Z 스택 데이터를 디스플레이 밝기와 콘트라스트를 조정하고, 합성 화상을 생성하는 채널을 병합. 이들이 존재하는 경우, Z-스택 말단부에서의 신호없이 슬라이스를 제거한다. 그리고, 2D 최대 강도 투영을 수행 RGB 색에 따라서 변환한다. 이미지의 페이지를 얻기 위해 ImageJ에 소프트웨어 (22)에서 &quot;Z 프로젝트&quot;기능을 사용하여2D 최대 강도 예측에 의해 여기에 분개했다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 전자 현미경 분석 <ol><li> 단계 3.1.2 제외 LSCM 기술 한 바와 같은 샘플을 준비 세정 단계 후 멸균 대신 인산 칼륨 완충액에 생물막을 전송. 이것은 SEM 영상을 교란 할 탈수 단계 동안 염 결정의 형성을 방지한다. </li><li> 샘플 홀더에 바이오 필름을 전송하고 여분의 물을 제거; 샘플 만 다루 물의 작은 펠리클을 허용한다. </li><li> 가변 압력을 주 사형 전자 현미경 (SEM-VP)의 챔버로 시료를 이동; 펠티어 냉각 단계에서 C ° -50로 동결; 그리고 천천히 동결 건조에 직접 SEM 챔버에서 15 시간 동안 설정 변수 압력 100 아빠와 함께 할 수 있습니다. </li><li> 동결 건조 종료 후, 시료를 검색하고 높은 진공 성막 시스템에 옮긴다. platinu 2 nm의 코트 샘플m 아르곤 플라즈마 (2.5 × 10 -2 mbar에서, 35mA)에서 (석영 측정). </li><li> 높은 &quot;렌즈&quot;해상도 검출기 1 kV로의 전자 높은 장력을 이용한 전계 방출 총 (FEG)가 장착 된 SEM으로 피복 된 샘플을 관찰한다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

세균 생물막이 많은 환경에서 검색하고이를 24을 분석하는 방법의 다수의 발전을 선도, 1950 년대부터 연구되고있다. 고전적 방법 정량화하고 모니터 생물막 마이크로 역가 분석하고, 가장 널리 사용되는 방법에있어서, 크리스탈 바이올렛 (CV) 염색을 포함한다. 이러한 방법은 빠르고, 낮은 비용, 및 (25) 처리가 용이하고 전체 생물막 매스 정량화 또는 생존 및 매트릭스 정량 분석을 수행하는 데 특히 유용하다. 타 한편, &quot;오 믹스&quot;방법 생물막 (26), (27)의 양적 및 기능 분석을 허용 또한 생물막 연구에 유용하다. 마이크로 타이 터 플레이트의 장점 및 &quot;오 믹스&quot;방법에도 불구하고, 생물막의 몇몇 중요한 특징은이 프로세스의 완전한 이해를 방해하고,이 기술을 포착 할 수 없다. 이러한 특징은 매트릭스 구조를 포함의, 세균성 식민지 구조, 세포 / 세포 상호 작용 및 바이오 필름의 기능과 형성의 역학 모두를 이해하는 데 중요한 자료이다 식민지 패턴. 이러한 기능을 캡처 현미경의 용량에도 불구하고, 사상균에 세균 바이오 필름의 현미경 분석은 여전히 ​​부족하다. 이것은 종종 두껍고 복잡한 삼차원 네트워크의 콜로니를 형성 사상균의 성장에 주로 기인한다. 곰팡이에 세균 바이오 필름의 형성은 다양한 환경에서 일반적인 상당히 다양한 분야 4 (예를 들어, 의학, 농업, 환경.)에 참여하고있다; 따라서, 자신의 조사를 용이하게 할 수있는 새로운 방법을 개발하는 것이 중요하다. 이를 위해 세균 생물막 현미경 이미징에 매우 얇은 진균 콜로니를 생성하는 방법을 조합. 또, 이러한 질적 생물막을 현미경 분석 도구의 세트를 제안 하였다. 방법의 성공에 의존능력 매우 얇은 균사 콜로니를 제조하고, 적절한 염료를 적용. 이 점은 아래에 설명되어 있습니다. 때문에 바이오 필름의 복잡한 구조로, 그 기능을 이해하는 것은 다중 스케일 방법 (28), (29)을 필요로한다. 바이오 필름, 세균성 식민지 아키텍처 및 매트릭스 구조와 구성의 분포 패턴은 다른 스케일 (즉, 메조 스케일과 마이크로 스케일)에서 분석된다. 또한, 나노 스케일 해상도는 셀 / 셀의 물리적 상호 작용과 매트릭스의 나노 구조에 대한 액세스를 허용한다. 따라서, 현상 방법은 쉽게 진균 콜로니 형성 세균 생물막의 다중 스케일 분석을 가능하게한다. 대부분의 연구에서, LSCM가 마이크로 규모로 제한된다 생물막 분석 일반적으로 광 간섭 단층 (30) (31)에 의해 수행되는 메소 스케일 <sup클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 32. 여기에 제시된 방법은 모두 마이크로 및 메조 스케일이 LSCM에 의해 분석 할 수 있습니다. 이 모두 높은 해상도 (도 3)와 차세대 공 초점 현미경을 사용하여 샘플의 동일한 영역에서조차 동일한 이미지 분석 조합의 유용성을 보여준다. 다른 방법은 여기를 피할 수에 따라서, 컴파일 된 데이터에 연결 문제는 서로 다른 규모에서 모였다. 분석의 조합은 곰팡이 식민지에서 생물막 다시 파티션 병용 개발 바이오 필름을 따라 세균성 식민지 구조, 매트릭스 구조를 접근했다. 메소 스케일 분석 곰팡이 콜로니 (도 2 및 3)에 대한 세균 생물막의 이종의 분포를 보였다. 이러한 관찰은 반드시 전체 식민지를 대표하지 않는 곰팡이 식민지의 작은 부분의 영상을 허용 프로토콜 불가능했을 것입니다. 따라서, 잠시종종 메조 스케일의 분석은 바이오 필름 분포 패턴에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다, 무시. 마지막으로, 현상 방법은, 주사 전자 현미경 등 다양한 현미경 기술을 가진 샘플을 분석하는데 사용될 수있다. 여기서, SEM은 나노 크기에 도달하고, 바이오 필름 내의 세균 공간 조직을 얻기 위해 사용 하였다. SEM은 표면 영상을 허용하면서는, 얇은 곰팡이 식민지 아주 잘 수행. LSCM 대조적으로, SEM은, 그러나, 필요한 샘플 탈수하고, 주로 도전성 금속으로 코팅. 이 탈수 과정이 올바르게 실행되지 않은 경우 생물학적 구조를 변경할 수 및 최적화를 필요로 할 수있다. 여기에, 느린 동결 건조를 사용하여 샘플 탈수 (33)을 사용 하였다. 그럼에도 불구하고, 샘플 LSCM와 SEM을 모두 적용하여 샘플의 동일한 위치에 상관 현미경의 성능을 허용 할 것이다. 장점에도 불구하고위에서 설명한 몇 가지 제한 사항이 존재한다. 첫째, 그것은 곰팡이의 모든 종류에 적용되지 않을 수 있습니다. 실제로,이 방법은 배양 고체 배지의 표면에 방사상으로 확산 진균류 용으로 개발되어있다. 이 방법은 주로 공중 균사를 (예를 들어, 푸사 리움 SP.)을 형성 곰팡이 또는 한천 내에서 주로 확산 마이크로 호기성 곰팡이에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한, 곰팡이의 분해 셀로판도 문제가 될 수있다 (예., 트리코더마 특검팀.). 둘째, 염색 전략이 중요한 시점이며, 얼룩은 바이오 필름을 방해하지 않아야로 얼룩의 선택은 신중하게 이루어져야 것이 중요합니다. 예를 들어, 우리는 CALCOFLUOR 화이트 인해 얼룩의 높은 pH로 (데이터는 도시하지 않음) 것으로 부분 생물막 혼란을 야기한다는 차렸다. 또한, 일부 염료 염색 불균일을 생성 (예., 콩고 레드), 다른 균일 한 염색을 제조하는 동안 (예., WGA 렉틴과 세포벽 염색), 이종 이미지 품질을 제공.또한, 일부 염료가 완전히 특정되지 않을 수도 있음을 인식하는 것이 중요하다. 예컨대, WGA 얼룩뿐만 아니라 진균 세포벽하지만 생물막의 형성 (34), (35) 중 그람 양성 세균과 -negative 제조 그램 양성 세균 세포벽 및 adhesins에도 N- 아세틸 뉴 라민 산. 따라서, 형광 단백질 태그 박테리아를 사용 및 / 또는 곰팡이 여러 얼룩을 방지하는 것이 좋습니다. 다수의 염료가 사용되는 경우, 화학적으로 방해하지 않아야하고, 그 발광 스펙트럼이 서로 겹쳐 있지 않도록하는 것이 필요하다. 메소 스케일 큰 스캔 영역을 필요로 분석하고, 따라서 LSCM 시간 소모적 (40 분 샘플 두께에 따라 시간, 1) 일 샘플의 다수의 분석 병목있다. 그럼에도 불구하고, 조정이 요구되는 데이터의 유형에 따라 제조 될 수있다. 이는 이미지 품질을 변경함으로써 획득 시간 및 이미지 사이즈를 감소시킬 수있다. 예를 들어, 높은 해상도생물막 일반 다시 분할을 분석 할 필요가 없습니다. 마지막으로, 몇 가지 제한은 2D 또는 3D 돌기로서 Z- 스택 데이터를 표시하도록 선택할 때 고려 될 필요가있다. 두 차원 예측은 데이터를 요약하는 좋은 방법이지만, 깊이 정보가 손실되고, 중첩 구조는 숨겨진된다. 한편, 3 차원 예측은 다른 관점에서 시각화를 허용하지만, 종종 공간 복잡성 경우 제대로 렌더링. 결론적 구조 수준에서 균사의 세균 생물막의 특성화하기위한 방법을보고 하였다. 방법론은 다른 애플리케이션으로 확장 될 수있다. 사실,이 방법은 곰팡이 균사에 형성 세균 바이오 필름의 기능 또는 화학적 특성의 성능을 할 수 있습니다. 인해 기존 형광 리포터 시스템의 큰 다양성에 LSCM 분석은 다양한 목적 (29)에 사용될 수있다. 예를 들어, 형광 MICroscopy는 생물막 (37)의 pH 구배 36 분자의 확산을 모니터링하는데 사용될 수있다. 또한,이 방법은 multispecies 생물막에서 사회 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 세균 집단을 대상으로 현장 하이브리드에 형광, 39 multispecies 특정 세균 다시 분할을 공부에 특히 유용하다 (38) 생물막. 마지막으로, 많은 형광 염료는 생물막 (21)의 매트릭스 조성물을 특성화하는데 사용될 수있다. 여기서, 단백질은 이들 기질 단백질 간의 단백질의 넓은 범위, 얼룩 Sypro (도 4)를 사용하여 타겟팅되었지만, 다른 염료 등의 엑소 폴리 사카 라이드 또는 세포 외 DNA 등의 다른 중요한 매트릭스 성분의 시각화를 허용한다. 흥미롭게도, 이러한 모든 분석은 전술 한 방법을 사용하여 메소 규모에서 수행 될 수있다. LSCM가 살아있는 샘플들에 수행 될 수 있으므로,예를 들어, 얇은 진균 콜로니 특히 적합한 챔버를 coverwell 사용 경과 이미징을 달성 할 수있다. 바이오 필름 형성이 복잡하고 역동적 인 과정이기 때문에이 옵션은 특히 흥미 롭다. 마지막으로, 정량적 목적을 위해보고 된 방법은 메소 스케일 이미지에서 정량이 가능하여, 자동 정량 분석의 정확성을 향상시킬 수있다. 이 생물막 이질성과 통계 문제 (29)을 극복 할 수 있습니다.

곰팡이 균은 대부분의 환경에서 지상파 동거 때문에 서로 상호 작용할 수있는 기회가있다. 그들의 다양성과 편재성으로 인해, 이러한 상호 작용은 생명 공학, 농업, 식품 가공, 의학 1, 2 등 많은 생물 분야에서 중요하다. 분자 상호 작용 파트너 사이에서 교환 할 수 있도록 근접 어느 정도 필요하고, 경우에 따라 파트너의 물리적 연합은 상호 작용 3 필요하다. 박테리아와 균류 사이의 일반적인 물리적 협회는 곰팡이 표면 4에 세균 바이오 필름의 형성이다. 박테리아 세포와 곰팡이 균사 간의 직접 접촉은 다양한 생물학적 과정에 관여하는 친밀한 상호 작용을 허용합니다. 예를 들어, 의학의 oppor에 녹농균의 생물막 형성의 연구에서tunistic 곰팡이 병원균 칸디다 알비 칸스는 biofilm 형성 및 독성 (5) 사이의 링크에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 농업에서의 연구는 혼합 된 바이오 필름에 곰팡이와 관련된 때 식물 성장 촉진 rhizobacteria 및 생물 방제 세균이 증가 효율이 좋습니다. 혼합 생물막 6 느타리과 연관된 예를 들어, Bradyrhizobium의 elkanii는 N이 -fixing 활성을 강화하고있다. 마지막으로, 생물학적으로, 세균 곰팡이 혼합 된 바이오 필름은 오염 된 사이트 (7)의 치료, 8 사용되었다. LSCM는 최소 전처리 수화 생물막 생활함으로써 바이오 필름의 구조와 구성을 유지할 입체 관찰 수 있기 때문에 바이오 필름을 연구하기에 특히 적합하다. 따라서, LSCM에 의해 생물막 분석은 특히 탐지하기 위해 매우 유익하다성숙한 생물막의 발전에 접착 단계에서 바이오 필름 형성의 시간 경과와 특징 단계 9, 10의 검출 족제비. 또한, 특히 바이오 필름 구조 매트릭스 (11) (12)를 시각화 또는 생물막 크기 13, 14 계량하도록 구성된다. 이 방법은 곰팡이 사상 식민지에 박테리아 바이오 필름을 공부하고, 비 생물 적 또는 얇은 생물 표면에 생물막을 연구하기에 적합하지만 여전히 매우 도전이다. 사실, 대부분의 사상 균류는 문화의 두께, 복잡한 삼차원 네트워크를 구축 할 수 있습니다. 두꺼운 개체가 초점 현미경에 의해 촬영 될 수있다하더라도, 레이저 투과성의 감쇠 및 형광 방출은 종종 50 내지 15㎛의 깊이를 통해 최종 이미지의 품질을 감소시킨다. 또한, 곰팡이 식민지 경직되지 않기 때문에, 나는t는 생물막을 방해하지 않고 미생물을 처리하기 어렵다. 인해 샘플의 두께, 진균 균사의 세균 생물막의 몇 현미경 분석은 보통 따라서 단 몇 균사 16, 17, 18을 포함하는, 진균 콜로니의 작은 부분에서 수행된다. 이 모든 진균 콜로니 내의 생물막의 이종의 분포의 경우에 대한 분석에 바이어스를 가져올 수있는, 따라서 진균 콜로니에 생물막 분포를 설명 할 수있는 능력을 제한하고. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 우리는 성장 및 진균 균사의 세균 생물막을 분석하는 방법을보고한다. 이 방법은 슈도모나스 ectomycorrhizal 담자균 Laccaria 바이 S238N의 균사에 BBc6을 fluorescens에서 바이오 필름 형성을 연구하기 위해 적용 하였다. 이 두 숲 토양 미생물는 이전에 혼합 형성 설명했다바이오 필름 형상의 구조체들 (19), (20). 이 방법은 더 용이하게 다른 사상 진균 / 박테리아 시스템에 적용될 수있다. 여기에 제시된 방법은 LSCM 및 SEM 촬상 매우 얇은 진균 콜로니의 성장을 허용 진균 배양 방법의 결합에 기초한다. 이 바이오 필름의 질적 특성을 허용, 두 미생물 사이의 상호 작용의 전망을 확장 마이크로 (㎛의 범위)를 획득하고 (mm 범위) 중간 - 우리를 허용. 또한 샘플을 나노 스케일 레벨 (㎚ 범위)에서 바이오 필름의 구조 분석을 허용, SEM으로 관찰 될 수 있다는 것을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>6 웰 팔콘 조직 배양 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-33</td><td>2.2 & 3.1</td></tr><tr><td>콩고 레드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>C580-25</td><td>3.1.4.1</td></tr><tr><td>FUN 1 세포 염색</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F7030</td><td>3.1.4.1</td></tr><tr><td>밀 배아 아글루티닌, 알렉사 플루어 633 접합체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W21404</td><td>3.1.4.1</td></tr> 사용<tr><td></td><td>3.1.4.2</td>프로피듐 요오드화물에 사용되는 <td>DAPI 솔루션</td><td>Thermo Fisher</td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>P3566</td><td>3.1.4.3</td></tr><tr><td>필름트레이서 SYPRO 루비 바이오필름 매트릭스 단백질 염색</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10318</td><td>3.1.4.4에 사용</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 슬라이드 장착 매체</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>3.1.7</td></tr><tr><td>에 사용LSM780 Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>3.2.1</td></tr><tr><td>ZEN 2.1 lite black 소프트웨어에서 사용됨&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>3.2.1</td></tr><tr><td>고진공 코터 Leica EM ACE600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 GeminiSEM-FEG</td><td>Zeiss</td><td></td><td>4 사용</td></tr></tbody></table>

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

세균 바이오 필름이 자주 곰팡이 표면에 형성 및 신진 대사 협력, 경쟁, 또는 포식 수많은 세균 곰팡이 상호 작용 과정에 참여 할 수있다. 바이오 필름의 연구는 환경 과학, 식품 생산, 의학 등 많은 생물 분야에서 중요하다. 그러나, 몇 가지 연구는 부분적으로이를 조사의 어려움, 이러한 세균 바이오 필름에 초점을 맞추고있다. 문헌에 기재된 분석 정량적 생물막위한 방법의 대부분은 비 생물 표면 또는 상피 세포의 단층으로서 균일하고 얇은 생물 표면에 생물막 형성에 대해서만 적합하다. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (LSCM)가 종종 현장 및 생체 생물막으로 분석하는 데 사용되지만 진균 균사의 세균 바이오 필름에 적용 할 때,이 기술로 인해 두께 및 균사 네트워의 입체적으로 매우 도전진다오크. 이러한 단점을 극복하기 위해, 우리는 진균 콜로니의 균사 층의 축적을 제한하는 방식으로 현미경을 조합하는 프로토콜을 개발했다. 이 방법을 사용하여, 우리는 두 LSCM 및 주사 전자 현미경 (SEM)을 이용하여 다수의 규모에서 진균 균사의 세균 바이오 필름의 개발에 대해 조사 할 수 있었다. 이 보고서는 미생물 배양, 세균 바이오 필름의 형성 조건, 생물막 염색 및 LSCM 및 SEM 시각화를 포함하여 프로토콜을 설명합니다.

곰팡이 문화와 생물막 준비의 전체 개략적 인 절차는 그림 1에 제시되어있다. 배양 방법은 우리가 두꺼운 마이크로 및 메소 스케일을 허용 균사 몇 층을 포함하는 20 내지 50 ㎛의은을 사용하여 수화 LSCM 거실 생물막 분석 진균 콜로니를 수득 할 수 있었다. 상기 방법의 적용은 P. 고품질 영상의 획득이 생물막 (- 4,도 2)의 형성에 따라 L. 바이 균사 BBc6에 생물막을 허용 fluorescens. 바이오 필름의 메조 스케일 분석 P.의 바이오 필름의 이종의 분포는 L. 바이 컬러 S238N의 균사 (그림 2, 3)에 BBc6을 fluorescens 보여 주었다. 메소 스케일의 분석은 시간에 따른 바이오 필름 형성의 추적 (도 허용3) 일부 세균 균사 (도 3a에 부착 된 상기 초기 단계)에서) 두꺼운 성숙한 생물막 (도 3b의 형성. 메소 스케일 이미지의 높은 해상도 우리 콜로니 아키텍처 (- D도 3c)을 얻기 위하여 동일한 이미지에 마이크로 스케일의 분석을 수행 할 수 있었다. 특정 라벨과 결합 된 마이크로 스케일의 분석은 바이오 필름의 특성에서 한 단계 더 이동 할 수있게. 여기서, 대부분의 단백질 클래스 라벨 SYPRO 루비 (23)는 상기 샘플들 (도 4)를 도포하고, 매트릭스 단백질의 존재를 도시한다. 마지막으로, 생물막 구조의 자세한 내용은 탈수 및 코팅 (그림 5) 후 동일한 샘플의 SEM 영상에 의해 얻어졌다. SEM 영상 제공나노 레벨로 액세스 따라서, 매트릭스 구조에 대한 액세스를 제공. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig1.jpg"> 그림 1 : 곰팡이 문화와 생물막 준비의 전체 개략적 인 절차. 이 그림은 분석 샘플 미생물 배양에서, 방법의 주요 단계를 설명합니다. 더 자세한 내용은 프로토콜에 제시되어있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig2.jpg"> 그림 2 : 곰팡이 식민지에 BBc6 생물막 재분할. 샘플은 10 배 배율에서 상호 작용의 18 시간 후 몇 군데 있었다. 이미지는 3D 공 촛점 현미경 이미지 2D 최대 강도 투영을 통해 얻었다. figu에 회색 격자다시는 모자이크 위치를 보여줍니다. L. 바이 컬러의 균사 콩고 레드 (빨간색)와 박테리아와 GFP - 태그 (녹색)입니다 염색된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig3.jpg"> 그림 3 : L. 바이 컬러의 균사에 BBc6의 biofilm 형성의 초기와 후기 단계. 이 이미지는 3D 공 촛점 현미경 이미지 2D 최대 강도 투영을 통해 얻었다. 이미징 40X 배율로 수행 하였다. (가) 상호 작용의 2 시간 후 다시 분할을 생물막. 상호 작용의 14 시간 후 (b)는 바이오 필름의 재분할. (c)의 흰색 사각형의 확대 (a). (D)에 흰 사각형의 확대 (b). GFP-TA 곰팡이 균사가 콩고 레드 (빨간색)와 박테리아로 염색되어 있습니다gged (녹색). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig4.jpg"> 그림 4 : L. 바이 컬러의 균사에 BBc6의 바이오 필름의 매트릭스 염색. (a) 상호 작용의 16 시간 후 생물막. (b)의 흰색 사각형의 확대 (a). 이미징 40X 배율에서 수행되고, 이러한 이미지는 3D 공 촛점 현미경 이미지 2D 최대 강도 투영을 통해 얻어졌다. 박테리아는 GFP - 태그 (녹색), 곰팡이가 Fun1 (짙은 녹색)으로 염색되어 있으며, 단백질은 S. 루비 (적색)로 염색된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 5 : L. 바이 컬러의 균사에 BBc6의 바이오 필름의 SEM 영상. SEM 이미징 EHT, 2360X 수행 하였다 1kV의. 촬상 전에, 샘플을 천천히 SEM 챔버 내에서 동결 건조 된 백금 코팅. 녹색 화살표는 세균 바이오 필름을 가리과 노란색 화살표는 곰팡이 균사를 가리 킵니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 현미경을 사용하여 사상 균사에서 박테리아 생물막의 형성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 균사에서 박테리아 생물막이 어떻게 형성되는지, 얼마나 특이적인지, 무엇으로 만들어졌는지와 같은 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 나노미터에서 센티미터 범위에 이르는 여러 규모에서 곰팡이 균사에 대한 박테리아 생물막 형성을 조사할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Cora Miquel Guennoc과 INRA PTEF Platform의 전자 현미경 엔지니어인 Christophe Rose가 수행할 것입니다. 시작하려면 페트리 접시와 같은 직경의 셀로판 멤브레인을 준비한 다음 끓는 EDTA에 30분 동안 넣습니다. 그런 다음 탈이온수를 사용하여 시트를 헹구고 두 번 고압멸균합니다.진균 사전 배양을 준비하려면 EDTA 전처리된 셀로판 막으로 덮인 한천 배지에 진균을 접종합니다. 직경이 약 1cm인 콜로니를 얻기 위해 최적의 온도에서 배양물을 배양합니다. 배양 전에서 메스를 사용하여 배양 전 집락의 외부 영역을 부드럽게 긁어 EDTA 셀로판 막으로 덮인 적절한 한천 배지의 페트리 접시를 접종한 다음 균사를 한천 플레이트로 옮깁니다.콜로니의 직경이 약 1cm가 될 때까지 최적의 온도에서 플레이트를 배양합니다. P.fluorescens BBc6와 같은 박테리아 배양을 준비하려면 멸균 루프를 사용하여 한천 배지에서 2-3개의 개별 박테리아 콜로니를 수집하고 25ml의 LB를 접종합니다. 하룻밤 동안 최적의 온도에서 배양물을 배양합니다. 박테리아를 밤새 성장시킨 후에, 5, 3 분 동안 000 시간 g에 배양물을 원심 분리하십시오.그런 다음 펠릿을 25 밀리리터의 멸균 0.1 몰 인산칼륨 완충액에 현탁시킵니다. 원심분리를 반복한 후 동일한 버퍼를 사용하여 최종 박테리아 농도를 10에서 밀리리터당 9번째 세포로 조정합니다. 6웰 마이크로플레이트에 5ml의 박테리아 현탁액을 채웁니다.멸균 면도날을 사용하여 곰팡이 배양의 셀로판 막을 각 막에 단일 콜로니가 있는 사각형으로 자릅니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 고체 배지에서 균사를 포함하는 셀로판 사각형을 조심스럽게 제거하고 박테리아 현탁액의 개별 웰로 옮깁니다. 곰팡이 군집이 셀로판지에서 분리될 때까지 마이크로플레이트를 부드럽게 흔듭니다.그런 다음 셀로판 시트를 제거하고 플레이트에 곰팡이 군체를 남겨 둡니다. 사용된 균주와 분석할 단계에 따라 섭씨 20도에서 한 시간 동안 부드럽게 교반하여 마이크로플레이트를 배양합니다. P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor의 경우 배양물을 30분 동안 배양하여 초기 단계의 생물막을 얻고 성숙한 생물막의 경우 최대 16시간 동안 배양합니다.플랑크톤 박테리아와 균사에 정전기로 부착된 박테리아를 제거하려면 강한 소금 용액으로 채워진 새로운 6웰 마이크로플레이트로 옮겨 곰팡이를 헹굽니다. 접시를 1분 동안 부드럽게 흔듭니다. 곰팡이를 5ml의 멸균 0.1몰 인산칼륨 완충액이 들어 있는 새로운 6웰 마이크로플레이트로 옮깁니다.플레이트를 2분 동안 부드럽게 흔든 다음 곰팡이를 새 버퍼로 옮깁니다. 곰팡이 군집을 완충 상태로 유지하면서 메스를 사용하여 군체를 약 반으로 자릅니다. 염색할 군집의 절반을 1ml의 멸균수가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고, 적절한 형광 염료를 보충하여 Alexa Fluor 633에 접합된 밀 배아 응집소와 같은 곰팡이 네트워크를 시각화합니다.그런 다음 어두운 곳에서 샘플을 배양합니다. 염색 후 10ml의 멸균 0.1몰 인산칼륨 완충액이 들어 있는 페트리 접시 뚜껑에 샘플을 옮겨 헹구고 1분 동안 부드럽게 흔듭니다. 페트리 접시 뚜껑에 슬라이드를 반쯤 담그고 절단 부분을 슬라이드 위에 떠 있도록 섬세하게 배치합니다.그런 다음 버퍼 용액에서 슬라이드를 천천히 들어 올려 샘플이 슬라이드에 부드럽게 정착하도록 합니다. 가장 섬세한 측면은 슬라이드에서 샘플의 위치입니다. 생물막 설명을 피하려면 샘플을 배치하는 동안 샘플과 슬라이드를 담가야 하며 이미징 전에 샘플을 더 이상 이동해서는 안 됩니다.마지막으로 10마이크로리터의 변색 방지 장착 매체를 샘플에 추가하고 유리 커버 슬립으로 덮습니다. 10x 또는 40x 대물렌즈가 있는 컨포칼 레이저 현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 타일 스캔과 Z-스택 기능을 함께 사용하여 곰팡이 군집과 생물막에 대한 글로벌 3D 보기를 얻을 수 있습니다.전자 현미경을 수행하려면 이전과 같이 강한 소금 용액에 곰팡이를 헹구고 곰팡이를 완충액이 아닌 멸균수로 옮겨 탈수 단계에서 염 결정이 형성되는 것을 방지합니다. 생물막을 샘플 홀더로 옮기고 과도한 물을 제거합니다. 그런 다음 샘플을 가변 압력 주사 전자 현미경의 챔버로 옮깁니다.펠티에 냉각 단계에서 샘플을 섭씨 음의 50도로 동결하여 100파스칼의 가변 압력으로 15시간 동안 설정하여 SEM 챔버에서 직접 천천히 동결 건조할 수 있습니다. 샘플을 회수하여 고진공 필름 증착 시스템으로 옮깁니다. 그런 다음 아르곤 플라즈마 아래에 2나노미터의 백금으로 샘플을 코팅합니다.주사 전자 현미경, 고해상도 렌즈 내 검출기를 사용하는 전계 방출 건, 1kW의 전자 고압으로 코팅된 샘플을 관찰합니다. 이 생물막의 중간 규모 분석은 빨간색으로 표시된 L.bicolor S238N의 균사에서 녹색으로 P.fluorescens BBc6의 생물막의 이질성 분포를 보여줍니다. 분석은 또한 두껍고, 성숙한 biofilm의 대형에 몇몇 GFP에 의하여 표를 붙인 박테리아만 빨간 보인 균사에 붙어 있던 초기 단계에서, 두껍고, 성숙한 biofilm의 대형에 시간에 따라 biofilm 대형의 추적을, 가능하게 했습니다.여기에서 볼 수 있듯이 고해상도 메조 스케일 이미지는 콜로니 아키텍처를 얻기 위해 마이크로 스케일 분석을 수행하는 데에도 사용되었습니다. 또한 이 3D 컨포칼 이미지의 고해상도 2D 최대 강도 투영에서 빨간색으로 표시된 SYPRO Ruby를 사용한 특정 표지는 GFP 표지된 BBc6 박테리아 및 FUN-1 표지된 곰팡이가 짙은 녹색으로 표시된 매트릭스 내 단백질의 존재를 나타냅니다. 동일한 샘플의 탈수 및 코딩 후, SEM 이미징으로 생물막 구조에 대한 추가 세부 정보를 얻었습니다.녹색 화살촉은 생물막의 박테리아 세포를 가리키고 노란색 화살촉은 곰팡이 균사를 가리킵니다. 일단 숙달되면 이 기술은 생물막 형성 및 미생물 배양을 위한 배양 시간을 계산하지 않고 하나의 샘플에 대해 약 2시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 방법의 성공 여부는 몇 개의 균사 층으로만 구성된 매우 얇은 곰팡이 군체를 얻을 수 있는 능력에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 돌연변이 유발 또는 현장 혼성화와 같은 다른 방법을 사용하여 생물막의 기능적 또는 화학적 특성화와 같은 추가 질문에 답하거나 다중 종 생물막을 연구할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의학, 환경 과학, 식품 산업 등과 같은 여러 분야의 연구자들이 곰팡이 박테리아 상호 작용 중 생물막 형성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 곰팡이 균사에서 박테리아 생물막 형성을 성장시키고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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출처: 미켈 게녹, C. 외. 공초점 및 전자현미경을 이용한 섬유성 곰팡이 군락의 박테리아 바이오필름 정성적 다척도 분석에 관한 새로운 방법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 콜로판 형성과 방사형 성장을 지원하기 위해 처리된 셀로판 막 위에 곰팡이 배양물을 준비하는 과정을 보여줍니다. 그 후 상호작용 분석에 대한 토양 박테리아 세포의 배양 및 준비 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 박테리아 세포가 곰팡이 집락에 어떻게 부착하여 바이오필름을 형성하는지를 보여주어 박테리아-곰팡이 간 상호작용 연구를 가능하게 합니다.

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