새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

이 프로토콜의 전반적인 목표는 현미경을 사용하여 사상 균사에서 박테리아 생물막의 형성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 균사에서 박테리아 생물막이 어떻게 형성되는지, 얼마나 특이적인지, 무엇으로 만들어졌는지와 같은 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 나노미터에서 센티미터 범위에 이르는 여러 규모에서 곰팡이 균사에 대한 박테리아 생물막 형성을 조사할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Cora Miquel Guennoc과 INRA PTEF Platform의 전자 현미경 엔지니어인 Christophe Rose가 수행할 것입니다. 시작하려면 페트리 접시와 같은 직경의 셀로판 멤브레인을 준비한 다음 끓는 EDTA에 30분 동안 넣습니다. 그런 다음 탈이온수를 사용하여 시트를 헹구고 두 번 고압멸균합니다.

진균 사전 배양을 준비하려면 EDTA 전처리된 셀로판 막으로 덮인 한천 배지에 진균을 접종합니다. 직경이 약 1cm인 콜로니를 얻기 위해 최적의 온도에서 배양물을 배양합니다. 배양 전에서 메스를 사용하여 배양 전 집락의 외부 영역을 부드럽게 긁어 EDTA 셀로판 막으로 덮인 적절한 한천 배지의 페트리 접시를 접종한 다음 균사를 한천 플레이트로 옮깁니다.

콜로니의 직경이 약 1cm가 될 때까지 최적의 온도에서 플레이트를 배양합니다. P.fluorescens BBc6와 같은 박테리아 배양을 준비하려면 멸균 루프를 사용하여 한천 배지에서 2-3개의 개별 박테리아 콜로니를 수집하고 25ml의 LB를 접종합니다. 하룻밤 동안 최적의 온도에서 배양물을 배양합니다. 박테리아를 밤새 성장시킨 후에, 5, 3 분 동안 000 시간 g에 배양물을 원심 분리하십시오.

그런 다음 펠릿을 25 밀리리터의 멸균 0.1 몰 인산칼륨 완충액에 현탁시킵니다. 원심분리를 반복한 후 동일한 버퍼를 사용하여 최종 박테리아 농도를 10에서 밀리리터당 9번째 세포로 조정합니다. 6웰 마이크로플레이트에 5ml의 박테리아 현탁액을 채웁니다.

멸균 면도날을 사용하여 곰팡이 배양의 셀로판 막을 각 막에 단일 콜로니가 있는 사각형으로 자릅니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 고체 배지에서 균사를 포함하는 셀로판 사각형을 조심스럽게 제거하고 박테리아 현탁액의 개별 웰로 옮깁니다. 곰팡이 군집이 셀로판지에서 분리될 때까지 마이크로플레이트를 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 셀로판 시트를 제거하고 플레이트에 곰팡이 군체를 남겨 둡니다. 사용된 균주와 분석할 단계에 따라 섭씨 20도에서 한 시간 동안 부드럽게 교반하여 마이크로플레이트를 배양합니다. P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor의 경우 배양물을 30분 동안 배양하여 초기 단계의 생물막을 얻고 성숙한 생물막의 경우 최대 16시간 동안 배양합니다.

플랑크톤 박테리아와 균사에 정전기로 부착된 박테리아를 제거하려면 강한 소금 용액으로 채워진 새로운 6웰 마이크로플레이트로 옮겨 곰팡이를 헹굽니다. 접시를 1분 동안 부드럽게 흔듭니다. 곰팡이를 5ml의 멸균 0.1몰 인산칼륨 완충액이 들어 있는 새로운 6웰 마이크로플레이트로 옮깁니다.

플레이트를 2분 동안 부드럽게 흔든 다음 곰팡이를 새 버퍼로 옮깁니다. 곰팡이 군집을 완충 상태로 유지하면서 메스를 사용하여 군체를 약 반으로 자릅니다. 염색할 군집의 절반을 1ml의 멸균수가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고, 적절한 형광 염료를 보충하여 Alexa Fluor 633에 접합된 밀 배아 응집소와 같은 곰팡이 네트워크를 시각화합니다.

그런 다음 어두운 곳에서 샘플을 배양합니다. 염색 후 10ml의 멸균 0.1몰 인산칼륨 완충액이 들어 있는 페트리 접시 뚜껑에 샘플을 옮겨 헹구고 1분 동안 부드럽게 흔듭니다. 페트리 접시 뚜껑에 슬라이드를 반쯤 담그고 절단 부분을 슬라이드 위에 떠 있도록 섬세하게 배치합니다.

그런 다음 버퍼 용액에서 슬라이드를 천천히 들어 올려 샘플이 슬라이드에 부드럽게 정착하도록 합니다. 가장 섬세한 측면은 슬라이드에서 샘플의 위치입니다. 생물막 설명을 피하려면 샘플을 배치하는 동안 샘플과 슬라이드를 담가야 하며 이미징 전에 샘플을 더 이상 이동해서는 안 됩니다.

마지막으로 10마이크로리터의 변색 방지 장착 매체를 샘플에 추가하고 유리 커버 슬립으로 덮습니다. 10x 또는 40x 대물렌즈가 있는 컨포칼 레이저 현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 타일 스캔과 Z-스택 기능을 함께 사용하여 곰팡이 군집과 생물막에 대한 글로벌 3D 보기를 얻을 수 있습니다.

전자 현미경을 수행하려면 이전과 같이 강한 소금 용액에 곰팡이를 헹구고 곰팡이를 완충액이 아닌 멸균수로 옮겨 탈수 단계에서 염 결정이 형성되는 것을 방지합니다. 생물막을 샘플 홀더로 옮기고 과도한 물을 제거합니다. 그런 다음 샘플을 가변 압력 주사 전자 현미경의 챔버로 옮깁니다.

펠티에 냉각 단계에서 샘플을 섭씨 음의 50도로 동결하여 100파스칼의 가변 압력으로 15시간 동안 설정하여 SEM 챔버에서 직접 천천히 동결 건조할 수 있습니다. 샘플을 회수하여 고진공 필름 증착 시스템으로 옮깁니다. 그런 다음 아르곤 플라즈마 아래에 2나노미터의 백금으로 샘플을 코팅합니다.

주사 전자 현미경, 고해상도 렌즈 내 검출기를 사용하는 전계 방출 건, 1kW의 전자 고압으로 코팅된 샘플을 관찰합니다. 이 생물막의 중간 규모 분석은 빨간색으로 표시된 L.bicolor S238N의 균사에서 녹색으로 P.fluorescens BBc6의 생물막의 이질성 분포를 보여줍니다. 분석은 또한 두껍고, 성숙한 biofilm의 대형에 몇몇 GFP에 의하여 표를 붙인 박테리아만 빨간 보인 균사에 붙어 있던 초기 단계에서, 두껍고, 성숙한 biofilm의 대형에 시간에 따라 biofilm 대형의 추적을, 가능하게 했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 고해상도 메조 스케일 이미지는 콜로니 아키텍처를 얻기 위해 마이크로 스케일 분석을 수행하는 데에도 사용되었습니다. 또한 이 3D 컨포칼 이미지의 고해상도 2D 최대 강도 투영에서 빨간색으로 표시된 SYPRO Ruby를 사용한 특정 표지는 GFP 표지된 BBc6 박테리아 및 FUN-1 표지된 곰팡이가 짙은 녹색으로 표시된 매트릭스 내 단백질의 존재를 나타냅니다. 동일한 샘플의 탈수 및 코딩 후, SEM 이미징으로 생물막 구조에 대한 추가 세부 정보를 얻었습니다.

녹색 화살촉은 생물막의 박테리아 세포를 가리키고 노란색 화살촉은 곰팡이 균사를 가리킵니다. 일단 숙달되면 이 기술은 생물막 형성 및 미생물 배양을 위한 배양 시간을 계산하지 않고 하나의 샘플에 대해 약 2시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 방법의 성공 여부는 몇 개의 균사 층으로만 구성된 매우 얇은 곰팡이 군체를 얻을 수 있는 능력에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 돌연변이 유발 또는 현장 혼성화와 같은 다른 방법을 사용하여 생물막의 기능적 또는 화학적 특성화와 같은 추가 질문에 답하거나 다중 종 생물막을 연구할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의학, 환경 과학, 식품 산업 등과 같은 여러 분야의 연구자들이 곰팡이 박테리아 상호 작용 중 생물막 형성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 곰팡이 균사에서 박테리아 생물막 형성을 성장시키고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.