자세한 공간 식지도에서 동적 식 데이터의 시간적 순서

이 실험 절차의 전반적인 목표는 고정 조직 샘플링을 사용하여 척추동물 분할 시계의 시공간 유전자 발현 역학을 매핑하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 presomitic 중배엽에서 진동 유전자 역학을 편견 없이 평가할 수 있으며, 이는 척추동물 체형성을 지배하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 샘플을 동시에 생성하고 처리할 수 있어 고정 조직에서 유전자 발현 역학을 3부분으로 분석할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 전 박사후 연구원인 Charlotte Bailey 박사입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 쥐의 자궁 뿔을 얻은 후, 실체 현미경으로 구부러진 가위를 사용하여 자궁 뿔의 두꺼운 근육막을 자르고 각 배아를 조심스럽게 추출합니다. 구부러진 가위와 가는 집게를 사용하여 각 배아에서 양막을 해부합니다.

그런 다음 수술용 바늘이나 구부러진 가위를 사용하여 배아를 뒤쪽 사지 새싹 앞쪽으로 잘라 각 배아에서 꼬리 조직을 적출합니다. 꼬리 조직의 복부 쪽이 아래로 향하도록 균형을 잡습니다. 그런 다음 바늘로 부드럽게 흔드는 동작을 사용하여 꼬리 조직을 정중선을 따라 두 개의 반으로 절개하여 PSM 외식목 쌍을 생성합니다.

신경관, 노토코드 및 PSM 조직이 두 외식부위 간에 균등하게 나뉘어져 있는지 확인합니다. 그런 다음 소량의 예열 배양 배지에 35mm 플라스틱 배양 접시 뚜껑의 아래쪽에 각 반대쪽 PSM 외식식을 피펫으로 넣습니다. 접시를 뚜껑 위에 놓고 빠르게 뒤집어 PSM 조직이 배지 한 방울로 뚜껑에 매달려 있도록 합니다.

그런 다음 PSM 외식식물을 섭씨 37도의 가습 챔버에서 1-2시간 동안 배양합니다. PSM 외식용 쌍을 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 PBS의 파라포름알데히드 4%를 샘플에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 하룻밤 동안 배양합니다.

배양 후 PBS를 사용하여 흔들리는 플랫폼에서 실온의 샘플 웰을 세척합니다. 미세한 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플의 PBS 용액을 3-4회 교환합니다. 면역조직화학을 수행하기 위해 각 배아 쌍에서 하나의 PSM 외식에 PBS의 2%Triton X-100을 추가하고 샘플을 흔들 플랫폼에서 실온에서 1시간 동안 배양하여 세척합니다.

PBS를 사용하여 샘플을 잠시 헹굽니다. 그런 다음 PBS를 차단 용액으로 교체하고 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 밤새 샘플을 배양합니다. 작동하는 완충액을 사용하여 원하는 1차 항체를 희석합니다.

이 예에서는 Delta-like 1 및 Notch1에 대한 항체가 1:25의 희석으로 사용됩니다. 외식세포에 항체를 추가하고 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 3-5일 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 PBS를 사용하여 각각 5-10분 동안 샘플을 두 번 세척합니다.

그런 다음 PBS의 0.3% Triton X-100을 흔들 플랫폼에서 실온으로 3회 세척합니다. 작업 완충액에서 2차 항체를 희석한 후 항체 응집체를 포함할 수 있는 마지막 몇 마이크로리터의 용액을 사용하지 않도록 주의하면서 각 샘플 웰에 250-500마이크로리터의 항체 용액을 추가합니다. 주석 호일로 플레이트를 덮고 3-5일 동안 섭씨 4도의 어둠 속에서 2차 항체 용액에 샘플을 배양합니다.

배양 후 PBST를 사용하여 각각 10분씩 두 번씩 샘플을 세척합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 실온의 흔들 플랫폼에서 5분 동안 조직을 한 번 씻습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 에탄올 PBST 희석 시리즈를 통해 나머지 반대쪽 PSM 이식을 탈수 및 재수화합니다.

0.1%PBST에 1밀리리터당 10마이크로그램의 Proteinase K를 외식에 첨가하고 5분 동안 교반 없이 조직을 배양합니다. 그런 다음 Proteinase K 용액을 빠르게 제거하고 PBST를 사용하여 샘플을 간단히 헹굽니다. PBST의 포름알데히드 4%와 글루타르알데히드 0.1%를 PSM 식물에 첨가하여 후붙이를 추가하고 샘플을 30분 동안 배양합니다.

그 때, PBST를 사용하여 10 분 동안 표본을 두번 세척하기 위하여 후에, 조직에 50%hybridization 혼합물을 추가하고 10 분 동안 동요 없이 65 °C에 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플과 혼성화 혼합물을 배양한 후, 용액을 제거하고 알려진 분할 클록 성분에 대해 digoxigenin 표지 안티센스 RNA 프로브를 포함하는 0.25 - 0.5 밀리리터의 예열 혼성화 믹스를 추가합니다. 접착 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉하고 섭씨 65도에서 2박 동안 샘플을 배양합니다.

배양 다음, TBST에 있는 pre-warmed 50%hybridization 15 분 동안 표본을 세척하기 위하여 혼합물을 이용하십시오. 그런 다음 TBST를 사용하여 샘플을 두 번 헹구고 TBST의 조직을 실온의 흔들 플랫폼에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 최소 2시간 동안 차단 용액에서 외식을 사전 배양합니다.

그런 다음 용액을 HRB 접합 항 디곡시제닌 항체의 1:200 희석을 포함하는 새로운 차단 용액으로 교체합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, TBST를 사용하여 실온에서 샘플을 세 번 헹구고 새로운 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.

그런 다음 TBST로 외식식물을 각각 1시간씩 3회 씻습니다. 이미징을 위해 샘플을 준비하기 전에 티라마이드 신호 증폭 키트를 사용하여 검출된 mRNA를 시각화합니다. 0.12mm 두께의 이미징 스페이서에서 접착 라이너를 제거하고 유리 슬라이드에 붙여서 각 외식 쌍에 대해 하나의 충전된 접착 유리 슬라이드를 준비합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 슬라이드에 한 쌍 또는 외식물을 배치한 후 조직이 완전히 건조되지 않고 끈적하고 반투명하게 보이기 시작할 때까지 샘플이 슬라이드에 부착되도록 45-60초 동안 허용합니다. 그 동안 집게를 사용하여 스페이서에 남아 있는 접착 라이너를 제거하고 이중 기능 장착 매체 및 투명 용액을 스페이서 중앙에 있는 샘플에 크게 떨어뜨립니다. 샘플 전체에 원형 커버슬립을 적용하여 장착 매체가 고르게 분포되고 모든 가장자리가 스페이서와 접촉하도록 합니다.

그런 다음 보푸라기가 적은 종이 위에 커버슬립 슬라이드를 거꾸로 놓습니다. 아래로 세게 눌러 커버슬립이 스페이서에 완전히 부착되고 과도한 장착 매체가 제거되었는지 확인합니다. 더 이상 장착 매체가 용지를 더럽히지 않을 때까지 이 과정을 반복합니다.

슬라이드를 청소하고 라벨을 붙인 다음 이미징할 때까지 어두운 곳에 보관하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 이미징 및 분석을 수행합니다. 이 실험에서 Delta-Like 1 및 Notch1 단백질 발현은 각 외식 쌍의 절반에서 검출된 Notch regulated segmentation clock gene intronic lunatic fringe의 초기 전사에 따라 배아를 임시로 배열하여 동기화에서 벗어나 진동하는 것으로 나타났습니다.

패널은 segmentation clock cycle의 1단계, 2단계 및 3단계에 따라 배열됩니다. PSM의 전후 축을 따라 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe에 대한 발현 영역의 범위는 색상으로 구분된 막대로 구분됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이 PSM의 전후 축과 관련하여 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe 신호 강도를 정량화하기 위해 플롯이 생성되고 clock cycle 전반에 걸쳐 PSM의 축 변동 및 신호 강도를 보여줍니다.

Kymographs는 수많은 PSM에서 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe의 공간 분포를 시각화합니다. 카이모그래프의 각 행은 개별 PSM explant의 신호 강도를 나타냅니다. PSM의 전후 축과 관련하여 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe 신호 강도를 정량화하면 이러한 표적에 대한 명확한 진동 발현 역학이 나타납니다.

마지막으로, 이러한 카이모그래프는 수많은 PSM에 걸쳐 Notch 수용체 NICD, Delta-Like 1, intronic lunatic fringe 및 Notch1의 절단되고 활성화된 형태의 공간 분포를 보여줍니다. 이 기술은 척추동물의 유사분열 분야의 연구자들이 병아리와 쥐의 presomitic mesoderm에서 분할 유전자 진동 역학을 더 잘 이해하는 데 도움이 되었습니다. 이 기술을 마스터하면 많은 수의 샘플에 대해 이 기술을 수행할 수 있으므로 여러 mRNA와 관심 단백질의 발현 프로파일을 동시에 분석할 수 있습니다.

이 절차에 따라 이미지 데이터를 추가로 정량화하면 유전자 발현의 시간적 지연에 대한 이해뿐만 아니라 연구자가 관심을 갖는 RNA 및 단백질 신호의 세포 내 국소화에 대한 이해를 제공할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 두꺼운 조직 샘플링을 사용하여 척추동물 분할 시계의 시공간 유전자 발현 역학을 매핑하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그 다음에는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 자동화된 이미지 분석이 수행될 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 PSM 이식 간에 PSM, 노토코드 및 신경관이 균등하게 분포되도록 하고 시작하기 전에 항체 희석을 신중하게 최적화하는 것이 중요합니다. 포름아미드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 기억하십시오. 개인 보호 장비를 착용하고 해당되는 경우 배기 후드에서 작업할 때 주의하십시오.