자세한 공간 식지도에서 동적 식 데이터의 시간적 순서

본 실험 절차의 전반적인 목표는 고정 조직 샘플링을 사용하여 척추동물 분절 시계의 시공간적 유전자 발현 역학을 매핑하는 것입니다. 이 방법은 전분절 중배엽에서 진동하는 유전자 역학을 편향 없이 평가할 수 있게 하며, 이는 척추동물 체절 형성을 조절하는 분자적 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 샘플을 동시에 생성하고 처리할 수 있어, 고정 조직 내 유전자 발현 역학에 대한 고해상도의 3부 분석이 가능하다는 점입니다.

시연은 제 실험실의 전 포스트닥터인 Charlotte Bailey 박사가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스 자궁각을 적출한 후, 실체 현미경 하에서 곡선 가위(curved scissors)를 사용하여 자궁각의 두꺼운 근육막을 절개하고 각 배아를 조심스럽게 추출합니다. 곡선 가위와 미세 핀셋을 사용하여 각 배아에서 양막을 박리합니다.

그 다음, 수술용 바늘이나 곡선 가위를 사용하여 뒷다리 싹(limb buds)의 앞쪽에서 배아를 절단함으로써 각 배아의 꼬리 조직을 채취합니다. 꼬리 조직의 복측이 아래로 향하도록 균형을 맞춥니다. 그런 다음 바늘을 이용해 부드럽게 흔드는 동작으로 꼬리 조직을 정중선을 따라 두 반으로 분리하여 PSM 외식편(explant) 쌍을 생성합니다.

신경관, 척삭 및 PSM 조직이 두 개의 외식편 사이에 균등하게 나누어졌는지 확인하십시오. 그다음, 각 대측 PSM 외식편을 소량의 예열된 배양액과 함께 35mm 플라스틱 배양 접시 뚜껑의 안쪽 면에 피펫으로 분주합니다. 접시를 뚜껑 위에 올린 후 빠르게 뒤집어, PSM 조직이 배양액의 매달린 방울(hanging drop) 형태로 뚜껑에 매달려 있게 합니다.

그다음 PSM 절편을 습윤 챔버 내 37 °C에서 1~2시간 동안 배양합니다. PSM 절편 쌍을 24-웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 샘플에 PBS에 희석된 4% paraformaldehyde를 첨가하고, 플레이트를 상온에서 1시간 동안 또는 로킹 플랫폼 위 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

배양 후, 로킹 플랫폼 위에서 실온 상태의 PBS를 사용하여 샘플 웰을 세척합니다. 미세 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플의 PBS 용액을 3~4회 교체합니다. 면역조직화학 염색을 수행하려면, 각 배아 쌍의 PSM 절편 하나에 PBS 내 2% Triton X-100을 첨가하고, 로킹 플랫폼 위에서 실온으로 1시간 동안 배양하여 세척합니다.

PBS를 사용하여 시료를 빠르게 헹굽니다. 그 다음 PBS를 블로킹 용액으로 교체하고, 摇동 플랫폼 위에서 4°C로 시료를 하룻밤 동안 배양합니다. 워킹 버퍼를 사용하여 원하는 1차 항체를 희석합니다.

본 예시에서는 Delta-like 1 및 Notch1에 대한 항체를 1:25 비율로 희석하여 사용합니다. 항체를 절편에 첨가하고, 4°C의 로킹 플랫폼에서 3~5일 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후, PBS를 사용하여 샘플을 5~10분씩 2회 세척합니다.

그런 다음, 쉐이킹 플랫폼(rocking platform) 위에서 실온의 0.3% Triton X-100 PBS로 3회 세척합니다. 워킹 버퍼(working buffer)로 2차 항체를 희석한 후, 각 샘플 웰에 250-500 µL의 항체 용액을 첨가합니다. 이때 항체 응집물이 포함되어 있을 수 있는 용액의 마지막 몇 µL는 사용하지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 2차 항체 용액이 담긴 샘플을 4 °C의 암소에서 3~5일 동안 배양합니다.

배양 후, PBST를 사용하여 샘플을 10분씩 2회 세척합니다. 그런 다음, 쉐이킹 플랫폼 위에서 상온의 PBS로 조직을 5분 동안 1회 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 따라, 에탄올 PBST 희석 시리즈를 통해 나머지 반대편 PSM 외식편을 탈수 및 재수화합니다.

0.1% PBST에 희석된 10 µg/mL의 Proteinase K를 외식편에 첨가하고, 교반 없이 5분 동안 배양합니다. 그 후 Proteinase K 용액을 빠르게 제거하고 PBST를 사용하여 샘플을 짧게 헹굽니다. PSM 외식편에 4% formaldehyde와 0.1% glutaraldehyde가 포함된 PBST를 첨가하여 후고정하고 샘플을 30분 동안 배양합니다.

그런 다음, PBST를 사용하여 샘플을 10분씩 두 번 세척한 후, 조직에 50% hybridization mix를 첨가하고 65 °C에서 교반 없이 10분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플과 hybridization mix를 배양한 후, 용액을 제거하고 알려진 segmentation clock 성분에 대한 digoxigenin 표지 antisense RNA probe가 포함된 예열된 hybridization mix 0.25~0.5 mL를 첨가합니다. 접착 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉하고 샘플을 65 °C에서 이틀 밤 동안 배양합니다.

배양 후, TBST에 희석된 예열된 50% hybridization mix를 사용하여 샘플을 15분 동안 세척합니다. 그다지 TBST를 사용하여 샘플을 두 번 헹군 후, 실온의 rocking platform에서 조직을 TBST에 넣고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 절편을 blocking solution에 최소 2시간 동안 사전 배양합니다.

그런 다음 용액을 1:200으로 희석한 HRB 결합 anti-digoxigenin 항체가 포함된 신선한 블로킹 용액으로 교체합니다. 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 TBST를 사용하여 샘플을 3회 세척하고 새로운 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.

그 다음 TBST를 사용하여 외식편을 1시간씩 세 번 세척합니다. 이미징을 위해 샘플을 준비하기 전, tyramide signal amplification kit를 사용하여 검출된 mRNA를 시각화합니다. 0.12 mm 두께의 이미징 스페이서에서 접착 라이너를 제거하여 유리 슬라이드에 부착함으로써, 각 외식편 쌍에 대해 전하 처리된 접착 유리 슬라이드 하나를 준비합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 한 쌍의 외식편(explants)을 슬라이드 위에 배치한 후, 조직이 완전히 마르지 않으면서 끈적거리고 반투명하게 보이기 시작할 때까지 45-60초 동안 샘플을 슬라이드에 부착시킵니다. 그동안 핀셋을 사용하여 스페이서에서 남은 접착 라이너를 제거하고, 스페이서 중앙의 샘플에 이중 기능 마운팅 매질 및 투명화 용액(dual function mounting medium and clearing solution)을 크게 한 방울 떨어뜨립니다. 마운팅 매질이 고르게 분포되고 모든 가장자리가 스페이서에 접촉하도록 확인하며 샘플 위에 원형 커버슬립을 덮습니다.

그런 다음 커버슬라이드를 보푸라기가 적은 종이 위에 뒤집어서 놓습니다. 커버슬라이드가 스페이서에 완전히 밀착되고 과도한 봉입제가 제거되도록 단단히 누릅니다. 종이에 봉입제가 더 이상 묻어 나오지 않을 때까지 이 과정을 반복합니다.

슬라이드를 세척하고 라벨을 부착한 뒤, 이미징 전까지 암소에 보관하십시오. 그 후 텍스트 프로토콜에 따라 이미징 및 분석을 수행합니다. 본 실험에서는 각 절편 쌍의 한쪽 절반에서 검출된 Notch 조절 분절 시계 유전자인 intronic lunatic fringe의 초기 전사에 따라 배아를 일시적으로 배열함으로써, Delta-Like 1 및 Notch1 단백질 발현이 비동기적으로 진동함을 보여줍니다.

패널은 분절 시계 주기의 1단계, 2단계 및 3단계에 따라 배열되어 있습니다. PSM의 전후축을 따라 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe의 발현 영역 범위가 색상으로 구분된 막대로 표시되어 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, PSM의 전후축과 관련된 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe의 신호 강도를 정량화하기 위한 그래프가 생성되었으며, 이는 시계 주기 동안 PSM 전체에 걸친 축 방향 변이와 신호 강도를 보여줍니다.

카이모그래프(Kymograph)는 수많은 PSM에 걸친 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe의 공간적 분포를 시각화합니다. 카이모그래프의 각 행은 개별 PSM 절편의 신호 강도를 나타냅니다. PSM의 전후축(anteroposterior axis)과 관련하여 Delta-Like 1, Notch1 및 intronic lunatic fringe의 신호 강도를 정량화하면, 이들 표적의 명확한 진동 발현 역학이 드러납니다.

마지막으로, 이 카이모그래프(kymographs)는 수많은 PSM 전반에 걸친 분절 및 활성화된 형태의 Notch 수용체 NICD, Delta-Like 1, intronic lunatic fringe, 그리고 Notch1의 공간적 분포를 보여줍니다. 이 기술은 척추동물의 세포 분열 연구 분야의 연구자들이 병아리와 생쥐의 전분절 중배엽에서 분절 유전자 진동 역학을 더 잘 이해하는 데 도움을 주었습니다. 이 기술을 숙달하면 다수의 샘플에 적용할 수 있어, 관심 있는 여러 mRNA와 단백질의 발현 프로파일을 동시에 분석할 수 있습니다.

이 절차에 따라 이미지 데이터를 추가로 정량화하면, 유전자 발현의 시간적 지연뿐만 아니라 연구자가 관심을 갖는 RNA 및 단백질 신호의 세포 내 국소화에 대한 이해를 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 두꺼운 조직 샘플링을 이용하여 척추동물 분절 시계(segmentation clock)의 시공간적 유전자 발현 역학을 매핑하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이후 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 자동 이미지 분석을 수행할 수 있습니다.

이 실험 절차를 수행할 때, PSM 외식편들 사이에 PSM, 척삭 및 신경관이 균등하게 분포되도록 하는 것이 중요하며, 시작 전 항체 희석 배수를 세심하게 최적화해야 합니다. 포름아미드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있음을 유의하십시오. 개인 보호 장구를 반드시 착용하고, 해당하는 경우 흄 후드 내에서 작업하시기 바랍니다.