신경 근육 학 교차로 기능을 측정

이 절차의 전반적인 목표는 ex vivo 실험적 접근 방식을 통해 신경근 접합부의 기능을 연구하는 것입니다. 이는 근육 신경 표본을 근육막 직접 자극과 신경을 통한 자극이라는 두 가지 방식으로 자극함으로써 수행됩니다. 막 자극은 신경 전달 신호를 우회하므로, 두 수축 반응 사이의 모든 차이는 신경근 접합부 기능의 간접적인 측정값으로 간주될 수 있습니다.

본 과정에서는 가자미근(soleus) 좌골 신경 표본을 이용한 절차를 제시합니다. 근육을 신경과 함께 적출하여 관류 조직 욕조(perfused tissue bath)에 넣습니다. 이를 힘 및 길이 조절기에 고정하고, 한 쌍의 백금 전극을 근육과 평행하게 배치합니다.

그 다음 유리 흡입 전극을 신경의 절단된 끝부분 가까이로 이동시킵니다. 이후 신경근 접합부와 근육 기능 모두를 철저히 평가하기 위해 종합적인 테스트 프로토콜을 적용합니다. 근육과 신경 사이의 기능적 연결은 양쪽 부분과 생존한 두 분획 모두에 대해 결론을 내립니다.

두 조직의 수준에서 첫 번째 영역인 신경근 접합부는 일반적으로 압력과 같은 형태를 보입니다. 하지만 여러 병리적 조건에서 근육과 신경 사이의 상호 작용 기능이 심각하게 손상되며, 신경근 접합부는 복잡한 형태학적 구조를 잃게 됩니다. 본 실험 절차의 전반적인 목적은 ex vivo 실험적 접근 방식을 사용하여 신경근 접합부의 기능을 연구하는 것입니다.

이는 두 가지 방법으로 근육 신경 표본을 자극함으로써 수행됩니다. 하나는 근육막을 직접 자극하는 방법이고, 다른 하나는 신경을 자극하여 근육의 특성을 분석하는 방법입니다. 순환 수조의 전원을 켜고 온도를 30 °C로 조절하십시오.

욕조를 Krebs-Ringer 용액으로 채웁니다. 0.4 bar의 혼합 가스가 oxitube를 통해 욕조로 흐르게 합니다. 액추에이터 트랜스듀서와 두 개의 펄스 자극기를 켭니다.

막 자극의 전류 값은 300 million pair로, 신경 자극의 전류 값은 5 million pair로 설정합니다. 경추 탈구법으로 마우스를 희생시킨 후, 다리에서 피부를 제거합니다. 이제 아킬레스건을 절단하고, 건을 단단히 고정한 상태에서 비복근과 가자미근을 함께 위쪽으로 당깁니다.

가자미근의 근위 건이 노출되면 그 윗부분의 종아리 전체를 절단하고, 샘플을 실체 현미경 아래에 위치한 조직 준비 욕조에 빠르게 넣습니다. 포셉을 사용하여 가자미근의 근위 건을 단단히 고정하고, 이를 부드럽게 당겨 좌골 신경 지배 부위를 노출시킵니다. 신경 지배 부위가 노출되면 주변 조직을 제거하여 신경의 약 5mm 구간이 드러나게 합니다.

그 다음 정밀 가위를 사용하여 신경을 조심스럽게 절단합니다. 아킬레스건을 절단하여 가자미근을 비복근으로부터 분리함으로써 근육 및 신경 적출을 완료합니다. 이제 준비된 근육 및 신경 표본을 테스트 장치에 장착할 수 있습니다.

나일론 실 끝에 슬립 매듭을 만든 후 아킬레스건 주위에 단단히 묶습니다. 고정 클램프 내에 근위부 건을 고정하고, 힘 변환기(force transducer)의 레버 암에 나일론 와이어를 묶습니다. 근육이 용액 내에서 평형 상태에 도달하도록 둡니다.

초기 최적 길이를 결정하기 위해, 크리프 부하(creep load) 값을 서서히 변경하면서 일련의 단일 펄스로 근육을 자극하십시오. 트위치 힘(twitch force)이 최대가 될 때 최적 길이를 얻을 수 있습니다. 흡입 전극을 근육 근처에 배치하고 신경을 끌어당겨 고정하십시오.

그런 다음, 펄스 전류 값을 서서히 변경하면서 일련의 단일 펄스로 근육을 자극합니다. 신경을 통해 자극했을 때 근육에서 생성되는 수축력은 막을 직접 자극했을 때 측정된 값과 동일해야 합니다. 최적의 전류 값이 결정되면, 전극에서 신경을 밀어내고 몇 차례의 전류 펄스를 전달합니다.

이전에 선택한 전류량이 과도할 경우, 흡입 전극을 통해 전달되는 전류 펄스가 배스(bath)를 통해 전류를 전도함으로써 근육 수축을 유발합니다. 자체 제작한 소프트웨어를 사용하여 가자미근(soleus) 신경근 접합부 기능 연구를 위한 자동화된 테스트 프로토콜을 고안하였습니다. 이 프로토콜은 약 65분 동안 진행되며 네 개의 서로 다른 부분으로 구성됩니다.

첫 번째 단계에서는 근육에 네 번의 단일 펄스를 가하여 자극합니다. 두 번은 직접 자극하고, 나머지 두 번은 신경을 통해 자극합니다. 이후 수축 반응으로부터 피크 도달 시간, 반-이완 시간, 힘 도함수의 최댓값 및 수축력을 측정합니다.

두 번째 단계에서는 근육에 20 Hz에서 테타닉 주파수인 80 Hz까지 범위의 일련의 펄스 트레인을 가하여 자극합니다. 이를 통해 신경 자극과 직접 자극 모두에 대한 힘-주파수 곡선을 계산합니다. 프로토콜의 세 번째와 네 번째 단계에서는 신경 전달 실패와 테타닉 내 피로도를 측정하기 위해 근육에 두 가지 피로 패러다임을 적용합니다.

이러한 피로 패러다임 동안, 근육은 막에 전달되는 1회의 펄스 트레인과 그 뒤를 이어 신경을 통해 전달되는 14회의 펄스 트레인으로 지속적으로 자극됩니다. 전체 시퀀스는 20회 반복됩니다. 첫 번째 패러다임은 35 hertz의 발화 빈도로 전달됩니다.

두 번째는 80 hertz의 강직 빈도에서 측정합니다. 신경 전달 실패는 활동 전위 전파의 외부 차단, 전달 물질 방출 감소, 그리고 접합부 피로 능력의 판 전위 흥분성 감소와 관련이 있어 피로 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 신경근 접합부 피로 능력의 또 다른 측면은 강직 내 피로(intratetanic fatigue)로 명확하게 나타나며, 이는 단일 강직 수축 동안 힘을 유지하는 근육의 능력을 추정한 값으로 고주파 피로를 반영합니다.

프로토콜의 마지막 단계에서, 아날로그 캘리퍼와 정밀 저울을 사용하여 순 근육 길이와 무게를 측정함으로써 근육의 횡단면적을 계산합니다. 근위축성 측삭 경화증의 SOD1 형질전환 마우스 모델에 대한 연구들은 이 방법론의 잠재력을 강조해 왔습니다. 실제로, 형질전환된 가자미근을 직접 자극했을 때 힘 유도체와 강직성 힘 모두에서 수축 반응이 감소하며, 신경을 통해 자극했을 때는 더욱 큰 감소가 나타납니다.

예를 들어 강직성 힘(tetanic force)과 관련하여, 이러한 실험들은 근육 수축력이 손상의 25%를 차지하며, 추가적인 45%는 신경 전달의 결함과 관련이 있음을 보여주었습니다. 또 다른 흥미로운 점은 대조군 근육을 직접 자극하거나 간접 자극했을 때 아무런 차이가 없었다는 것입니다. 이 결과는 대조군 동물에서 신경근 접합부가 완전히 기능할 것으로 예상되므로, 해당 방법론이 어떠한 기술적 아티팩트(technical artifacts)도 유발하지 않음을 증명합니다.

강축성 피로(intratetanic fatigue)와 관련하여, 결과는 대조군에 비해 형질전환 가자미근(soleus muscle)에서 유의미하게 낮은 수치를 보였습니다. 흥미롭게도, 형질전환 가자미근은 반복적인 자극에 의해 유의미하게 손상되며, 이는 신경근 접합부(neuromuscular junction)의 기능을 최대 8분 동안의 자극 시간 내에서 평가할 수 있음을 의미합니다. 8분 후, 형질전환 근육을 자극하면 힘의 수치가 거의 0에 가까운 값으로 돌아갑니다.

영상을 시청한 후, 마우스의 신경근 접합부 기능과 가자미근(soleus muscle)을 측정하는 방법을 이해하셨을 것입니다. 이 기술은 신경근 접합부 기능의 간접 측정에 기반하므로, 보고된 결함이 형태학적 또는 생화학적 변화와 관련이 있는지 여부를 판단하는 것은 불가능합니다. 반면, 이 접근법은 이러한 공격이 신경 전달 신호의 실제 기능에 영향을 미치는지 평가하는 필수적인 방법을 제시합니다.

마지막으로, 본 프로토콜 제안은 병리적 질환에 자주 관여하는 또 다른 근육인 횡격막의 신경근 접합부 기능을 측정하는 데 쉽게 적용될 수 있습니다.