신경근 접합부 기능 측정

신경근 접합부(NMJ)의 기능 평가는 근육과 신경 사이의 통신에 대한 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기에서는 두 가지 다른 근육-신경 제제, 즉 가자미-좌골 신경통과 횡격막-골격을 사용하여 NMJ와 근육 기능을 종합적으로 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 생체 외 실험적 접근 방식을 통해 신경근 접합 기능을 연구하는 것입니다. 이것은 근육 세포막에서 직접 근육 세포와 신경을 통해 근육 신경 준비를 자극함으로써 이루어집니다. 막 자극은 신경 전달 신호를 우회하기 때문에 두 수축 반응 간의 차이는 신경근 접합 기능의 간접 측정으로 간주될 수 있습니다.

여기에서는 가자미근 좌골 신경 준비에 대한 이 절차를 제시합니다. 근육은 신경과 함께 절개되어 관류된 조직 욕조에 배치됩니다. 그것은 힘과 길이 컨트롤러에 고정되고 백금 전극 쌍이 근육과 평행하게 배치됩니다.

그런 다음 유리 흡입 전극을 신경의 절단된 끝 부분으로 이동합니다. 그런 다음 신경근 접합부와 근육 기능을 모두 철저히 평가하기 위해 포괄적인 테스트 프로토콜이 적용됩니다. 근육과 신경 사이의 기능적 연결은 부분과 살아남은 두 파벌 모두에 대한 결론입니다.

두 조직의 각 수준의 첫 번째 영역에서 이러한 신경근 접합부는 일반적으로 형태와 같은 압력을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 여러 병리학적 조건에서 근육과 신경 사이의 상호 작용 기능이 심각하게 손상되고 신경근 접합부는 복잡한 형태학적 조직을 잃게 됩니다. 우리 절차의 전반적인 목표는 생체 외 실험 접근 방식을 사용하여 신경근 접합 기능을 연구하는 것입니다.

이것은 두 가지 방법으로 근육 신경 준비를 자극함으로써 달성됩니다. 하나는 근육막을 직접 자극하고 다른 하나는 신경을 자극하여 근육의 특성을 분석합니다. 순환 수조를 켜고 온도를 섭씨 30도로 조절하십시오.

Krebs-Ringer 용액으로 수조를 채웁니다. O 포인트 4 bar의 가스 혼합물이 oxitube를 통해 수조로 흐르도록 합니다. 액추에이터 변환기와 두 개의 펄스 자극기를 켭니다.

현재 값을 막 자극에 대해 3억 쌍으로 설정하고 신경 자극에 대해 500만 쌍으로 설정합니다. 경추 탈구로 마우스를 희생 한 후 다리에서 피부를 제거하십시오. 이제 아킬레스건을 자르고 힘줄을 단단히 조이면서 비복근과 가자미근을 함께 위로 당깁니다.

가자미근의 근위부 힘줄이 노출되면 그 위의 종아리 전체를 절단하고 실체 현미경 아래에 있는 준비 조직 욕조에 샘플을 빠르게 넣습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 가자미의 근위 힘줄을 단단히 조이고 부드럽게 당겨 좌골 신경 분포를 노출시킵니다. 일단 신경 분포가 노출되면 주변 조직을 제거하여 약 5mm의 신경을 드러냅니다.

그런 다음 가위를 사용하여 신경을 조심스럽게 자릅니다. 아킬레스건을 절단하여 가자미와 비복근을 분리하여 근육, 신경 절제를 완성합니다. 이제 근육, 신경 준비제를 테스트 장치에 장착할 준비가 되었습니다.

나일론 실 끝에 슬립 매듭을 만들고 아킬레스 건 주위를 조입니다. 고정 클램프 내에 근위 힘줄을 고정하고 힘 변환기의 레버 암에 나일론 와이어를 묶습니다. 용액에서 근육이 평형을 이루도록 합니다.

초기 최적 길이를 결정하려면 일련의 단일 펄스로 근육을 자극하면서 크리프 하중 값을 부드럽게 변경합니다. 최적의 길이는 트위치 힘이 최대일 때 얻어집니다. 흡입 전극을 근육 근처에 놓고 신경을 끌어당깁니다.

그런 다음 펄스 전류 값을 부드럽게 변경하면서 일련의 단일 펄스로 근육을 자극합니다. 신경을 통해 근육이 자극을 받았을 때 근육이 생성하는 경련력은 막에서 근육을 자극할 때 측정된 값과 같아야 합니다. 최적의 전류 값이 결정되면 전극에서 신경을 밀어내고 몇 개의 전류 펄스를 전달합니다.

이전에 선택한 전류의 양이 과도하면 흡입 전극을 통해 전달되는 전류 펄스가 수조를 통해 전류를 전도하여 근육 수축을 유도합니다. 집에서 만든 소프트웨어를 사용하여 가자미근 접합 기능 연구를 위한 자동 테스트 프로토콜을 고안했습니다. 프로토콜은 약 65분 동안 지속되며 4개의 부분으로 구성됩니다.

첫 번째 부분에서는 4개의 단일 펄스로 근육을 자극합니다. 2개는 직접 전달되고 2개는 신경을 통해 전달됩니다. 그런 다음 트위치 응답에서 피크 시간, 절반 이완 시간, 힘 파생 최대 값 및 트위치 힘을 측정합니다.

두 번째 부분에서는 20헤르츠에서 80헤르츠에 이르는 일련의 펄스 트레인으로 근육을 자극하는데, 이는 파탄 주파수입니다. 힘을 계산하기 위해 신경 자극과 직접 자극 모두에 대한 주파수 곡선을 그립니다. 프로토콜의 세 번째 및 네 번째 부분에서 근육은 신경 전달 실패와 파산 내 피로를 측정하기 위해 두 가지 피로 패러다임을 받습니다.

이러한 피로 패러다임 동안 근육은 멤브레인을 통해 전달되는 하나의 펄스 트레인과 신경을 통해 전달되는 14개의 펄스 트레인으로 지속적으로 자극을 받습니다. 전체 시퀀스가 20번 반복됩니다. 첫 번째 패러다임은 35Hz의 발사 주파수로 전달됩니다.

두 번째는 80 헤르츠의 파탄 주파수에서. 신경 전달 실패는 외부 작용 차단 전위 전파, 전달 물질 방출 감소 및 접합 피로 능력의 판자극성 감소와 관련이 있기 때문에 피로 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨집니다. 신경근 연접 피로 능력의 또 다른 측면은 단일 파탄 수축 동안 근육이 힘을 유지하는 능력을 추정하고 고주파 피로를 반영하는 인트라테타닉 피로(intratetanic fatigue)로 명확하게 표현됩니다.

프로토콜이 끝나면 아날로그 캘리퍼와 정밀 저울을 사용하여 순 근육 길이와 무게를 측정하여 근육 단면적을 계산합니다. 근위축성 측삭 경화증의 SOD1 형질전환 마우스 모델에 대한 연구는 이 방법론의 잠재력을 강조했습니다. 사실, 형질전환 가자미근은 직접 자극을 받았을 때 힘 파생 및 파탄력 모두에 대해 감소된 수축 반응을 보이며 신경을 통해 자극을 받을 때 훨씬 더 큰 감소를 보입니다.

예를 들어, 파탄력과 관련하여, 이러한 실험은 근육 수축이 손상의 25%를 차지하고 45%가 신경 전달의 결함과 관련이 있음을 보여주었습니다. 또 다른 흥미로운 점은 직간접적으로 자극을 받았을 때 제어 근육에 차이가 없다는 것입니다. 이 발견은 신경근 접합부가 대조 동물에서 완전히 기능할 것으로 예상되기 때문에 방법론이 기술적 인공물을 유도하지 않는다는 것을 증명합니다.

피로(Intratetanic fatigue)와 관련하여, 그 결과는 형질전환 가자미근에서 대조군보다 훨씬 낮은 값을 보여주었습니다. 흥미롭게도, 형질전환 가자미근은 반복적인 자극에 의해 크게 손상되는데, 이는 최대 8분의 자극 시간에 대해 신경근 접합 기능을 평가할 수 있음을 의미합니다. 8분 후, 형질전환 근육은 자극을 받았을 때 거의 0의 힘 값으로 돌아갑니다.

비디오를 시청한 후에는 마우스의 신경근 접합 기능과 가자미근을 측정하는 방법을 이해했을 것입니다. 이 기술은 신경근 접합 기능의 간접 측정을 기반으로 한다는 점을 감안할 때 보고된 결함이 형태학적 또는 생화학적 변화와 관련된 경우 만들 수 없습니다. 다른 한편으로, 이 접근법은 이러한 공격성이 신경 전달 신호의 사용자 기능에 영향을 미치는지 여부를 평가하는 데 필수적인 방법을 나타냅니다.

마지막으로, 프로토콜 제안은 병리학적 질병에 자주 관여하는 또 다른 근육인 횡격막의 신경근 접합 기능을 측정하기 위해 쉽게 채택될 수 있습니다.