Name: Levator Auris Longus 포유류 신경 근육 학 전송 전압 클램프 조건에서의 시험을 위한 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 쥐 Levator Auris Longus 근육과 신경을 분리하여 신경근육 접합부에서 시냅스 전류를 기록하는 방법을. 이 기술은 단일 시냅스의 전기생리학적 기록과 광학 실험을 결합하여 정상 및 질병 상태에서의 신경전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리 감사 닥터 마크 M. 부자와 다니엘 미 란다 편집 의견, 아마 드 Khedraki이 기술, 그리고 라이트 주립 대학 재정 지원 (A.A.V. 시작 기금)에 대 한 설정 도움.

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저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 준비 및 신경 근육 학 전송 전류 또는 전압 클램프 조건 하에서 측정에 대 한 마우스 랄 근육의 사용 이다. 랄 개 해 부에 대 한 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 포인트가 있다. 전극으로 전극 합 문 근육 에이즈에서 초과 결합 조직 청소 때 합 문에 대 한 위치 결합 조직 퍼 가기 수 있습니다. 그러나, 멀리 취할 수 있는 결합 조직 제거 쉽게 근육 손상의 기회를 제한 하기. 그것은 매우 섬세 하기 때문에 신경의 고립 주의 수행 되어야 한다. 신경 손상을 방지 하는 핀 접시에 신경 보호를 둘 수 있다 신경의 끝에 연결 된 주변 조직의 일부를 떠나 도움이 됩니다. 또한, 주의 하지 신경 신경 자극 기를 배치할 때 호감. 마지막으로, 전극은 섬유에 찔 려는 순서는 중요 하다.입니다. 무딘 전극 쉽게 푹 찌 르다 하 고 먼저 찔 려 한다. 날카로운 전극 먼저 찔 려 죽은 되었다, 경우 무딘 전극 수 근육 섬유 아래로 밀어 전에 가능 하 게 일으키는 섬유에서와 서 날카로운 전극 막 pierces. 이것은 섬유 날카로운...

신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전송 공부 신경 및 골격 근육 시스템의 동적 관계에 통찰력을 제공 하 고 시 냅 스 생리학을 조사 하기 위한 우수한 모델입니다. Levator auris longus (LAL)은 얇은 근육, 쉽게 시각화에 신경 근육 접합부에 대 한 허용. 이전 보고서는 랄을 사용 하 여 시 냅 스 약물과 독 소를 검사 하 고 랄1,2의 골격 근육 섬유 유형 특성을 특징 하 편의 설명 했습니다. 수많은 연구는 신경 근육 학 생리학3,,45,6,7,8을 검사 하는 랄을 사용 했습니다. 전기 생리학, 랄 신경 근육 접합을 쉽게 관찰 하는 능력 모터 종판에 microelectrodes의 정확한 배치에 대 한 수 및 시 냅 스 전송 기록에 공간 클램프 문제를 크게 감소 시킨다. 전류 클램프 녹음 근육 막 속성 막 시간 상수 (τm) 및 (R에서에) 입력된 저항 등의 쉽게 얻을 수 있습니다. 또한, 이러한 속성은 신경 근육 학 전송, 시 냅 스 기능 근육 막 속성의 직접적인 비교에 대 한 수를 기록 하는 데 사용 하는 동일한 근육 섬유에서 측정할 수 있습니다. 이러한 데이터의 분석의 많은 신경 근육 학 질병 및 변경 된 활동의 상태 물리적 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
여기에 설명 된 기술의 핵심 요소는 비선형 전류 클램프에 적용 되지 않습니다 하 고 근육 막 속성의 독립은 시 냅 스 녹음에 대 한 전압 클램프의 사용 이다. 전류 클램프 반대 전압 클램프를 사용 하 여 신경 근육 학 전송 검사의 장점은 개척 1950 년대9에서 노력에 의해 설립 되었다. 전류 클램프에서 진폭에서 10-15 mV를 초과 하는 EPPs mEPP 진폭9의 선형 제품 않습니다. 예를 들어, 평균 mEPP 1 mV, 5의 EPP mV 5 mEPPs 5 (QC);의 제품으로 간주 수 있습니다 반면, 40의 EPP mV 이상의 40 mEPPs의 제품 될 것입니다. 이 비선형 큰 EPPs에 막 잠재력과 아 세 틸 콜린 수용 체에 대 한 평형 잠재력의 차이 EPP에 대 한 강제 운전 때문에 발생 (~-10 mV), 실질적으로 큰 EPPs는 동안 감소. 근육 막 잠재력 전압 클램프 실험 기간 동안 변경 되지 않습니다 때문에이 문제는 전압 클램프 실험에서 피할 수 있습니다. 결점은 전압 클램프 실험은 전류 클램프 녹음 보다 완료 하는 데 기술적으로 어렵습니다. 이 염두에서에 두고, McLachlan와 마틴 엡 스10의 전류 클램프 녹음에서 비선형 차지 간단 수학 교정 개발. 수정11,,1213, 잘 작동 하지만 중요 한 것은, 근육 막 속성 방해 하지는 가정.
근육 막 속성은 특히 공부 하는 조건 또는 질병 상태는 근육을 방해 하는 경우를 고려 하는 것이 중요 합니다. 예를 들어, Huntington의 질병의 R6/2 유전자 변형 모델에서 골격 근육 휴식 염화 칼륨 전류14,15에서 hyperexcitable 진보적인 감소 때문입니다. 결과적으로, mEPPs와 엡 스 R6/2 골격 근육에서 증폭 됩니다. 물론, 추가 요소는 mEPPs와 엡 스를 변경할 수 있습니다. 올 무-단백질8관련이 있을 듯 EPPs에 변화를 발견 Huntington의 질병 쥐는 (R6/1)의 다른 모델을 사용. 변경 된 신경 근육 학 전송을 일으키는 메커니즘을 평가 하는 전압 클램프를 사용 하 여 변경 된 근육 막 속성의 영향을 제거 도움이 것입니다. 최근 연구에서 R6/2 신경 근육 학 전송 여기 설명 된 기술을 사용 하 여 두 전류 및 전압 클램프 조건에서 연구 했다. 모터 종판 전체 종판16의 길이 상수 내에서 두 개의 microelectrodes를 배치 하 여 전압 고정으로 적은 1% 오류 보다 했다. 그것은 그 전압 클램프를 표시 했다 고 나왔고 R6/2 근육에 신경 근육 학 전송의 대조 측정 전류 클램프 레코드 수정. 이 근육 막 속성 변경 하는 경우 비선형에 대 한 엡 스를 해결 하는 것이 어려울 수 있습니다 강조 하 고 근육 막 속성의 독립적인 전압 클램프 레코드의 혜택을 보여줍니다. 여기에 소개 하는 프로토콜은 조건 또는 시 냅 스 전송 및 postsynaptic 막 속성에 영향을 주는 질병 상태를 검사 합니다.

<table><tbody><tr><td>올림푸스 복합 현미경</td><td>올림푸스</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x 대물</td>렌즈 <td>올림푸스</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x 대물</td><td>렌즈 올림푸스</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>셔터 기기</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>산타 바바라 기기 그룹</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 펄스 발전기</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex stimulus Isolator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 데이터 수집 및 분석 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>동심원 양극</td><td>전극 FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>볼 조인트 매니퓰레이터</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비금속 주사기 34 게이지</td><td>세계 정밀 기기</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>니콘 실체 현미경</td><td>니콘</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 2 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위</td>, <td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr>, <tr><td>Sylgard 184, 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>, 다우 코닝</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td>, <td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass, SD9 자극기</td><td>, 잔디, 의료</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모델, P-1000, 마이크로 피펫 풀러</td>, <td>셔터 악기</td>, <td>P-1000</td><td></td></tr>, <tr><td>Axon Digidata 1550, 저소음 데이터 Acuisition 시스템</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저역 통과 Bessell 필터</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>왼손잡이 Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>오른손잡이 Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>단일 모션 컨트롤러</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>크로스 롤러 마이크로 매니퓰레이터</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>이것은 z축을 전동화할 수 있도록 왼손잡이 및 오른손잡이 마이크로 매니퓰레이터의 Z축에 추가되었습니다. 이 맞춤형 설정은 4축 전동 마이크로 매니퓰레이터를 구입하는 것보다 저렴하고 부피가 적습니다. 또한 하나의 컨트롤러로 두 개의 미세 조작기를 모두 제어할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr> 4-Di-2-Asp Molecular Probes Molecular probes <tr><td></td> 를 제외한 <td></td><td></td><td></td>모든 화학 물질은 Fisher에서 정했습니다</tr><tr><td></td><td></td>. 분자 프로브는 더 이상 회사가 아닙니다.<td></td><td> 이제 Fisher를 통해 주문되었습니다</td></tr></tbody></table>.

levator auris longus 포유류 신경 근육 학 전송 전압 클램프 조건에서의 시험을 위한 준비

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

이 프로토콜 전류 클램프 및 클램프 전압 조건 하에서 신경 근육 학 교차로에서 기록 시 냅 스 전송 하는 기법을 설명합니다. Levator auris longus (LAL)의 비보 전 준비 때문에 모터 종판에서 합 문 microelectrode에 대 한 신경 근육 접합의 쉽게 시각화를 제공 하는 얇은 근육 사용 됩니다. 이 메서드는 자발적인 미니어처 종판 전위와 전류 (mEPPs 및 mEPCs), 신경 갖는 종판 잠재력 및 전류 (엡 스와 Epc)의 기록 뿐만 아니라 모터 종판 막 속성에 대 한 수 있습니다. 이 방법에서 얻은 결과 quantal 콘텐츠 (QC), 소포 자료 사이트 (n)의 수, 확률의 소포 자료 (p확인해), 시 냅 스 촉진 및 우울증, 근육 막 시간 상수 (τ 포함 m) 및 입력 저항. 인간 질병의 마우스 모델에이 기술 적용 질병 상태에 주요 병 리를 강조 하 고 새로운 치료 전략을 확인할 수 있습니다. 완전히 전압 클램핑 단일 시 냅 스에 의해이 제공 합니다 현재 사용할 수 있는 시 냅 시스 전송의 가장 상세한 분석의 하나.

그림 8 12 주 된 야생 타입 R6/2 마우스에서에서 현재 펄스 (그림 8A)와 전류 클램프 아래 한 LAL 섬유에서 전압 응답 (그림 8B)의 예가 나와 있습니다. MEPPs의이 레코드 모터 종판에서 찍은 나타냅니다. 레코드는 정상적인 생리 염 분 해결책에서 얻은 했다. 이러한 전류 클램프 레코드 R에 그리고 τm 그 섬유16,,1920의 결정을 분석할 수 있습니다.
EPC와 전압 클램프 조건에서 ...

이 문서에 설명 된 프로토콜 neuromuscular 접속점에 자발적인 기록 마우스 levator auris longus (LAL) 근육 및 신경 갖는 postsynaptic 잠재력 (전류 클램프)과 전류 (전압 클램프)를 사용 합니다. 이 기술 사용 하 여 정상과 질병 조건 하에서 시 냅 시스 전송의 기계 장치에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Levator Auris Longus 포유류 신경 근육 학 전송 전압 클램프 조건에서의 시험을 위한 준비

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

이 절차의 전반적인 목표는 신경 근육 접합부에서 시냅스 전류를 기록하기 위해 levator auris longus muscle과 그 신경을 분리하는 것입니다. 이 방법은 종판의 현재 크기, 양자 함량, 방출 확률 및 신경 전달과 근육 흥분성 간의 관계와 같은 시냅스 생리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 시냅스의 상세한 전기 생리학적 기록을 라이브 셀 광학 실험과 쉽게 결합할 수 있다는 것입니다.이 방법은 신경과 근육 사이의 시냅스 기능 및 피드백 통신에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 초파리에서 포유류에 이르는 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 포유류 신경 근육 준비, 특히 신경이 취약하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 후속 전압 클램프 데이터를 신중하게 획득하고 해석하는 것도 어려울 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 시연은 제 연구실의 스티브 버크(Steve Burke)가 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 실체 해부 현미경으로 견갑골 높이에서 마우스 뒤쪽의 피부를 작게 절개합니다.현저가위를 사용하십시오. 머리와 등의 피부를 자릅니다. 그런 다음 견갑골 근처의 절개 부위를 따라 피부를 끌어 올립니다.오른쪽 견갑골부터 시작하여 LAL보다 열등한 근육을 절단합니다. 그런 다음 절단된 조직을 정중선 바로 오른쪽으로 부드럽게 들어 올립니다. 가위 날로 두개골을 눌러 왼쪽 귀를 잘라 왼쪽 LAL보다 열등한 여러 층의 근육을 제거합니다.외이도를 감싸고 귀 내측의 근육으로 들어가는 LAL을 신경 분포시키는 신경을 절단하지 마십시오. 가능한 한 많은 신경이 연결된 상태에서 외이도를 계속 절단합니다. 그런 다음 귀의 복측 부분을 따라 외이도 뒤의 지방 조직을 자릅니다.마우스에서 근육을 완전히 제거하기 위해 오른쪽에서 수행하는 절차와 유사하게 왼쪽 견갑골을 따라 자릅니다. 다음으로, 귀의 연골 부분을 LAL에 부착한 상태로 기저부를 따라 귀의 귓바퀴를 잘라냅니다. 아래쪽이 위를 향하도록 근육을 뒤집습니다.LAL 근육을 분리하려면 LAL과 주변 조직을 실리콘 엘라스토머 바닥이 있는 페트리 접시에 넣고 절개된 조직을 바닥에 고정합니다. 생리적 식염수로 조직을 자주 씻으십시오. 그런 다음 외이도를 통해 곤충 핀을 삽입하여 준비 장치를 제자리에 고정합니다.더 작은 핀을 사용하여 나머지 조직

levator-auris-longus-preparation-for-examination-mammalian

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

접근 시냅스에 전기 생리학의 응용 프로그램 시냅스 돌연변이를 분석에 유용 시냅스 활동의 같지는 조치를 제공합니다. 이 문서 신경근육학 분기점 (NMJ)의 노출하는 데 사용되는 절개 방법을...

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

크레이 피쉬 다리의 따개 근육은 근육 표현형, 신경 생리학 및 소성의 역사 중요성과 실험 다목적을 위해 제공됩니다.

크레이 피쉬 오프너 근육의 NMJ에서 역사보기 및 생리학 시범

우리는 levator auris의 longus (랄) 젊은 성인 마우스의 근육을 muscarinic 신호의 억제제의 반복 관리와 wholemounts 년에 신경근육학 분기점의 후속 immunostaining (NMJs)에 대한 절차를 설명합니다. 랄 근육이 공개에 대해 고유한 장점이...

피하 Muscarinic Antagonists의 관리 및 마우스에 Levator Auris의 Longus 근육의 트리플 - Immunostaining

이 새로운 방법은 하나의 성인 마우스 motoneuron과 근육 섬유에 의해 생성 된 힘의 측정의 동시 세포 녹음을 할 수 있습니다. 정상과 유전자 변형 동물의 모터 장치의 전기 및 기계적 성질의 결합 조사 신경 근육 시스템의 연구를위한 돌파구이다.

성인 마우스에서의 모터 단위 제작 룸버 Motoneuron과 포스의 동시 세포 녹화<em&gt; 생체에</em

신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.

신경 근육 학 교차로 기능을 측정

Axonal 흥분 기법 이상 및 퇴행 성 돌이킬 수 없는 이벤트를 앞 생물 변화를 검사 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 이 원고는 마 취 쥐의 척 골 신경에 이러한 기술의 사용을 보여줍니다.

Vivo에서 Axonal 흥분 테스트 쥐 척 골 신경의 electrophysiological 측정

이 프로토콜은 절단 된 신경을 통해 형광 칼슘 염료를 마우스 운동 신경 말단에 로딩하는 방법을 설명합니다. 또한, 컨포칼 현미경을 사용하여 말초 신경 종말에서 빠른 칼슘 과도 현상을 기록하는 독특한 방법이 제시됩니다.

Confocal 현미경을 사용한 높은 시간 분해능을 가진 마우스 신경근 접합부의 칼슘 과도 상태 등록

여기에서는 두개골 거근 장뇨근(LAL)의 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)과 탈질법(denervation)을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차를 통해 신경근 시냅스의 재생에서 근육 유래 단백질의 잠재적 역할을 연구할 수 있습니다.

In Vivo Electroporation과 Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle의 단기 신경 재생이 결합되었습니다.

동적 클램프 전기생리학은 신경 발화 결함과 이온 채널 기능 장애 사이의 인과 관계를 확립할 수 있습니다. 우리는 마우스 소뇌 푸르킨제 뉴런의 동적 클램프 방법 및 프로토콜을 설명하고 유용한 리소스와 기술적 고려 사항을 언급합니다. 대표적인 연구에서 우리는 반복적인 발화를 구출하기 위해 Tsc1-/- Purkinje 뉴런에 모델링된 나트륨 전도도를 추가합니다.

자폐증과 관련된 손상된 신경 흥분성을 조사하기 위한 동적 클램프 방법

학습하세요 쥐 Levator Auris Longus 근육과 신경을 분리하여 신경근육 접합부에서 시냅스 전류를 기록하는 방법을. 이 기술은 단일 시냅스의 전기생리학적 기록과 광학 실험을 결합하여 정상 및 질병 상태에서의 신경전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

Levator Auris Longus 포유류 신경 근육 학 전송 전압 클램프 조건에서의 시험을 위한 준비

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