Levator Auris Longus 포유류 신경 근육 학 전송 전압 클램프 조건에서의 시험을 위한 준비

이 절차의 전반적인 목표는 신경 근육 접합부에서 시냅스 전류를 기록하기 위해 levator auris longus muscle과 그 신경을 분리하는 것입니다. 이 방법은 종판의 현재 크기, 양자 함량, 방출 확률 및 신경 전달과 근육 흥분성 간의 관계와 같은 시냅스 생리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 시냅스의 상세한 전기 생리학적 기록을 라이브 셀 광학 실험과 쉽게 결합할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 신경과 근육 사이의 시냅스 기능 및 피드백 통신에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 초파리에서 포유류에 이르는 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 포유류 신경 근육 준비, 특히 신경이 취약하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 후속 전압 클램프 데이터를 신중하게 획득하고 해석하는 것도 어려울 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 시연은 제 연구실의 스티브 버크(Steve Burke)가 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 실체 해부 현미경으로 견갑골 높이에서 마우스 뒤쪽의 피부를 작게 절개합니다.

현저가위를 사용하십시오. 머리와 등의 피부를 자릅니다. 그런 다음 견갑골 근처의 절개 부위를 따라 피부를 끌어 올립니다.

오른쪽 견갑골부터 시작하여 LAL보다 열등한 근육을 절단합니다. 그런 다음 절단된 조직을 정중선 바로 오른쪽으로 부드럽게 들어 올립니다. 가위 날로 두개골을 눌러 왼쪽 귀를 잘라 왼쪽 LAL보다 열등한 여러 층의 근육을 제거합니다.

외이도를 감싸고 귀 내측의 근육으로 들어가는 LAL을 신경 분포시키는 신경을 절단하지 마십시오. 가능한 한 많은 신경이 연결된 상태에서 외이도를 계속 절단합니다. 그런 다음 귀의 복측 부분을 따라 외이도 뒤의 지방 조직을 자릅니다.

마우스에서 근육을 완전히 제거하기 위해 오른쪽에서 수행하는 절차와 유사하게 왼쪽 견갑골을 따라 자릅니다. 다음으로, 귀의 연골 부분을 LAL에 부착한 상태로 기저부를 따라 귀의 귓바퀴를 잘라냅니다. 아래쪽이 위를 향하도록 근육을 뒤집습니다.

LAL 근육을 분리하려면 LAL과 주변 조직을 실리콘 엘라스토머 바닥이 있는 페트리 접시에 넣고 절개된 조직을 바닥에 고정합니다. 생리적 식염수로 조직을 자주 씻으십시오. 그런 다음 외이도를 통해 곤충 핀을 삽입하여 준비 장치를 제자리에 고정합니다.

더 작은 핀을 사용하여 나머지 조직을 LAL의 정중선 반대쪽에 고정합니다. 집게를 사용하십시오. 귀 옆 부분의 피부를 부드럽게 당겨 근육을 펴고 피부에 작은 핀을 꽂습니다.

조직이 접시에 잘 고정될 때까지 이 단계를 반복합니다. LAL을 덮고 있는 근육과 결합 조직을 통해 LAL에 묶여 있는 근육, 특히 정중선 근처에서 팽팽한 근육을 제거합니다. 그런 다음 위에 있는 근육층을 위로 당기고 칼날이 당기는 근육층을 향하도록 결합 조직을 자릅니다.

정중선까지 약 3/4 지점까지 정중선 쪽으로 자르고 LAL만 남을 때까지 근육층을 계속 제거합니다. 청소하는 동안 신경이 손상되지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 전극을 찌르는 데 도움이 되도록 LAL을 덮고 있는 남아 있는 결합 조직 중 일부를 제거합니다.

이 과정에서 LAL을 손상시킬 위험 없이 쉽게 제거할 수 있는 조직만 제거하십시오. 신경 자극기를 사용하여 LAL에 신경을 분포시키는 신경을 확인하려면 신경 자극기로 신경을 만집니다. 근육이 수축하면 올바른 신경이 확인된 것입니다.

그런 다음 신경 근처의 조직을 조심스럽게 잡고 스프링 가위를 사용하여 귀를 둘러싼 조직에서 신경을 분리합니다. 손상을 최소화하기 위해, 대부분의 신경을 일부 주변 조직에 박혀 있게 하여 나중에 신경을 기록 접시에 고정하는 데 사용합니다. 이 시점에서 조사자는 LAL을 20ml 이상의 생리식염수로 목욕시키는 한 한 시간 동안 휴식을 취할 수 있습니다.

다음으로, 고정을 풀고 전기생리학 실험을 위해 해부 현미경 아래의 스테이지 삽입물로 근육을 옮깁니다. 근육의 끝부분과 가장자리를 따라 근육을 고정합니다. 신경을 근육 섬유에 수직으로 놓고 신경 끝에 손상되지 않은 여분의 조직을 통해 접시 바닥에 고정시킵니다.

조직을 항상 생리식염수 용액에 담그십시오. 전기생리학 실험의 경우 LAL이 있는 관류 챔버를 현미경 스테이지에 고정합니다. 기준 전극을 한천 브리지를 통해 기록 챔버에 연결된 3몰 염화칼륨으로 채워진 컵에 넣습니다.

이 시점에서 신경 자극 전극을 신경에 위치시킵니다. LAL prep을 4-Di-2-Asp에 10분 동안 노출시켜 신경근 접합부 시각화를 위한 적절한 형광을 얻습니다. 10 분 후에, 정상적인 칼슘 해결책으로 4-Di-2-Asp 해결책을 교환하십시오.

그 동안, 유리 모세관을 전압 감지 및 전류 통과 전극에 적합한 솔루션으로 채웁니다. 모세관을 부드럽게 두드려 기포를 제거하고 채워진 모세관을 헤드의 전극 홀더에 고정합니다.tage. 표준 명시야 및 형광 조명이 있는 정립 현미경을 사용하여 저배율 수방출 대물렌즈를 사용하여 준비물을 따라 근육 섬유에 수직으로 뻗어 있는 밝은 형광 녹색 신경근 접합부를 찾습니다.

그런 다음 전기생리학으로 검사하기 위해 근육의 최상층에서 신경근 접합을 식별하기 위해 더 높은 배율의 수방출 대물렌즈로 전환합니다. 주로 명시야를 사용하여 식별된 신경근 접합부로부터 100미크론 이내의 근육막 위에 전극을 배치합니다. 이 그림은 12주 된 야생형 R62 마우스의 전류 클램프 하에서 하나의 LAL 광섬유의 전류 펄스 및 전압 응답의 예를 보여줍니다.

기록은 정상적인 생리식염수에서 얻었으며 mEPP의 존재는 이러한 기록이 모터 엔드 플레이트에서 취해졌음을 나타냅니다. 다음은 전압 클램프 조건에서 얻은 EPC와 2개의 mEPC의 대표적인 기록입니다. 이 그림은 대표적인 광섬유로부터 중첩된 EPC와 mEPC를 보여준다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 FM143과 같은 멤브레인 염료를 사용한 라이브 셀 이미징 또는 조직학을 수행하여 소포 방출 흡수 또는 형태학적 변화와 관련된 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생리학 분야의 연구자들이 초파리에서 포유류에 이르는 유기체에서 시냅스 전달 및 신경 세포 통신을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 신경근 접합부에서 시냅스 전류를 기록하기 위해 신경 분포된 거근 auris longus muscle을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 LAL에 인접한 근육 조직을 제거하고 신경을 분리하는 데 세심한 주의를 기울여야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.