동시 광 자극 및 비디오 녹화를 통한 기능적 신경근 접합부 평가

챔버의 기둥 위에 지지되는 콜라겐 포매 근육 조직이 포함된 근육 챔버가 있는 바이오리액터로 시작합니다.

신경구 채널에는 콜라겐 매트릭스에 신경구가 포함되어 있습니다. 신경구의 운동 뉴런은 빛에 민감한 채널을 발현합니다.

뉴런을 자극하여 투영을 확장하는 신경 성장 인자를 포함하는 분화 배지를 추가합니다.

배지를 교환하여 근육 조직을 향한 지속적인 뉴런 확장을 보장하여 신경근 접합부를 형성합니다.

카메라와 청색광원이 장착된 현미경으로 생물반응기를 관찰합니다.

청색광 펄스를 적용하여 뉴런의 빛에 민감한 채널을 열어 매질의 이온이 흐르고 뉴런을 자극하여 전기 신호를 생성합니다.

이러한 신호는 신경 돌기를 통해 신경근 접합부로 이동하여 전기 신호를 근육 조직으로 전달합니다.

비디오를 동시에 녹화합니다. 근육 섬유의 점진적인 수축은 기능적 신경근 접합부의 발달을 확인합니다.

밀리리터당 3mg의 콜라겐 I과 가용화된 기저막 매트릭스의 4:1 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 새로 준비된 콜라겐 혼합물에 근모세포를 재현탁합니다.

다음으로, 이 세포-콜라겐 현탁액 15마이크로리터를 바이오리액터의 각 근육 챔버에 추가하고 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 양쪽 기둥에 퍼뜨립니다. 세포 겔 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 중합시킵니다. 그런 다음 각 바이오리액터 웰에 450마이크로리터의 근긴장성 성장 배지를 채웁니다.

운동 뉴런 분화 11일째에 세포와 배지를 50밀리리터 튜브로 옮기고 신경구가 5분 동안 바닥에 가라앉도록 합니다. 상청액을 흡인하고 뇌 유래 신경영양 인자 밀리리터당 20나노그램과 신경교 세포 유래 신경영양 인자 밀리리터당 10나노그램이 보충된 15밀리리터의 운동 뉴런 현탁 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.

감화 프로토콜의 14일째에 운동 뉴런을 플랫폼에 시드합니다. 밀리리터당 2mg의 콜라겐 I과 가용화된 기저막 매트릭스의 4:1 겔 혼합물을 준비합니다. 400나노미터 세포 스트레이너를 사용하여 큰 신경구를 선택하고 준비된 겔 혼합물에 재현탁합니다.

심스럽게 저장소와 신경구에서 배지를 잘 흡인하십시오. 그런 다음 15마이크로리터의 젤 혼합물을 신경구 채널에 추가합니다. 10마이크로리터 피펫에 10마이크로리터의 젤을 넣고 하나의 신경구를 선택합니다. 신경구를 신경구 채널에 배치하여 챔버에 있는지 확인합니다. 그런 다음 신경구가 침착되면 남은 젤을 방출하면서 피펫을 천천히 들어 올립니다.

겔이 섭씨 37도에서 30분 동안 중합되도록 합니다. 그런 다음 밀리리터당 20나노그램의 뇌 유래 신경영양 인자와 밀리리터당 10나노그램의 신경교세포 유래 신경영양인자가 보충된 450마이크로리터의 NbActiv4를 저장소에 추가합니다.

이미징을 위해 과학적 보완 금속 산화물 반도체 카메라 소프트웨어와 함께 도립 형광 현미경을 사용하십시오. 비닝을 2x2로, 노출을 20밀리초로, 롤링 셔터를 켜고, 판독 속도를 540메가헤르츠로, 다이나믹 레인지를 12비트, 게인 1로, 센서 모드를 오버랩으로 설정합니다. 현미경에서 2x 대물렌즈를 사용하여 미세 조직을 이미지화하고 현미경 스테이지에 라이브 셀 챔버를 부착합니다.

파일 크기와 처리 시간을 최소화하기 위해 신경분포된 골격 조직이 포함된 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 샘플과 이미징 대물렌즈 사이에 594 나노미터 롱패스 방출 필터를 배치하여 카메라에서 청색광 펄스를 필터링합니다. 다음으로, 4개의 바이오리액터가 포함된 직사각형 4웰 플레이트를 살아있는 세포 챔버에 넣습니다. 그런 다음 라이브 뷰를 클릭하고 가운데에 원하는 ROI로 이미지에 초점을 맞춥니다.

GitHub 폴더에서 사용자 지정 매크로코드를 다운로드하여 스테이지 위치, Arduino 보드 및 비디오 수집을 제어합니다. 그런 다음 출력 동영상을 day_tissuegroup_tissuename_experiment로 설정합니다. ND2. 스테이지에 설정된 원하는 x 및 y 좌표로 매크로 코드를 실행하고 초당 50프레임에서 1,700프레임의 빠른 타임랩스 랩스를 획득합니다.

이미징 후 배지를 교체하고 샘플을 인큐베이터로 반환합니다. 조직 피로를 피하기 위해 이미지 획득 세션 사이에 최소 24시간을 허용하십시오.