Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 Pseudocapillaria tomentosa Zebrafish 시스템에서의 환경 심사

이 샘플링 기법의 전반적인 목표는 건강 모니터링에 사용되는 물고기의 수를 줄이고 격리 시 수입품을 선별할 때를 포함하여 병원체 검출의 회전율, 비용 및 민감도를 최적화하는 것입니다. 이 기술은 피난처 식민지의 건강 법령을 정의하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 치료 효율성을 읽거나 평가할 때 유용한 도구입니다.

이 기술의 주요 장점 중 하나는 검역 시 수입품을 선별하고 분류할 수 있다는 것입니다. 수생 시설의 생물 보안 계획을 강화합니다. 프로토콜을 시작하려면 재순환 시스템에서 깨끗한 8리터 탱크를 설정하십시오.

섬프에서 공급되는 약 8리터의 물로 탱크를 채웁니다. 시스템에서 두 개의 세라믹 구슬 또는 스폰지 큐브의 바이오미디어 큐브를 스크린에 추가합니다. 다음으로, 시설에서 지배적인 유전적 배경을 가진 야생형 물고기를 사용하여 리터당 Danio rerio를 수행하려면 하나를 추가합니다(예: A B.최소 6마리의 물고기를 선택합니다).

하루에 한 번 물고기에게 먹이를 주세요. 파수꾼이 제브라피시 시설에서 사용되는 모든 식단에 노출되도록 식단을 변경하세요. 물 교체를 수행하려면 바이오미디어의 센티넬을 임시 탱크로 옮기십시오.

센티넬 탱크를 완전히 비우고 청소하십시오. 센티넬 탱크에 섬프 워터만 다시 채우고 센티넬과 바이오미디어를 다시 놓습니다. 파수꾼을 4개월 동안 섬프 물에 노출시킨 후, 2-페녹시에탄올의 과다 복용 용액에 담그는 것과 같은 승인된 방법으로 물고기를 안락사시킵니다.

사망을 확인하려면 수술 운동이 중단된 후 10분 동안 기다립니다. 집게로 시체를 잡고 식별된 용기에 넣어 섭씨 영하 80도에서 완전히 얼립니다. 플라스틱 샤프트가 있는 멸균 건조 면봉을 준비하고 장갑을 착용합니다.

면봉으로 채취할 표면을 찾습니다. 흐름이 적은 섬프 표면, 물 표면의 섬프 벽을 선택하고 표면에 쉽게 접근할 수 없도록 하는 모든 항목을 제거하십시오. 그런 다음 외부 포장을 제거하여 면봉의 덮개를 풀고 멸균 면 팁을 공기에 노출시킵니다.

섬프 벽을 5-10cm 이상 닦아 섬프 수면 수준에서 물과 생물막을 흡수합니다. 그런 다음 면봉을 다시 덮거나 팁을 멸균 원심분리기 튜브에 넣습니다. 샘플에 라벨을 붙이고 PCR 검사를 위해 보내거나 섭씨 영하 80도에서 동결합니다.

현미경으로 슬러지 분석을 수행하려면 60ml 주사기를 사용하여 섬프 바닥의 슬러지를 흡입합니다. 샘플을 15ml 튜브로 나눕니다. 캡을 조이고 튜브에 라벨을 붙입니다.

15ml 튜브를 중력의 175배에서 250배로 스윙 버킷이 있는 원심분리기에서 10분 동안 원심분리합니다. 튜브를 디캔팅합니다. 디캔팅 후에는 침전물을 보관하십시오.

다음으로 과립 설탕 227g과 뜨거운 물 177ml를 자석 교반기로 혼합하여 설탕 포화 용액을 준비합니다. 설탕 포화 용액으로 튜브를 반쯤 채웁니다. 캡을 조이고 침전물을 용액과 완전히 혼합하십시오.

튜브를 원심분리기 스윙 버킷에 넣고 설탕 포화 용액으로 상단까지 채웁니다. 각 튜브 위에 하나의 커버 유리를 부드럽게 놓아 설탕 포화 용액과 접촉하도록 합니다. 각 60 밀리리터 샘플에 대한 4개의 튜브는 원심분리 중에 일부 커버 유리가 떨어져 파손될 경우를 대비한 것입니다.

회전이 완료되면 커버 유리를 들어 올려 유리 슬라이드에 놓은 다음 연필이나 마커 펜으로 슬라이드에 레이블을 붙입니다. 커버 유리가 너무 많이 파손되는 경우 튜브의 대부분을 설탕 포화 용액으로 채우고 튜브를 원심분리하십시오. 설탕 포화 용액을 상단까지 채운 다음 커버 유리를 부드럽게 설정하고 30분 동안 기다립니다.

현미경으로 pseudocapillaria tomentosa 난자를 찾으십시오. 배율 400X에서 양극성 플러그를 식별합니다. P.tomentosa 알에 대해 격리 중인 수입 동물을 검사하려면 수컷과 암컷 Danio rerio를 수조에 넣고 수조 내 산란 트레이를 추가하되 여기에서 배설물을 수집하는 데 사용합니다.

일주일 후 번식 장치를 제거하고 앞에서 설명한 대로 육식 장치에서 수집된 슬러지를 수확합니다. 60 밀리리터 주사기로 탱크 또는 섬프 바닥의 슬러지를 흡입하고 샘플을 60 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 나사 상단으로 튜브를 닫고 튜브에 레이블을 붙입니다.

주사기를 폐기하십시오. 60ml 튜브를 흔들어 15ml를 15ml 튜브에 넣습니다. 나사 상단으로 튜브를 닫고 튜브에 레이블을 붙입니다.

15ml 튜브를 중력의 175배에서 250배로 스윙 버킷이 있는 원심분리기에서 10분 동안 원심분리합니다. 튜브를 디캔팅하고 튜브에 침전물을 보관하십시오. 외부 포장을 제거하여 면봉의 덮개를 풀고 멸균 면 팁을 공기에 노출시킵니다.

15초 동안 튜브의 침전물을 면봉으로 닦습니다. 면봉을 다시 덮거나 팁을 멸균 원심분리기 튜브에 넣습니다. 샘플에 레이블을 지정합니다.

섭씨 영하 80도에서 동결하고 PCR 검사를 위해 보냅니다. 115마리의 물고기를 섬프 면봉 방법으로 테스트한 결과, 샘플의 5%에서 Mycobaterium chelonae가 검출되었고 Mycobaterium haemophilum이 3%에서 검출되었으며 확인된 유일한 병원성 종이었습니다. 동일한 시스템에서 49개의 섬프 면봉에서 5종의 Mycobaterial 종의 존재가 밝혀졌습니다.

승산비는 표면 섬프 면봉 기술이 제브라피시 시설에서 마이코박테리움을 스크리닝하기 위해 센티넬을 단독으로 사용하는 것에 대한 가치 있는 대안임을 보여줍니다. 환경 샘플은 또한 어류, 슬러지 및 표면 샘플에서 검출된 Aeromonas hydrophila를 스크리닝하는 데 사용되었으며, 이는 물고기 비오톱을 스크리닝하는 제안된 기술의 능력을 뒷받침합니다. Mycobacterium chelonae 및 Mycobacterium fortuitum은 물고기 샘플보다 표면 섬프 면봉에서 PCR에 의해 더 자주 검출됩니다.

일단 마스터되면 샘플링은 몇 분 밖에 걸리지 않으며 가성 모세혈관 토멘토사 난자를 검출하는 데 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 환경 검사를 일상적인 건강 모니터링 프로그램의 핵심 부분으로 만듭니다. 이러한 방법은 박테리아 생물막과 박테리아 감염 사이의 관계와 같은 어류 병리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.