의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템 변형체 Rhoptry 단백질

다음 실험의 전반적인 목표는 hela 기반 cell-free 발현 시스템을 사용하여 plasmodium 단백질을 번역하고 번역된 산물의 마이크로 볼륨에서 단백질을 정제하는 것입니다. 이는 플라스모디움 유전자를 클로닝하여 말라리아 재조합 RT 나무 단백질의 2단계 및 1단계 시험관 내 번역을 위한 재조합 플라스미드를 준비함으로써 달성됩니다. 재조합 단백질을 번역하기 위해 준비된 플라스미드를 전사 혼합물과 함께 배양합니다.

mRNA를 전사하는 2단계 발현 시스템을 사용할 때 생성된 mRNA는 단백질 번역을 위한 번역 혼합물에 추가됩니다. one step 발현 시스템을 사용하는 동안, 재조합 플라스미드는 재조합 단백질의 전사 및 번역을 위해 hela cell lysate와 함께 배양됩니다. 그런 다음 재조합 단백질은 번역 산물의 마이크로 부피에서 정제됩니다.

결과는 웨스턴 블로팅 분석을 기반으로 한 성공적인 발현 및 정제를 보여줍니다. 밀 배아 발현 시스템 및 토끼 망상적혈구 용해물 시스템과 같은 다른 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 시스템이 3시간 내에 단백질을 발현할 수 있다는 것입니다. 코딩 최적화가 필요하지 않습니다.

저렴하고 사용하기 쉽습니다. 마이크로어레이에서 여러 항원을 스크리닝할 수 있어 치료 및 진단을 위한 항원 검출이 가능합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 단백질을 미량 부피로 발현하는 cell-free 발현으로 단백질 정제를 매우 어렵게 만들기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

우리는 대장균을 사용하여 단백질을 발현할 수 없고 다른 발현 시스템이 너무 비싸고 시간이 많이 걸린다는 것을 알았기 때문에 이 시스템을 사용하는 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 우리는 대체 시스템으로 hela 기반 cell-free 발현 시스템을 탐색하기로 결정했습니다. 2단계 인간 in vitro 단백질 발현을 위한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재조합 플라스미드 벡터 DNA를 포함하는 20마이크로리터의 전사 혼합물을 준비합니다.

DNA 템플릿 사용. 마이크로 원심분리기 튜브에 구성 요소를 혼합하고 수조에서 섭씨 30도에서 75분 동안 배양합니다. 그런 다음 전사 혼합물 2 마이크로 리터를 가져 와서 hela 세포 용해물을 포함하는 23 마이크로 리터의 번역 혼합물에 첨가하십시오.

생성된 혼합물을 섭씨 30도에서 90분 동안 배양합니다. 번역된 제품은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 다음으로, DNA 템플릿에 대한 1단계 human coupled in vitro translation protein expression에 대한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재조합 플라스미드 벡터, DNA 및 he 용해물을 포함하는 전사 및 번역 혼합물 25마이크로리터를 준비합니다.

이 반응 혼합물을 섭씨 30도에서 90분에서 6시간 동안 배양하고 병진 생성물을 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 발현된 재조합 단백질을 정제하려면 75마이크로리터의 1X 정제 버퍼를 25마이크로리터의 번역 산물에 추가하여 100마이크로리터의 정제 혼합물을 만듭니다. 300마이크로리터의 증류수와 300마이크로리터의 결합 완충액을 추가하여 니켈 수지를 두 번 세척합니다.

수지와 원심분리기를 14, 000Gs에서 1분 동안 재현탁하여 과도한 에탄올을 제거합니다. 다음으로, 제조된 정제 용액 100마이크로리터를 니켈 킬레이트 수지 100마이크로리터에 첨가하고 혼합물을 끝에서 배양합니다. 실온에서 60분 동안 셰이커를 종료합니다.

14, 1 분 동안 000 GS에 혼합물을 원심 분리기하고 처음부터 끝까지 흐르기로 레테르를 붙인 새로운 관으로 supernat를 모으십시오. 1개의 x 세척 완충액의 100개 마이크로리터를 가진 수지를 세척하고십시오, 그 후에 14, 1 분 동안 000 GS에 분리기를 청소하고 세척이라고 레테르를 붙인 신선한 관에서 지명된 최고 모으십시오. 세탁 후 이 단계를 두 번 반복합니다.

100마이크로리터의 1x 용리 완충액을 레진에 추가하고 말단 셰이커에서 15분 동안 배양합니다. 다음 14, 1 분 동안 000 GS에 분리기. 엘루시안 단계를 매번 두 번씩 수행합니다.

상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 엘루시안 뒤에 용출액으로 표시합니다. 수지를 이전과 같이 두 번 세척한 다음 섭씨 4도에서 보관하십시오. 흐름을 통한 세척 및 용리 시료를 섭씨 영하 20도 이하에서 보관하여 웨스턴 블로팅을 수행합니다.

먼저, P falsy parum e coli, 발현된 재조합 R 3 단백질, 제조된 재조합 단백질 및 친화법을 사용하여 정제된 단백질 산물로부터 schon 추출물의 별도 튜브를 준비합니다. 다음으로, 메르캅토에탄올이 포함된 전기영동 시료 완충액을 각 튜브에 추가하여 최종 부피를 20마이크로리터로 만듭니다. 가용화된 단백질 샘플을 만들려면 튜브를 2분 동안 끓입니다.

가용화된 단백질 샘플을 10%SDS 페이지 겔에 로드하여 겔을 실행한 후 단백질을 분리합니다. SDS 페이지 젤에서 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 종이로 옮긴 후 2시간 동안 반 건조 웨스턴 블로팅 챔버에서 겔당 전류 35밀리암페어로 전기영동하여 2%non-fat 우유로 니트로셀룰로오스 종이를 옮깁니다. nitrocellulose 종이를 negative control에 대한 text protocol에 나열된 polyclonal antibodies와 함께 배양합니다.

또한 니트로 셀룰로오스 종이를 1-100 희석 된 일반 마우스와 토끼 혈청에 배양하고 SB 2 개의 골수종 세포에서 명명 된 배양 슈퍼를 소비했습니다. 니트로 셀룰로오스 종이를 섭씨 4 도에서 하룻밤 동안 배양 한 후 블롯 버퍼로 4 번 세척하고 종 특이적 2 차 항체로 배양하고 말 무 과산화 효소에 접합하고 2 % 우유에 1000으로 1을 희석했습니다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 종이를 블롯 버퍼로 다시 4번 씻습니다.

마지막으로 세척된 니트로셀룰로오스 종이를 발색 용액인 A 플러스 B로 어두운 곳에서 30분 동안 배양하고, 시험관 내 인간 무세포 발현 시스템을 이용한 플라스모듐 단백질의 성공적인 발현을 RT 트리 특이적 토끼 antier에 의해 확인한 바와 같이 이전에 발현된 재조합 단백질은 p FALs parem 및 P Yoi Lee로부터 기생충 vae 단백질에 대한 항혈청에 의해 인식되지 않았으며, 발현된 단백질에 대한 Rabbit Antisera 6 76의 특이성을 입증합니다. 정상적인 토끼 혈청은 재조합 단백질과 반응하지 않았습니다. 2단계 in vitro human cell-free 발현 시스템과 1단계 결합 in vitro 번역 시스템을 사용하여 번역되었습니다.

25마이크로리터의 번역된 단백질 산물에서 번역된 단백질의 성공적인 정제가 여기에 나와 있습니다. 특히 mara의 구순구개열 막관통 단백질의 성공적인 정제가 나타났습니다. 유전자를 암호화하는 plasmodium RT 나무 단백질에서 가상 단백질을 성공적으로 정제하는 것도 보여줍니다.

마지막으로, plasmodium RT 나무 단백질을 포함하는 armadillo repeats의 성공적인 정제가 표시됩니다. 정제 후 단백질의 수율은 개발 후 25 마이크로 리터 당 3.5 마이크로 그램입니다. 이 기술은 기생충학 분야의 기생충 단백질 특성화, 단백질-단백질 상호 작용, 항체 억제 연구 및 기생충학 분야의 백신 개발을 위한 기생충학 분야의 연구자들에게 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 Healer cell-free 기반 세포 발현 시스템을 사용하여 3시간 내에 플라스모듐 단백질을 발현하는 방법을 이해해야 합니다. 또한 번역된 산물의 미량 부피에서 단백질을 정제하는 방법에 대해서도 이해하게 됩니다.