세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

이러한 절차의 전반적인 목표는 초기 개발 단계에서 표적 세포와 종양 내부에 축적되는 항체 접합체의 특이성과 효과를 평가하여 궁극적으로 임상에서 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 핵 국소화의 효율성 및 전반적인 세포 간 축적과 같은 접합 필드에 대한 답변에 대한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 PET 이미징을 통해 연구원들이 후보 항체 접합체의 효과와 선택성을 평가할 수 있다는 것입니다.

이러한 기술의 의미는 암 치료 및 진단으로 확장되는데, 이는 비효율적인 종양 세포 축적이 항체 접합체에 대한 이러한 응용 프로그램의 주요 제한 사항이기 때문입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 colic-acid nuclear localization sequence antibody conjugate를 합성한 후, 200 nanomolar 7G3 colic-acid MLS 항체 conjugate로 타겟 TF1A 세포를 처리합니다. 변형된 대조군 단클론 항체로 처리된 세포를 포함합니다.

10-6번째 항원 양성 세포를 5배 배에 접합체를 사용하여 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다. 새로운 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 한 시간 더 세포를 배양합니다.

다음으로, 0.25%트립신과 EDTA를 함유한 PBS 0.5ml를 첨가하고 섭씨 37도에서 최대 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 10% FBS가 함유된 1.5ml의 RPMI1640액을 사용하여 트립신을 중화합니다. 500배 G로 세포를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 후 0.5ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 다시 3번 세척합니다.

세포에 0.5ml의 1%PFA와 1%자당 및 PBS를 넣고 얼음에 30분 동안 올려 고정시킵니다. 그런 다음 0.5ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척하고 5분 동안 250배 G로 샘플을 원심분리합니다. 다음으로, 0.15%Triton X-100 및 PBS를 세포에 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 투과시킵니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 원심분리를 반복합니다. Alexa Fluor 647에 접합된 반미러링 FC 2차 다클론 항체 밀리리터당 2마이크로그램을 포함하는 0.1ml의 PBS에 세포를 현탁시키고 샘플을 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 250배 G로 5분 동안 세포를 원심분리하고 0.5ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다.

그런 다음 0.5 밀리리터의 PBS에 세포를 현탁시킵니다. 프로피듐 요오드화물을 밀리리터당 10마이크로그램을 세포에 첨가합니다. 그런 다음 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 10-5번째 셀을 한 번 장착한 후 유리 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다.

도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 Plan APO 60X 오일 이멀젼 대물렌즈(개구수 1.42)를 사용하여 세포를 검사합니다. 488나노미터 아르곤 레이저와 600 - 650나노미터로 설정된 분광 스캐닝 프리즘을 사용하여 PI 형광을 검출합니다. AF 647 형광의 경우 633 나노미터 헬륨-네온 레이저와 650 - 700 나노미터용 분광 스캐닝 프리즘 세트를 사용하십시오.

PI 및 AF 647에서 1024 x 1024 픽셀, 2X 라인 평균으로 전체 세포 두께를 통해 0.5미크론 간격으로 촬영한 이미지를 순차적으로 수집합니다. 이미지를 Z 투영으로 표시합니다. 세포를 분석하기 위해 세포질의 세포 내 형광이 그룹화되어 있고 세포 표면 근처에 있는지 또는 확산되고 균질한지 평가하고 기록합니다.

또한 세포당 상대적인 형광 강도를 평가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 방사성 표지된 colic-acid NLS 항체 접합체를 준비하고 농축한 후 0.5마이크로리터의 0.1몰 PH5.5 구연산나트륨 또는 ITLC 용리액을 ITLC 스트립에 적용하여 방사성 표지 효율을 측정합니다. 스트립의 자가방사선 사진을 형성하고 디지털 이미지를 얻습니다.

결합 및 자유 Copper-64의 비율을 얻기 위해 밀도 측정을 수행합니다. 유리 구리-64 함량이 5%보다 크면 샘플을 더 농축합니다. Copper-64 세포 축적 연구의 경우, 앞서 설명한 대로 섭씨 37도에서 1시간, 6시간, 24시간 동안 100나노몰의 Copper-64 표지 A14 접합체로 세포를 처리합니다.

변형되지 않은 A14로 세포를 처리하여 IL5R 알파세포를 차단하고 섭씨 4도에서 수용체 매개 내재화를 차단합니다. 세포를 세척하고 새로운 배지로 배양한 후 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 0.25%트립신과 EDTA가 포함된 PBS 0.5ml를 첨가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 이전과 같이 세포를 중화하고 세척한 후 세포에 원형질막 용해 완충액을 추가하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.

원형질막 용해된 세포를 90배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 새 튜브에 옮깁니다. 이것은 세포질 분획을 나타냅니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 핵을 세 번 세척하고 세척액을 세포질 분획에 추가합니다. 핵 및 세포질 분획이 들어 있는 바이알이 밀봉되었는지 확인한 다음 Copper-64에 대해 보정된 감마 카운터에 넣어 원시 계수를 메가베카릴로 변환합니다. 제한된 핵 단백질인 lamin AC에 대한 Western-Blot 분석을 수행하여 핵 분리의 품질을 결정합니다. 및 Rab-7, 풍부한 세포질 단백질, 도매 용해물, 핵 및 세포질 분획.

500마이크로리터의 방사성-아미노-침전 분석법(RIPA buffer)과 1%2%및 4%NP-40을 함유한 플라즈마-멤브레인 용해 완충액으로 6개의 세포를 5배 10번 처리합니다. 또한 분리된 핵을 500마이크로리터의 RIPA 완충액으로 처리하여 분리된 핵 단백질을 얻습니다. 분리된 핵단백질, 세포질 단백질, 도매 단백질에 시료량의 4배인 저온 아세톤을 첨가하고 영하 20도에서 60분 동안 배양합니다.

13, 000 시간 G에 10 분 동안 표본을 원심분리기. 상등액을 디캔팅하고 단백질 펠릿이 제거되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 PBS를 첨가하여 단백질을 용해합니다.

앞서 설명한 대로 웨스턴 블로팅을 수행한 후 40킬로달톤 분자량 마커에서 멤브레인을 반으로 자릅니다. lamin-AC 특이적 항체를 사용하여 고분자량 단백질이 포함된 블롯을 프로브하고, Rab-7 특이적 항체를 사용하여 멤브레인의 아래쪽 절반을 프로브합니다. 4마리의 nodskit 마우스가 포함된 그룹에서 20-30마이크로그램의 방사성 표지된 A14 콜산 NLS 항체 접합체, 방사성 표지된 A14 NLS 및 방사성 표지된 A14를 꼬리 정맥에 주입합니다.

같은 날, 구리-64 5메가베카릴이 함유된 원통형 팬텀을 PET 스캐너에 넣어 초당 방사성 수치를 조직 1g당 주입량으로 변환합니다.48시간 후, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취한 후 이소플루란에 대한 노즈콘이 있는 헤드퍼스트 엎드린 위치의 PET 스캐너 테이블로 마우스를 빠르게 옮깁니다. 일반 샘플링 모드 설정과 250 - 650 킬로전자 볼트의 에너지 창을 사용하여 PET 데이터 수집을 시작합니다.

스캔 후 스캐너에서 마우스를 제거하고 케이지에 다시 넣습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이 화살표는 트립신화(trypsinization)가 있는 경우와 없는 경우의 항체 접합체 축적을 평가할 때의 차이를 보여줍니다. 트립신화되지 않은 세포에서는 표적 세포의 표면 수용체가 과도하게 발현되기 때문에 세포 내 축적 및 분포를 평가하기 어렵습니다.

화살표는 세포가 적절하게 트립신화되었을 때 두 개의 항체 접합체 후보의 세포 내 축적 및 분포의 차이를 보여줍니다. 방사성 표지된 A14 콜산 NLS 항체 접합체는 IL5R 알파에 대한 나노몰 친화도를 보여줍니다. 방사성 표지된 A14 콜산 NLS 항체 접합체의 농도가 증가함에 따라 A14 콜산성 NLS 항체 접합체의 특이 결합은 HT-1376 및 HT-B9 세포 모두에서 3.5 나노몰 농도에서 포화 상태에 접근했습니다.

감마 계수는 방사성 표지된 A14 산산성 NLS 항체 접합체로 인한 핵과 세포질의 방사성 증가가 특이적이며 시간이 지남에 따라 증가한다는 것을 보여줍니다. HT-1376 및 HT-B9 세포를 1%2% 또는 4%NP-40을 함유하는 원형질막 용해 완충액으로 배양했습니다. HT-1376 및 HT-B9 세포의 경우, 하나 또는 2%NP-40 Rap-7을 포함하는 용해 완충액은 핵 분획에서 검출되지 않았으며, 라민 AC는 세포질 분획에서 검출되지 않았습니다.

PET 이미징을 통해 항원 양성 종양, 빨간색 및 파란색 화살표, 부모의 비펩타이드 변형 항체와 비교하여 관련 생체 분포 특성을 표적으로 하는 능력에 대한 후보 항체 접합체를 평가할 수 있습니다. 종양에서 신호 축적을 볼 수 있어 개발된 항체 접합체의 가능성을 선택하는 데 도움이 됩니다. PET 이미징을 통해 간과 같은 건강한 조직에서 후보 항체 접합체 흡수를 평가할

이러한 기술을 마스터한 후, 분자 페이로드의 표적 종양 전달 분야의 연구자들은 엔도솜 포획으로 인해 종양 세포 축적이 방해되는 추가 약물을 탐색할 수 있습니다.