Name: 간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 학습하세요 간염 E 바이러스 나노입자 표면 화학적 기능화 방법을 통해 항종 표적화 및 치료 진단 분자 결합 기술을 익히세요. 이 재현성 높은 기법은 나노의학 암 치료 연구에 활용됩니다.

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저자 인정 NIH에 의해 RHC를 자금 후원 # 부여 ' s AI095382, EB021230, CA198880, 국립 연구소의 식품 및 농업, 뿐만 아니라 핀란드 존경 하는 교수 프로그램:.

1. HEVNP 곤충 세포에서 생산
참고: 다음 단계를 모두 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다. 더 자세한 HEVNP 생산 절차11에 대 한 우리의 이전 게시를 참조 하십시오.
<ol><li>곤충 세포 미디어 ( 재료의 표참조) 50-75% 합류 6 잘 플레이트에서 Sf9 셀 문화.</li>
	<li>곤충 세포 transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 하 여, transfect 재조합 잠재 생산 HEVNP-573 C ORF2 Sf99 셀에 포함 된 Bacmids. 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일 동안 27 ° C에서 transfected 세포를 품 어.</li>
	<li>P0 잠재 주식으로 감염 된 후 3-6 일에 상쾌한 (후 transfected 세포는 잠재 감염 lysed)를 수집 합니다.</li>
	<li>50-75% confluent Sf9 셀 25 cm2 단층 플라스 크에 P0 재고의 200 µ L를 적용 하기 전에 문화 매체를 제거 합니다. inoculum의 전체 범위를 보장 하기 위해 플라스 크 매 15 분을 바위. 60 분 총 4 회를 반복 한다.</li>
	<li>플라스 크에 곤충 세포 배양 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 증폭 높은 titer에 잠재 하는 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일, 27 ° C에서 유지.</li>
	<li>읽기12잠재 titer를 패 분석 실험을 실시 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 곤충 세포 매체의 100 mL와 함께 정지 Tn5 곤충 세포 (자료 테이블) 문화 및 0.5 x 10의 titer 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어5 -1 x 106 접종에 대 한.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 5-10 ~ 100 mL Tn5 셀의 잠재 감염 (MOI)의 다양성에 추가 합니다. 접종, 후 5-7 일 동안 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어.</li>
	<li>일단 대부분 셀 소포를 나타나고 셀의 70-90%는 광학 현미경 관찰에서 죽은, Tn5 세포를 수집 하 고 33 mL ultracentrifuge 튜브로 전송. 장소는 ultracentrifuge 25 ° c.에 90 분 10000 x g에서 양동이 터, 균형, 그리고 세포 파편과 재조합 baculoviruses 아래로 회전 스윙에 관</li>
	<li>더 정화 4 ° C에서 출시 된 HEVNPs를 포함 하는 상쾌한을 유지. 표면에 뜨는 잠재의 확장된 스토리지에 대 한 protease 억제제를 추가 합니다.</li>
</ol>2. HEVNP 정화
<ol><li>펠 렛 및 세 슘 염화 물 (CsCl) 그라데이션 분리를 사용 하 여 HEVNPs를 분리:<ol>
<li>(1.10 단계)에서 수집 된 상쾌한을 전송 하 고 20% 추가 0.5%의 최종 농도 만들기 위해 각 관으로 NP-40 모든 나머지 세포 막 분해 NP-40. 부드럽게 pipetting으로 혼합 및 25 ° c.에 적어도 30 분 동안 품 어</li>
		<li>Ultracentrifuge는 상쾌한에서 HEVNPs 아래로 작은 하 4 ° C에서 2 시간에 대 한 양동이 터 스윙에 112,400 x g에서 HEVNPs. 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 200 µ L 10 mM MES 버퍼 pH 6.2 하룻밤 각 튜브의 (O/N) 4 ° c.에에서 다시 원유 펠 릿을 일시 중단 SDS 페이지 (3.1 단계) 52 kDa 밴드로 원유 펠 릿에 HEVNP ORF2의 존재 확인을 실행 합니다.</li>
		<li>혼합 1.96 g CsCl 38.5% (w/v) CsCl 그라데이션, 다시 일시 중단 된 원유 펠 릿과 5 mL ultracentrifuge 튜브에 0.01 M MES pH 6.2 ~ 4 mL를 준비 합니다. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. 4 ° c.에 16 h x g 147,000 ultracentrifuge</li>
	</ol>
</li>
	<li>CsCl 그라데이션 후 분수를 수집:<ol>
<li>최고 500 µ L 분수는 주로 경량 세포 막 파편을 삭제 합니다. 튜브의 상단에서 시작 하는 500 µ L 분수를 수집 하 고 각 분수 사이 팁을 변경. 번호 표시 1.5 mL 튜브에 각 분수를 놓습니다. 참고: 존재의 HEVNP ORF2 분수 CsCl 그라데이션 젤 CsCl의 높은 농도 때문에 SDS 페이지를 실행 하 여 검출 될 수 없다에서 분리에. 각 분수에서 CsCl 제거 하거나 CsCl 정리 절차에 따라 희석 될 수 있습니다. 또는, CsCl 그라디언트는 10-40% 자당 그라데이션13 CsCl 잔류 방지를 교체할 수 있습니다.</li>
		<li>5 mL ultracentrifuge 관에 각 분수를 전송 및 10mm MES, pH 6.2 4.5 mL와 CsCl 희석. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. Ultracentrifuge는 HEVNPs 아래 작은 하 4 ° C에서 2 h 147,000 x g에서.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 부드럽게 다시 각 관에서 10 mM MES pH 6.2의 100 µ L에는 HEVNPs를 일시 중단. 증발을 방지 하 고 O/N 4 ° c.에 품 어 튜브 커버</li>
		<li>A280 읽기 및 A260/A280 nm 비율을 분 광 광도 계를 사용 하 여 기록 합니다. 로 ORF2의 대략적인 농도를 결정 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> 각 ORF2 1 Cys 사이트 및 화학 활용에 대 한 1 리스 사이트 포함 됩니다. 참고: HEVNP ORF2의 어 금 니 소멸 계수는 60,280, 1.019 mg/mL × A280에 해당. 이것이 정말 1: 1에 가까운 HEVNPs의 농도 (mg/mL)에서 A280, 그리고 그러므로, 위의 방정식으로 ORF2의 농도 의해 접근 될 수 있는. 예를 들어 1 A280 읽기와 HEVNP의 18.8 µ M에 1 mg/mL 농도 해야한다 ORF2.</li>
		<li>SDS 페이지를 준비 합니다. 각 부분에서 6 µ L 샘플을 사용 하 여 53.3 HEVNP ORF2 kDa 단백질 (3.1 단계)를 포함 하는 분수 결정. HEVNPs ~1.25 g/mL의 조밀도 가진 3-5, 분수에서 찾을 수 합니다.</li>
		<li>존재와 가장 관찰에 의해 HEVNPs의 순도 확인 합니다. 준비 또는 0.5-2.0 mg/mL 가장에 대 한 HEVNP 샘플을 희석. HEVNPs 가장 빈 icosahedral 단백질, ~ 27로 표시 nm 직경 (그림 2). 일부 단백질 오염 물질 분수에 남아 있을 수 있습니다 그리고 가장 (3.2 단계)에서 관찰 될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가장 아래 불순물 있는지 경우에 단계 2.1.3-2.2.6는 HEVNPs의 더 나은 순수성에 대 한 반복 합니다. 참고: 추가 정화 CsCl 그라디언트를 통해 HEVNPs의 수확량 손실을 발생할 수 있습니다. 또는, CsCl 그라데이션 정화를 피하기 위해 잔여 CsCl1310-40% 자당 그라데이션 하 여 교체할 수 있습니다.</li>
</ol>3. HEVNP 특성
<ol><li>SDS 페이지 4-12% 두번째-트리 스 단백질 젤, 1.0 m m, 17-웰 스 ( 재료의 표참조)에 따라 사용자의 수동14준비:<ol>
<li>6 µ L의 단백질 견본 버퍼를 로드 x 4의 2 µ L를 추가 합니다. 단백질 변성을 100 ° C에서 10 분 동안 열 블록에 샘플 혼합물을 품 어. 젤에 단백질 샘플을 로드 합니다.</li>
		<li>100 V 10 분, 45 분 샘플 젤의 바닥 위에 약 1 cm 실행 될 때까지 다음 150 V DC 전원 공급 장치를 설정 하 여 SDS 페이지를 실행 합니다.</li>
		<li>얼룩 Coomassie 파란 (0.25% (w/v) Coomassie 화려한 블루 R250, 30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산), 1 시간에 대 한 SDS 페이지 젤.</li>
		<li>얼룩 절차 후 Coomassie 파란 얼룩을 제거 하 고 적용에 대 한 단백질 젤 드 얼룩 버퍼 (30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산) > 실 온에서 12 h.</li>
		<li>52 kDa 밴드에서 HEVNP ORF2의 존재를 확인 하는 하얀 빛 아래에서 젤을 문서화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가장을 사용 하 여 HEVNPs를 관찰 합니다.<ol>
<li>준비 또는 0.5-10 m m MES ph 6.2 편 영상 2 mg/mL HEVNP 샘플을 희석.</li>
		<li>탄소 코팅 그리드 30 40 mA 글로우 방전으로 이온화 친수성 탄소 표면 생산 하는 s. 글로우 방전 장비 재료의 테이블에에서 설명 되어 있습니다. 참고: 격자의 친수성 탄소 표면 수 마지막만 놀 후 30 분 동안 방전 처리.</li>
		<li>족집게에 및 HEVNP 샘플의 2 µ L를 눈금에 추가, 15-30 s 때까지 기다리는 누른 필터 종이 되 리.</li>
		<li>즉시 씻어 ddH20 그리드와 필터 종이 오.</li>
		<li>바로 그리드, 대기 15 s, 다음 필터 종이 오 2 %uranyl 아세테이트의 2 µ L를 추가 합니다. 건조는 전자에 의해 샘플 격자 습기 없애십시오 건조 캐비닛을 O/북 아 일에 대 한</li>
		<li>가장 및 10-80 k 확대 이미지에 그리드를 전송 합니다. HEVNPs ~ 27은 빈 icosahedral 단백질으로 가장에 나타납니다 nm 직경, 바이러스 성 RNA의 부재 때문에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 화학 활용 Biotin, 암 타겟팅 Ligand와 Fluorophores HEVNPs
<ol><li>HEVNPs 및 maleimide 연결 biotin의 한 단계 활용을 수행 합니다.<ol>
<li>버퍼링 변경: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 1 시간에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs를 전송 하 고 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>1 mg/ml, Cys 반응 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 사이트 maleimide-비타민 b 복합체 (100 µ M)에서 0.01 M PBS, pH 7.4, 어 금 니 비율 1:5; 수 있도록 동일한 금액의 18.8 µ M에 HEVNP를 혼합 O/N 4 ° c.에 반응 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 40 K MWCO 스핀 Desalting 열 절차와 언바운드 maleimide biotin을 제거 합니다.</li>
		<li>SDS 페이지 (3.1 단계) 감소 표준 통해 샘플을 분석 합니다.</li>
		<li>표준 절차를 사용 하 여 한 chemiluminescent 서쪽 오 점 Streptavidin HRP 연결을 사용 하 여 준비 합니다. X 레이 필름 (그림 2)에 의해 chemiluminescent 신호를 캡처.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEV NPs (그림 5)에 표면 노출 시스테인을 LXY30 활용 2 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>교환 버퍼: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 1 h. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs 전송에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>200 µ M CuSO4 와 1mm ascorbic 산 maleimide에 연결 된 LXY30를 0.01 M PBS pH 7.4에에서 650 µ M maleimide-아 지 드와 650 µ M alkyne LXY3010 추가 (말-LXY30) 650 µ M. O/북 아 일에 대 한 4 ° C에 혼합물을 품 어</li>
		<li>1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 HEVNP 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 약 10% 말 LXY30의 볼륨 (650 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4, 어 금 니 비율 1:3; 수 있도록 O/N 4 ° c.에 반응 참고: 말-LXY30의 상대적으로 높은 농도 때문 CuSO4, 같은 반응의 최종 농도 HEVNPs 그들의 손상을 방지 하려면 혼합 후 약 10 배를 감소 된다. 또 다른 옵션은 Cu 무료 활용 방법15.</li>
		<li>제거 언바운드 maleimide-클릭-LXY30 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 ( 재료의 표참조). 4 ° c.에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)를 유지</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30-HEVNPs 및 에스테 르 Cy5.5 보 건국 (NHS-Cy5.5)의 한 단계 활용 수행<ol>
<li>1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)을 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 보 건국 Cy5.5의 동등한 양으로 (100 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4 1:5 어 금 니 비율; O/N 4 ° c.에 반응</li>
		<li>제거는 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 절차 Cy5.5 NHS 언바운드 ( 재료의 표참조). LXY30, HEVNPs Cy5.5 연결을 4 ° c.에 (LXY30-HEVNP-Cy5.5) 유지</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HEVNP에 바인딩 및 MDA MB231 유방암 세포에 국제화
<ol><li>시드 MDA MB231 유방암 세포는 35 m m 유리로 요리 (5 x 104 접시 당) 바닥 캐비닛 포유류 세포 배양에 O/N.</li>
	<li>셀 바인딩 실험에 대 한 다음 단계 4.2-4.3에 의해 LXY30-HEVNP-Cy5.5를 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 LXY30 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 0-250 µ L에 1 %FBS / DMEM.<ol>
<li>0.01 mg/mL HEVNP Cy5.5 다음 단계 4.3 하지만 NHS Cy5.5 염료만, (HEV Cy5.5)와 활용에 부정적인 컨트롤 샘플을 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 10%의 250 µ L에서 FBS DMEM 보충.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 M PBS 버퍼, pH 7.4의 250 µ L을 적용 하 여 셀을 한 번 씻어. 세포 배양 접시에 몇 가지 버퍼를 유지 하면서 세척 후 PBS 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>10% FBS DMEM 또는 HEVNP Cy5.5 10% FBS DMEM 배양된 MDA-MB231 유 방 암 세포를 보충에 보충에 LXY30-HEVNP-Cy5.5의 250 µ L를 적용 합니다. 방패는 셀 교양 알루미늄 호 일 빛에서 요리.</li>
	<li>국제화에 대 한 1 시간에 대 한 캐비닛 37 ° C 세포 배양에서 세포 배양 접시를 유지.</li>
	<li>씻어 얼음에 경작된 한 세포 3 번, 세척, 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 당 5 분.</li>
	<li>4%에서 셀을 수정 PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 분 및 다음 씻어 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 한번에. 참고: 셀 준비가 이제 confocal 현미경에 의해 수행해입니다. 대표적인 데이터는 그림 5에 나와 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

시간이 걸리는 유전 공학 절차는 일반적으로 주, 달리 여기 설명 간단한 2 단계 및 암 ligand를 대상으로 추가의 3 일 안에 완료 될 수 있는 한 단계 화학 활용 절차 및 HEVNPs의 Cys/리스 사이트의 형광 탐지 염료 기술을 사용할 수 있습니다 후보자, 수영장 그리고 따라서 합리적인 비용 및 배달 시 사용할 수 있는 펩 티 드/작은 분자 합성 서비스의 활용에서 최고의 ligand 대상에 대 한 화면으로.
관심사의 단백질에는 polypeptides를 삽입할 수 있습니다만, 전통적인 유전자 공학, 달리 화학 활용 polypeptides, 작은 화학 분자의 표면에 나노 입자 등 다양 한 자료를 연결할 수 있는 관심, Cys 또는 리스 잔류물 반응 사이트로 사용 하는 만큼의 단백질. 화학 활용 사이트에서 같은 잔류물 경우 간단한 Cys/리스 교체 이전 연구4에서 같이 화학적으로 활성화 있도록 관심사의 단백질에 유전으로 수정할 수 있습...

치료 및 진단 배달, nanotheranostics로 알려진에 나노 크기의 벡터의 개발 타겟된 배달1쪽으로 일반적인된 치료에서 생명 의학 분야의 대부분을 이동 했다. 안정적으로 특정 병에 걸리는 직물 또는 생 화 확 적인 통로2,3,4 theranostic 분자를 직접 theranostic 분자와 나노 크기의 벡터 (나노)를 통합 하는 타겟된 nanotheranostic 납품 . 때문에 최적으로 크기의 나노 입자 theranostic 분자의 순환을 안정 한 선택적으로 세포 표면 분자 병 조직에 용량 Nanomedicine 타겟된 배달의 최전선에 왔다. 많은 nanotheranostic 플랫폼은 여전히 수동 셀 이해, 사전 성숙한 저하, 독성, 그리고 theranostic 분자와 부족 한 협회에서 고통. VLPs 많은 타겟된 배달에 이러한 장애물을 극복. 그들은 외국 epitopes를 표시 및/또는 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다: 처방 많은 질병1전투 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 응용 프로그램의 속성에 주로 의존 자기 집합의 주어진된 VLP에 대 한 설계 된 응용 프로그램을 수행 하기 위해 유전 수정 용이성 뿐만 아니라. 유전 공학에 비해, VLP에 외국 펩 티 드의 화학 활용 표시 됩니다 중요 한 이점은 다양 한 엔터티, 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLPs의 표면에 변조 활용을 허용 하기 때문에 고 VLP 어셈블리의 변경 없이 유연한 방식으로.
HEVNPs, 재조합 형 HEV capsid 단백질, 2nd 오픈에서 파생 된 프레임 (ORF2)를 읽고, 비 전염 성, 자기 조립 capsids 셀 바인딩 및 입장 가능. HEV 점 막 전송에 대 한 진화, 때문에 조립된 capsid 단백질 분해와 산 성 점 막 조건5마찬가지로 안정적입니다. HEVNPs 양식 빈, T = 1 icosahedral capsid, 60 동일한 단위6,7 ORF2의 구성 된 렌더링 매우 안정적인 스토리지 및 가혹한 생리 적인 조건에서. 어떤 바이러스 성 유전자 요소 부족, 효율, 높은 수율 생산 곤충 세포에서 잠재 식 시스템을 통해 이루어집니다. 그들의 분해 안정성 때문에 자기 조립된 HEVNPs 추출 하 고 실질적으로 필요한 정화 단계를 줄여 셀 상쾌한에서 정화. 또한, HEVNPs는 표면 노출된 돌출 도메인 (P) 안정적인 icosahedral 기반에 유연한 힌지 (hinge)를 통해 연결 된 소유. 유연한 힌지는 크게 기본 icosahedral 구조를 타협 하지 않고 P 도메인을 수정 가능 하 게 하는 동안 P 도메인 icosahedral 기지 꼭대기 표면 노출 스파이크를 형성 한다. 60 반복 단위, 단일 사이트 수정 화학 변조 60 대칭 사이트에서 발생합니다. 최근에, 우리는 나노 플랫폼 제안 ligands 또는 theranostic 응용 프로그램에 대 한 작은 분자 화학적 켤레 수 HEVNP를 사용 하 여. 이 maleimide에 연결 된 펩 티 드 또는 분자 반응 사이트로 단일 아미노산 시스테인 HEV VLP의 돌출 도메인에 대체 하 여 달성 되었다. HEV VLP 고 잘 공부 면역성 epitopes8,9의 이전 구조 분석을 바탕으로, 다음 5 HEV VLP 아미노산 잠재적인 후보자로 시스테인으로 교환 되었다: Y485C, T489C, S533C, N573C, 및 T586C ( 그림 1). 식 곤충 세포에서 정화 후에, 그들의 VLP 대형 전송 전자 현미경 (TEM) 관찰 (그림 2)에 의해 확인 되었다 고 노출된 시스테인 사이트 서쪽에 의해 분석 되었다 maleimide 연결 biotin 후 오 점 활용 (그림 2)입니다. 5 명의 돌연변이 중 C HEVNP-573 maleimide biotin 활용 (그림 2)의 강한 신호를 표시 하 고 후속4 (그림 3)를 대상으로 유 방 암 세포에 대 한 nanocarrier로 데모를 위해 사용 되었다.
이 프로토콜은 표면 시스테인 활용을 통해 종양을 대상으로 분자 HEVNPs에 연결할 화학 활용 방법을 묘사 한다. 우리 N573에 시스테인을 포함 하는 재조합 HEVNPs와 종양 대상 및 검출 분자 종양 배달의 활용을 자세히 (HEVNP-573 C). 우리는 펩 티 드, LXY3010 HEVNPs 양식 LXY30-HEVNP (그림 4)를 대상으로 유 방 암 종양을 바인딩할 2 단계 클릭 화학 활용 과정에 집중 했다. 그 후, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 HEVNPs LXY30-HEVNP-Cy5.5 형광 탐지를 위한 모두 구축 생체 외에서 (그림 5)에 별도 리스 사이트에 활용 했다 고 vivo에서4.

<table><tbody><tr><td>미니 투석 유닛, 10K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69572</td><td>미니 투석 유닛</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>Tn5 셀</td></tr><tr><td>SF9 셀&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>11496015 Sf9 세포</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11101, A11100</td><td>바큘로바이러스 발현 시스템</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td><td>Bacmid</td></tr><tr><td>ESF921 곤충 세포 배지</td><td>발현 시스템 LLC</td><td>96-001-01</td><td>곤충 세포 매체</td></tr><tr><td>Cy5.5 NHS 에스테르, 5mg</td><td>Lumiprobe Corp</td><td>27020</td><td>Cy5.5 NHS 에스테르</td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼, 40K MWCO, 0.5mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>87766</td><td>스핀 탈염 컬럼</td></tr><tr><td>MES 수화물</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td><td>M8250-250G</td><td>MES</td></tr><tr><td>울트라 클리어 원심분리기 Thinwall 초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td>는 로터</td><td>에 따라 다릅니다.초원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>NuPage 4-12% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>NPO321BOX SDS 단백질 겔</td></tr><tr><td>Cellfectin II 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>10362100 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>EMS 글로우 방전기</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td>글로우 디스방전기</td></tr></tbody></table>

간염 e 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

바이러스 같은 입자 (VLPs) 외국 epitopes를 표시 및/또는 검색 및 다양 한 질병의 치료에 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다. 이 응용 프로그램 자기 조립, 유전 수정에 의존 하 고 재조합 VLPs. 종양을 대상으로 하는 응용 프로그램을 수행 하기 위해 시스테인 활용 유전자와 비교 제공 하는 VLPs에 외국 펩 티 드의 수정 혼자, 화학 활용 한 중요 한 다양 한 엔터티, 합성 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLP 어셈블리의 변경 없이 변조 하 고 유연한 방식으로 VLPs의 표면에 활용 될 수 있기 때문에 이점.
여기, 다기능 배달 캐리어로 간염 E 바이러스 나노 (HEVNP), 모듈화 된 theranostic 캡슐을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. HEVNPs의 기능 조직 대상으로, 이미징, 및 치료 배달 포함 됩니다. HEVNP의 잘 설립 구조 연구에 따라, 구조적으로 독립적이 고 표면 노출 잔류물 thiol 선택적 연계를 통해 화학 그룹 maleimide 연결에 대 한 활용 사이트 시스테인 교체에 대 한 선정 됐다. 하나의 특정 시스테인 수정 HEVNP (573에 아스파라긴의 Cys 교체 aa (HEVNP-573 C)) 유 방 암 세포 특정 리간드, LXY30에 활용 되었고, 근처-적외선 (NIR) 형광 염료 (Cy5.5), 종양 대상 렌더링으로 표시 효과적인 진단 캡슐 (LXY30-HEVNP-Cy5.5)로 HEVNPs. 비슷한 엔지니어링 전략 theranostic 배달에 잠재적인 응용 프로그램을 탐험 잘 알려진 원자 구조와 다른 고분자 단지와 함께 사용할 수 있습니다.

HEV-VLPs, 유사 모든 Cys HEVNPs 형성 성 icosahedral capsids 수정 하 고 생산 또는 정화 하는 동안 솔루션에 집계 되지 않았다. 전과 Cys의 각 단일 단계 maleimide-biotin 활용 수정 후 HEVNPs 부정적인 얼룩 EM (그림 2)에서 HEV-VLPs에서 구별할 수 없었다. Cys 수정된 HEVNPs chemiluminescent streptavidin 바인딩을 통해 서 부 럽으로 처음 테스트에 Maleimide biotin 활용 효율성. Maleimide-비타민 b 복합체 활용, 다음 Cys 수정 표시 HEVNPs streptavidin 바인딩 신호 (그림 2).
효과적인 2 단계 시스테인 활용 활용 밖으로 실...

우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

HEV 나노입자 표면의 화학적 기능화의 전반적인 목적은 진단 및 치료 목적으로 표적 면역원성, 치료 및 진단 분자를 HEV 나노입자 표면에 접합시키기 위한 재현 가능하고 일관된 접근 방식을 제공하는 것입니다.이 방법은 암 표적화 강화 및 나노 치료제의 분포를 어떻게 모니터링할 수 있는지와 같은 나노 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 공학을 이용한 방법과 비교했을 때 재현성이 높고 효율적이며 훨씬 더 쉽게 구현할 수 있다는 점입니다.시연을 진행할 분들은 저희 실험실의 연구 보조원인 Michelle Nguyen과 Ivan Ruiz입니다.본 프로토콜을 시작하기 전, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E형 간염 바이러스 나노입자의 생산 및 정제를 수행하십시오.TEM 이미징을 위해 HEV 나노입자 샘플을 10 mM MES(pH 6.2)를 사용하여 0.5~2 mg/mL 농도로 희석합니다. 친수성 탄소 표면을 형성하기 위해 탄소 코팅 그리드를 40 mA 글로우 방전으로 30초 동안 이온화합니다. 그리드의 친수성 탄소 표면은 글로우 방전 처리 후 30분 동안만 유지됩니다. 이온화 후, 그리드와 핀셋을 잡고 2 µL의 HEV 나노입자 샘플을 그리드에 첨가합니다.15초에서 30초 후, 필터 페이퍼로 그리드를 닦아냅니다. 그 다음 즉시 이중 증류수로 그리드를 세척하고 필터 페이퍼로 다시 닦아냅니다. 즉시 2% 우라닐 아세테이트 2 µL를 그리드에 첨가합니다. 15초 후, 필터 페이퍼로 그리드를 닦아냅니다. 샘플 그리드를 전자 제습 건조기에 넣어 하룻밤 동안 건조합니다.샘플에 따라 구조 시각화 및 특성 분석을 위해 저온 전자 현미경(cryogenic electron microscopy) 또는 cryo-EM이 필요할 수 있습니다. 그리드를 TEM으로 옮겨 10에서 80K 배율로 촬영하십시오. HEV 나노입자는 바이러스 RNA가 없기 때문에 TEM 상에서 직경이 약 27 nanometers인 빈 정이십면체 단백질로 나타납니다.HEV 나노입자와 maleimide-linked biotin의 원스텝 결합(one-step conjugation)을 수행하려면, 먼저 HEV 나노입자를 미니 투석 유닛에 넣습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 실온에서 0.01 molar PBS pH 7.4를 사용하여 나노입자를 1시간 동안 투석합니다. 투석 후, HEV 나노입자를 1.5 milliliter 튜브로

surface-functionalization-hepatitis-e-virus-nanoparticles-using

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 조건부를위한 두 가지 방법을...

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록...

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

출처: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)이 영상에서는 환원된 이황화 결합을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커로 재가교하여 바이러스 유사 입자를 형광 기능화하는 방법을 보여주며, 이를 통해 생의학 응용 분야의 세포 이미징 및 표적 전달에 적합한 안정적이고 추적 가능한 컨쥬게이트를 생성합니다.

이황화 결합 재가교를 통한 바이러스 유사 입자의 형광 기능화

투과전자현미경을 이용한 E형 간염 바이러스 나노입자의 시각화

이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.

감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

여기, 선물이 붙일 functionalize dibromomaleimide와 Qβ VLP에 disulfides에 절차. 우리는 Qβ 식 및 정화, dibromomaleimide 기능성된 분자의 합성 및 dibromomaleimide와 Qβ 사이 활용 반응 설명합니다. 결과 노란색 형광 활용된 입자 셀 안에 형광 프로브로 사용할 수 있습니다.

Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

여기에 설명 된 프로토콜 연구자를 특별히 선택 된 사이트에 아 데 노비 루스 capsids 간단한 화학 수정에 있습니다. 차폐 된 아 데 노 바이러스 벡터 입자 대상이 유전자 전달 벡터 생성 될 수 있습니다, 그리고 벡터 호스트 상호 작용은 공부 될 수 있다.

차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 Capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합

당사는 생체 내 수지상 세포 표적화를 위한 내분균 수용체 특이적 항체에 대한 모델 항원 배부안의 화학적 결합을 위한 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 항체의 정제, 항원의 화학적 융합, 공자의 정제 및 효율적인 유도의 검증을 포함한다.

체외 및 비보에서 마우스 수지상 세포를 대상으로 하는 전체 길이 단백질을 가진 정제 된 DEC-205 지향 항체의 화학 적 융합

자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

비세포병리성 양성 가닥 RNA 바이러스인 Hepatitis E 바이러스(HEV)에 대한 표준 바이러스 중화법은 존재하지 않습니다. 여기서는 형광 표지된 바이러스 캡시드 단백질의 정량화를 기반으로 한 형광 감소 중화 검사(FRNT)를 설명하여 항-HEV 항체의 효능을 평가합니다.

중화성 항체 역가 측정을 위한 형 간염 E 바이러스 형광 감소 중화 검사

학습하세요 간염 E 바이러스 나노입자 표면 화학적 기능화 방법을 통해 항종 표적화 및 치료 진단 분자 결합 기술을 익히세요. 이 재현성 높은 기법은 나노의학 암 치료 연구에 활용됩니다.

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

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