간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

HEV 나노 입자 표면의 화학적 기능화의 전반적인 목표는 진단 및 치료 목적으로 HEV 나노 입자 표면에 표적 면역원, 치료 및 진단 분자를 접합하기 위한 반복 가능하고 일관된 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법은 암의 강화한 표적으로 하고 nano 치료제의 배급이 어떻게 감시될 수 있는지와 같은 nanomedicine 분야에 있는 중요한 질문에 응답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전 공학을 생성하는 것과 비교할 때 재현성이 높고 효율적이며 훨씬 쉽게 달성할 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 연구 조교인 Michelle Nguyen과 Ivan Ruiz입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E형 간염 바이러스 나노 입자 생산 및 정제로 이 프로토콜을 시작하십시오. TEM 이미징을 위해 10밀리몰 MES, pH 6.2를 사용하여 HEV 나노 입자 샘플을 밀리리터당 0.5에서 2밀리그램 사이로 희석합니다.

40 밀리 암페어 글로우 방전으로 탄소 코팅 그리드를 30 초 동안 이온화하여 친수성 탄소 표면을 생성합니다. 그리드의 친수성 탄소 표면은 글로우 방전 처리 후 30분 동안만 지속될 수 있습니다. 이온화 후 그리드와 핀셋을 잡고 2마이크로리터의 HEV 나노 입자 샘플을 그리드에 추가합니다.

15-30초 후에 여과지로 그리드를 닦습니다. 그런 다음 즉시 이중 증류수로 그리드를 세척하고 여과지로 다시 닦아내십시오. 즉시 2 % 우라닐 아세테이트 2 마이크로 리터를 그리드에 추가하십시오.

15초 후 여과지로 그리드를 닦습니다. 샘플 그리드를 전자 제습기 건조 캐비닛에 밤새 넣어 건조시킵니다. 시료에 따라 극저온 전자 현미경 또는 Cryo-EM이 구조 시각화 및 특성화에 필요할 수 있습니다.

그리드를 TEM으로 전송하고 10-80K 배율로 이미지를 촬영합니다. HEV 나노 입자는 바이러스 RNA가 없기 때문에 직경이 약 27나노미터인 빈 이십면체 단백질로 TEM에서 나타납니다. HEV 나노입자와 말레이미드 결합 비오틴의 1단계 접합을 수행하려면 먼저 HEV 나노입자를 미니 투석실에 적용합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 실온에서 1시간 동안 0.01몰 PBS pH 7.4에 대해 나노 입자를 투석합니다. 투석 후 HEV 나노 입자를 1.5ml 튜브로 옮기고 분광 광도계를 사용하여 280나노미터에서 단백질 농도를 측정합니다. 밀리리터당 1밀리그램의 나노 입자를 100마이크로몰의 말레이미드 비오틴과 0.01몰 PBS pH 7.4와 동일한 양으로 혼합하여 1 대 5 몰 비율을 만듭니다.

섭씨 4도에서 밤새 반응한 후 제조업체의 프로토콜에 따라 스핀 탈염 컬럼 절차로 결합되지 않은 말레이미드 비오틴을 제거합니다. 표준 감소 SDS 페이지를 통해 샘플을 분석합니다. 표준 절차에 따라 HRP 연결 스트렙타비딘을 사용하여 화학발광 웨스턴 블롯을 준비하고 X선 필름으로 화학발광 신호를 캡처합니다.

유방암 세포 특이적 리간드인 LXY30을 HEV 나노 입자에 노출된 표면에 2단계 접합을 수행하려면 먼저 나노 입자를 미니 투석 장치에 적용하고 실온에서 1시간 동안 0.01몰 PBS pH 7.4에 대해 투석합니다. 그런 다음 HEV 나노 입자를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 분광 광도계를 사용하여 280 나노 미터에서 단백질 농도를 측정합니다. 다음으로, 650 마이크로몰 말레이미드 아지드 및 650 마이크로몰 알카인 LXY30을 200 마이크로몰 구리 설페이트 및 1 밀리몰 아스코르브산과 결합합니다.

이것은 650 micromolar에서 maleimide-linked LXY 30을 형성합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, HEV 나노 입자를 밀리리터당 1밀리그램과 말레이미드 결합 LXY 30 약 10% 부피를 혼합하여 1 대 3 몰 비율을 만듭니다.

섭씨 4도에서 밤새 반응합니다. maleimide LXY 30의 상대적으로 높은 농도로 인해 황산구리와 같은 반응물의 최종 농도는 혼합 후 약 10 배 감소합니다. E형 간염 바이러스 나노 입자에 대한 손상을 방지하기 위한 또 다른 옵션은 무구리 기여 방법입니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 스핀 탈염 컬럼이 있는 결합되지 않은 말레이미드 클릭 LXY 30을 제거합니다. LXY 30 결합 HEV 나노 입자를 섭씨 4도로 유지합니다. LXY 30 HEV 나노 입자와 Cy5.5 형광 태그의 1단계 접합을 수행하려면 먼저 LXY 30 연결 나노 입자를 밀리리터당 1밀리그램과 동일한 부피의 Cy5.5 형광 태그를 혼합하여 1 대 5 몰 비율을 만듭니다.

혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 반응시킨 후 제조업체의 프로토콜에 따라 스핀 탈염 컬럼 절차로 결합되지 않은 Cy5.5 NHS를 제거합니다. LXY 30 Cy5.5 연결 HEV 나노 입자를 섭씨 4도로 유지합니다. 종양 세포 표적화를 위한 HEV 나노 입자의 LXY 30 기능화를 위해 두 가지 방법이 시도되었습니다.

HEV 573C 나노 입자가 먼저 말레이미드 아지드에 결합된 다음 LXY 30 알킨에 대한 클릭 화학 반응을 일으켰을 때 HEV 573C 나노 입자는 TEM 관찰에서 분해되는 것으로 나타났습니다. 그러나 LXY 30 알킨과 말레이미드 아지드 사이의 초기 클릭 화학 반응으로 말레이미드 결합 LXY 30을 형성한 후 변형된 HEV 나노 입자를 돕기 위한 접합은 구조에 영향을 미치지 않았고 HEV 573C 나노 입자는 그대로 유지되었습니다. LXY 30 및 Cy5.5 결합 HEV 나노 입자를 배양된 유방암 세포에 적용하고 컨포칼 현미경으로 관찰했습니다.

컨포칼 현미경 검사에 의한 근적외선 형광 이미지는 LXY 30 Cy5.5 결합 HEV 나노 입자가 Cy5.5 결합 HEV 나노 입자에 비해 MDA MB 231 유방암 세포의 내재화 증가에 대한 결합 친화도가 더 높다는 것을 나타냅니다. 이 기술의 의미는 정상 세포에 손상을 주지 않고 종양의 정확한 표적화 및 진단을 가능하게 하는 다중 모드 표적화 및 치료 분자의 검사로 확장됩니다. 이 방법은 화학적 표면 조절을 통해 암 및 종양 표적화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 조기 암 진단, 스크리닝 및 이미징 유도 치료에 적용할 수 있습니다.