고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

이 고함량 현미경 기반 방법의 전반적인 목표는 미토콘드리아의 형태 및 기능과 세포 내 활성 산소종 수준을 동시에 정량화하여, 서로 다른 실험적 섭동에 노출된 세포주에 대한 강력한 산화환원 핑거프린트를 구축하는 것입니다. 이 방법은 병원성 조건이나 화합물 처리가 산화 스트레스를 유발하는지, 그리고 미토콘드리아의 형태와 기능이 어느 정도 영향을 받는지와 같은 산화환원 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 파라미터를 동일한 세포 내에서 동시에 측정할 수 있다는 점입니다.

절차를 시작하려면, 얇고 연속적인 폴리스티렌 또는 유리 바닥을 가진 블랙 96-웰 플레이트의 내부 웰 60개에 인간 진피 섬유아세포를 8,000~10,000개씩 분주합니다. 서로 다른 조건, 처리군 또는 세포주를 사용하는 경우, 플레이트 효과를 최소화하기 위해 분주 위치를 플레이트 전체에 균일하게 배치하십시오. 그런 다음, 초점 조절용으로 사용할 B01 웰에 8,000~10,000개의 세포를 추가로 분주합니다.

그 후, 웰과 주변 환경 사이의 구배를 최소화하기 위해 비어 있는 바깥쪽 웰을 배지로 채웁니다. 세포가 뭉쳐서 자라는 것을 방지하기 위해 플레이트를 세 번 가볍게 두드린 다음 다시 인큐베이터에 넣습니다. 세포를 24시간 동안 또는 70% 합류도(confluency)에 도달할 때까지 배양합니다.

그 후, 실험의 처리 정보를 setup이라는 스프레드시트에 저장합니다. 현미경을 설정하려면, 먼저 소프트웨어를 사용하여 XY 스테이지를 보정합니다. 다음으로, 획득 소프트웨어를 사용하여 멀티 웰 플레이트용 이미징 프로토콜을 생성합니다.

이 프로토콜을 통해 96-웰 플레이트의 설정된 위치와 선택된 웰을 자동으로 획득할 수 있습니다. 이제 소프트웨어에서 제공하는 사용 가능한 플레이트 목록에서 적절한 유형의 멀티 웰 플레이트를 선택하십시오. 또는 플레이트 및 웰 치수를 사용하여 멀티 웰 플레이트 형식을 정의하십시오.

그다음, 4개의 외곽 모서리 웰 중 두 곳의 모서리를 지정하여 웰 플레이트를 정렬합니다. 이어서 획득이 필요한 웰을 선택하고, 순차적 파장 획득으로 구성된 획득 프로토콜을 정의합니다. GFP 채널이 먼저 설정되었는지 확인하십시오.

그 다음, 정의된 획득 프로토콜을 사용하여 선택한 각 웰의 중심 주변에 서로 겹치지 않게 정기적인 간격으로 배치된 4개의 이미지를 획득하도록 웰 플레이트 루프를 정의합니다. 이 단계에서는 CM-H2DCFDA와 TMRM 스톡 솔루션을 HBSS HEPES 버퍼에 첨가하여 60개 웰 분량의 염색 용액을 준비합니다. 이어서, 플레이트를 단 한 번의 유연한 동작으로 뒤집어 세포로부터 배양액을 제거합니다.

HH 버퍼로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다. 초점 조절에 사용한 세포가 들어있는 A01 웰을 잊지 마십시오. 세척 단계 사이에는 HH 버퍼를 제거합니다.

그런 다음, 각 웰에 염색 용액 100 microliters를 첨가하여 세포를 CM-H2DCFDA와 TMRM으로 로딩합니다. 이때 웰 A01을 잊지 마십시오. 세포를 실온의 암소에서 25분 동안 배양합니다.

25분 후, 100 µL의 HH buffer로 세포를 두 번 세척하고 모든 60개 내부 웰에 100 µL의 HH buffer를 추가합니다. 실제 측정을 수행하려면 플레이트를 현미경에 설치하십시오. 그런 다음 하드웨어 기반 자동 초점 시스템을 켜고, B01 웰과 TMRM 채널을 사용하여 이미지가 선명해질 때까지 자동 초점 오프셋을 조정하십시오.

그 후, 이미징 프로토콜을 실행합니다. 결과 이미지 데이터 세트를 통해 기저 ROS 수준, 미토콘드리아 막 전위 및 미토콘드리아 형태에 관한 정보를 얻을 수 있습니다. 다음으로, 유도된 ROS 수준을 측정하기 위해 현미경에서 96-웰 플레이트를 조심스럽게 꺼냅니다.

각 웰에 40 µM의 TBHP 용액 100 µL를 추가하고, TBHP와 CM-H2DCFDA가 완전히 반응하도록 최소 3분 동안 기다립니다. 이 시간 동안 A01 웰에 항체 작동 용액 100 µL를 추가합니다. 이제 플레이트를 다시 현미경에 장착하고 B01 웰을 사용하여 초점을 다시 확인합니다.

그다음, 동일한 이미징 프로토콜을 사용하여 첫 번째 이미징 라운드와 동일한 위치를 획득합니다. 생성된 이미지 데이터 세트는 유도된 ROS 수준에 대한 정보를 제공합니다. 다음으로, A01 웰에서 플랫 필드 이미지를 획득합니다.

신호가 동적 범위(dynamic range) 내에 충분히 들어오는지 확인하십시오. 이를 위해 획득 설정을 조정하십시오. 그 후, 표준화된 명명법을 사용하여 획득한 데이터 세트를 개별 TIFF 파일로 단일 폴더에 내보내십시오.

여기에는 플레이트, TBHP 처리 전 또는 후, 웰, 필드 및 채널에 대한 참조가 언더스코어(_)로 구분되어 포함됩니다. 또한, 표준화된 명명법을 사용하여 플랫 필드 이미지를 동일한 폴더에 개별 TIFF 파일로 저장하십시오. 이 단계에서는 이미지 처리 소프트웨어를 열고 redox metrics 매크로 세트를 설치하십시오.

그런 다음, S 버튼을 클릭하여 설정 인터페이스를 열고 분석 설정을 지정합니다. 이미지 유형, 채널 수 및 플랫 필드 이미지 획득에 사용된 웰을 선택합니다. 그 후, 어느 채널에 세포 또는 미토콘드리아가 포함되어 있는지 지정합니다.

배경 차감 및 대비 제한 적응형 히스토그램 평활화를 각각 수행하려면 배경 및 강화 체크박스를 선택하십시오. 다음으로, 세포의 가우시안 블러링과 미토콘드리아의 라플라시안 강화를 위한 시그마 값을 정의하십시오. 자동 임계값 설정 알고리즘을 선택하고 크기 배제 제한 범위를 입력하십시오.

그 다음, 획득한 데이터 세트에서 몇 개의 이미지를 선택해 열고, 메뉴에서 세포 또는 미토콘드리아 세그멘테이션을 위해 각각 C 또는 M 버튼을 클릭하여 세그멘테이션 설정을 테스트합니다. 이어서 해시 버튼을 클릭하고 이미지가 포함된 폴더를 선택하여 해당 폴더에 대한 일괄 분석을 수행합니다. 설정을 확인한 후 확인 버튼을 누릅니다.

배치 분석 후, V 버튼을 클릭하고 이미지 폴더를 선택하여 검증 스택의 세그멘테이션 성능을 시각적으로 확인하십시오. 검증 스택을 살펴보며 세그멘테이션이 성공적으로 수행되었는지 확인합니다. 추출된 데이터의 초기 분석은 무료로 제공되는 Shiny 애플리케이션을 통해 자동으로 수행됩니다.

이를 통해 결과의 신속한 해석이 가능합니다. 우선, R Studio에서 애플리케이션을 엽니다. 외부 브라우저에서 실행하는 옵션을 선택하십시오.

입력 페이지에서 결과 파일이 위치한 디렉토리를 선택하십시오. 설정 파일 또한 해당 디렉토리에 포함되어 있는지 확인하십시오. 결과 파일과 설정 정보는 자동으로 가져오기, 컴파일 및 시각화됩니다.

실험 설정 페이지에서 실험 레이아웃을 확인할 수 있습니다. 다음 페이지에서는 각 플레이트별로 ROS 수치와 여러 미토콘드리아 파라미터를 개별적으로 보여줍니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 시각화하려는 플레이트를 선택하십시오.

데이터는 멀티웰 플레이트 형식뿐만 아니라, 웰 및 이미지 번호가 표시된 이상치가 포함된 박스 플롯으로 표시됩니다. 전체 실험 결과 페이지에는 모든 플레이트를 통합한 정규화된 결과와 기초 통계 분석이 함께 표시됩니다. 입력 페이지를 통해 드롭 파일이 제공되면, 지정된 데이터 포인트는 제외됩니다.

클러스터 분석 페이지에서는 5가지 파라미터의 데이터를 활용한 주성분 분석을 통해 민감한 산화환원 프로파일을 구성합니다. 마지막으로, 데이터 다운로드 페이지에서 처리 및 재정렬된 데이터를 저장하여 추후 사용할 수 있습니다. 여기에서는 인체 진피 섬유아세포에 HIV 프로테아제 억제제인 Saquinavir를 처리한 실험 결과가 표시되어 있습니다.

설명된 프로토콜을 사용하여 분석한 결과, 기저 상태와 유도된 상태의 ROS 수치 모두에서 유의미한 증가가 검출되었습니다. 이는 DMSO로 처리한 대조군 세포와 비교한 결과입니다. Saquinavir는 또한 미토콘드리아의 형태 및 기능에 유의미한 영향을 미쳤습니다.

미토콘드리아 픽셀당 평균 TMRM 신호로 측정된 미토콘드리아 막 전위가 유의하게 증가하였습니다. 또한, 미토콘드리아는 매우 분절된 패턴을 보였으며, 이는 개별 미토콘드리아의 원형도 증가와 평균 크기 감소를 통해 정량적으로 나타났습니다. 주성분 분석(PCA)을 사용하여 앞서 언급한 파라미터들을 결합했을 때, 대조군과 Saquinavir 처리군은 산화환원 핑거프린트에 의해 서로 명확하게 구분되었습니다.

이 절차를 수행할 때, 조명 자체가 산화 스트레스를 유발한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 노출 조건은 최소화해야 하며 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지되어야 합니다. 숙련되면 하루에 최대 20개의 96 웰 플레이트를 염색하고 이미지를 획득할 수 있습니다.

두 번째 이미징 라운드 이후, 세포를 고정하여 다운스트림 면역형광 염색에 사용할 수 있습니다. 이는 동일한 세포에서 측정 가능한 파라미터의 수를 증가시키며, 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있게 합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 고함량 분석 현미경(high-content microscopy)을 사용하여 부착 세포 배양에서 ROS와 미토콘드리아 형태 기능의 복합 측정을 수행할 수 있게 될 것입니다.