고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

이 고함량 현미경 기반 방법의 전반적인 목표는 미토콘드리아 형태 기능과 활성 산소 종의 세포 수준을 동시에 정량화하여 다양한 실험 섭동에 노출된 세포주에 대한 강력한 산화 환원 지문을 확립하는 것입니다. 이 방법은 병원성 질환 또는 복합 처리가 산화 스트레스를 유발하는지 여부, 미토콘드리아 형태 및 기능에 어느 정도 영향을 미치는지와 같은 산화 환원 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 매개 변수를 동일한 셀 내에서 동시에 측정 할 수 있다는 것입니다.

절차를 시작하기 위해, 8-10, 000 인간 피부 섬유아세포를 얇은 연속 폴리스티렌 또는 유리 바닥이 있는 검은색 96 웰 플레이트의 60개 내부 웰에 파종합니다. 다양한 조건, 처리제 또는 세포주를 사용하는 경우, 플레이트 효과를 최소화하기 위해 플레이트에 파종 위치를 균일하게 분배합니다. 그런 다음 초점 조정에 사용할 웰 B01에 8-10,000개의 세포를 추가로 시드합니다.

그런 다음 빈 외부 우물을 매체로 채워 우물과 환경 사이의 기울기를 최소화합니다. 세포가 패치로 자라는 것을 방지하기 위해 인큐베이터에 다시 넣기 전에 플레이트를 부드럽게 세 번 두드립니다. 24시간 동안 또는 70% 포화도에 도달할 때까지 세포를 배양합니다.

그런 다음 실험에 대한 치료 정보를 setup이라는 스프레드시트에 저장합니다. 현미경을 설정하려면 먼저 소프트웨어를 사용하여 XY 스테이지를 보정합니다. 다음으로, 수집 소프트웨어를 사용하여 다중 웰 플레이트에 대한 이미징 프로토콜을 만듭니다.

이 프로토콜을 사용하면 96웰 플레이트의 설정 위치와 선택된 웰을 자동으로 획득할 수 있습니다. 이제 소프트웨어 내에서 제공되는 사용 가능한 플레이트 목록에서 올바른 유형의 다중 웰 플레이트를 선택하십시오. 또는 플레이트와 웰 치수를 사용하여 다중 웰 플레이트 형식을 정의합니다.

그런 다음 4개의 바깥쪽 모서리 웰의 두 모서리를 정의하여 웰 플레이트를 정렬합니다. 그런 다음, 획득해야 하는 well을 선택하고 순차 파장 획득으로 구성된 획득 프로토콜을 정의합니다. GFP 채널이 먼저 설정되어 있는지 확인하십시오.

그런 다음, 웰 플레이트 루프를 정의하여 정의된 획득 프로토콜을 사용하여 선택한 각 웰의 중심 주위에 배치된 규칙적인 간격의 겹치지 않는 4개의 이미지를 획득합니다. 이 단계에서는 HBSS HEPES 완충액에 CM-H2DCFDA 및 TMRM 원액을 첨가하여 60웰에 대한 염색 용액을 준비합니다. 다음으로, 한 번의 유체 동작으로 플레이트를 거꾸로 뒤집어 세포에서 배양 배지를 버립니다.

HH 버퍼로 세포를 두 번 부드럽게 씻습니다. 초점 조정에 사용되는 셀이 있는 A01을 잘 잊지 마십시오. 세척 단계 사이에 HH 버퍼를 버리십시오.

그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 염색 용액을 추가하여 CM-H2DCFDA 및 TMRM을 세포에 로드합니다. 다시 말하지만, A01을 잘 잊지 마십시오. 실온의 어두운 곳에서 25분 동안 세포를 배양합니다.

25분 후, 100마이크로리터의 HH 버퍼로 셀을 두 번 세척하고 100마이크로리터의 HH 버퍼를 60개의 내부 웰 모두에 추가합니다. 실제 측정을 수행하려면 현미경에 플레이트를 설치하십시오. 그런 다음 하드웨어 기반 자동 초점 시스템을 켜고 선명한 이미지가 나올 때까지 B01 웰과 TMRM 채널을 사용하여 자동 초점 오프셋을 조정합니다.

그런 다음 이미징 프로토콜을 실행합니다. 결과 이미지 데이터 세트는 기초 ROS 수준, 미토콘드리아 막 전위 및 미토콘드리아 형태에 대한 정보를 제공합니다. 다음으로, 유도된 ROS 수준을 측정하려면 현미경에서 96웰 플레이트를 조심스럽게 제거합니다.

각 웰에 40마이크로몰로 100마이크로리터의 TBHP 용액을 추가하고 TBHP가 CM-H2DCFDA와 완전히 반응할 때까지 최소 3분을 기다립니다. 이 시간 동안 100마이크로리터의 항체 작동 용액을 A01 웰에 첨가합니다. 이제 플레이트를 현미경에 다시 장착하고 B01 웰을 사용하여 초점을 다시 확인합니다.

그런 다음 동일한 이미징 프로토콜을 사용하여 첫 번째 이미징 라운드에서와 동일한 위치를 획득합니다. 결과 이미지 데이터 세트는 유도된 ROS 수준에 대한 정보를 제공합니다. 다음으로, 웰 A01에서 평탄한 시야 이미지를 획득합니다.

신호가 다이내믹 레인지 내에 있는지 확인하십시오. 획득 설정을 조정합니다. 그런 다음 표준화된 명명법을 사용하여 단일 폴더에 있는 수집된 데이터 세트를 개별 TIFF 파일로 내보냅니다.

여기에는 플레이트, TBHP 처리 전후 참조, 우물, 필드 및 밑줄로 구분된 채널이 포함됩니다. 또한 표준화된 명명법을 사용하여 개별 TIFF 파일과 동일한 폴더에 플랫 필드 이미지를 저장합니다. 이 단계에서는 이미지 처리 소프트웨어를 열고 산화 환원 메트릭 매크로셋을 설치합니다.

그런 다음 설정 인터페이스를 열고 S 버튼을 클릭하여 분석 설정을 지정합니다. 이미지 유형, 채널 개수, 플랫 필드 이미지를 획득하는 데 사용된 웰을 선택합니다. 그런 다음 세포 또는 미토콘드리아가 포함된 채널을 표시하십시오.

background 및 enhance 확인란을 선택하여 각각 background subtraction(배경 빼기) 및 contrast limited adaptive histogram(대비 제한) 히스토그램 이퀄라이제이션을 수행합니다. 다음으로, 세포의 가우시안 및 블러링과 미토콘드리아의 라플라시안 향상에 대한 시그마를 정의합니다. 자동 임계값 지정 알고리즘을 선택하고 크기 제외 제한을 입력합니다.

그런 다음, 획득한 데이터 세트의 선택된 몇 가지 이미지를 열고 세포 또는 미토콘드리아 분할 메뉴에서 C 또는 M 버튼을 각각 클릭하여 세분화 설정을 테스트합니다. 그런 다음 관심 폴더에 대한 일괄 분석에서 해시 버튼을 클릭하고 이미지가 있는 폴더를 선택합니다. 설정을 확인하고 확인을 누릅니다.

배치 분석 후 V 버튼을 클릭하고 이미지가 있는 폴더를 선택하여 검증 스택에서 세분화 성능을 시각적으로 확인합니다. 확인 스택을 통해 세분화가 성공했는지 확인합니다. 추출된 데이터의 초기 분석은 무료 Shiny 애플리케이션을 통해 자동으로 수행됩니다.

이를 통해 결과를 빠르게 해석할 수 있습니다. 시작하려면 R Studio에서 애플리케이션을 엽니다. 외부 브라우저에서 실행하도록 선택합니다.

입력 페이지에서 결과 파일이 있는 디렉토리를 선택합니다. 설치 파일도 이 디렉토리에 있는지 확인합니다. 결과 파일과 설정 정보는 자동으로 가져오고, 컴파일되고, 시각화됩니다.

실험 설정 페이지에는 실험의 레이아웃이 표시됩니다. 다음 페이지에는 ROS 수준과 각 플레이트에 대한 여러 미토콘드리아 매개변수가 개별적으로 표시됩니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 시각화할 플레이트를 선택합니다.

데이터는 다중 웰 플레이트 형식뿐만 아니라 웰과 이미지 번호로 레이블이 지정된 이상값이 있는 상자 플롯에도 표시됩니다. 결과 전체 실험 페이지에는 기본 통계 분석과 함께 결합된 모든 플레이트의 정규화된 결과가 표시됩니다. 입력 페이지를 통해 드롭 파일이 제공되면 지정된 데이터 포인트가 제외됩니다.

클러스터 분석 페이지에서 민감한 산화 환원 프로파일은 주성분을 사용하여 구성되고 5개 매개변수의 데이터를 분석합니다. 마지막으로, 데이터 다운로드 페이지에서는 처리 및 재정렬된 데이터를 나중에 사용할 수 있도록 저장할 수 있습니다. 다음은 HIV 프로테아제 억제제인 사퀴나비르(Saquinavir)로 인간 진피 섬유아세포를 치료한 실험 결과입니다.

설명된 프로토콜을 사용하여 기저 및 유도 ROS 수준 모두에 대해 상당한 증가가 감지되었습니다. 대조군 세포와 비교하여 DMSO로 처리했습니다. 사퀴나비르는 또한 미토콘드리아 형태 기능에 유의한 영향을 미쳤습니다.

미토콘드리아 픽셀당 평균 TMRM 신호로 측정된 미토콘드리아 막 전위가 크게 증가했습니다. 또한, 미토콘드리아는 매우 단편화된 패턴을 획득했으며, 이는 개별 미토콘드리아의 더 높은 순환성과 더 작은 평균 크기로 정량적으로 표시됩니다. 주성분 분석을 사용하여 앞서 언급한 파라미터를 결합할 때, 대조군 조건과 Saquinavir 조건은 모두 산화환원 지문에 의해 서로 명확하게 구분될 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 조명 자체가 산화 응력을 유발한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 노출 조건을 최소화하고 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지해야 합니다. 마스터하면 하루에 최대 20개의 96웰 플레이트를 염색하고 획득할 수 있습니다.

두 번째 이미징 라운드 후에는 세포를 고정하고 다운스트림 면역형광 염색에 사용할 수 있습니다. 이렇게 하면 정확히 동일한 셀에서 측정된 매개변수의 수가 증가하고 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 High-Content 현미경을 사용하여 부착 세포 배양에서 ROS와 미토콘드리아 형태 기능의 결합 측정을 수행할 수 있을 것입니다.