뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

세포에서 ROS 생산 또는 산화 스트레스를 측정하기 위한 몇 가지 방법이 있다. 이 중 2'7'디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브는 산화환원 상태를 직접 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 이 프로브는 친유성 및 비형광성이다. 세포막을 가로지르는 이 프로브의 확산은 두 개의 에스테르 결합에서 세포내 에스테라제 절단을 허용하여, 비교적 극성 및 세포막-불투과성 생성물을 생성한다. 이들 비형광성 분자는 세포내 축적되고, ROS에 의한 후속 산화는 고도로 형광성 생성물인 디클로로플루오레세인을 산출한다. 프로브의 산화는 다중 유형의 ROS의 작용의 산물이다. 이는 유세포 분석기 또는 공초점 현미경에 의해 검출될 수 있다. 이 기사에서는 디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브를 사용하여 유세포 분석기에 의해 ROS를 측정하고 정량화했습니다. 6웰 플레이트를 인큐베이터에서 층류 후드로 옮깁니다. 상층액을 흡인하십시오. 세포를 PBS로 한 번 세척한다. 웰 당 2 mL의 저혈청 DMEM을 첨가하십시오. 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 두 시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 여섯 시간 동안 항산화 제로 치료하십시오. 세포를 30분 동안 ROS 유도인자 A 또는 B로 치료한다. 상층액을 흡인하십시오. 세포를 PBS로 세 번 세척하여 모든 자극을 제거하였다. 층류 후드의 빛을 끄고 어둠 속에서 일하십시오. 페놀 레드가 없는 DMEM에 디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 1 mL를 첨가한다. 페놀 레드가 없는 DMEM 1 mL를 대조군 자가형광 대조군 세포에 첨가한다. 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다. 얼음 위의 접시를 실험실로 옮기십시오. 웰 당 2 mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 0.5 mL의 콜드 디테이칭 버퍼를 각 웰에 첨가하십시오. P1000 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 수확하십시오. 이들을 라벨이 붙은 1.5 mL 튜브에 모으십시오. 이들을 600 x g에서 5분 동안 4 C.Dis.Dis에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 버리고, 펠렛을 태핑으로 부드럽게 해리시킨다. FACS 완충액 1 mL를 첨가하여 세포를 각각의 표지된 튜브로 세척한다. 필요한 경우 펠릿을 완전히 해리시키기 위해 가장 낮은 강도의 와류를 사용하십시오. 4 C에서 5분 동안 600 x g에서 원심분리하십시오.이 단계를 두 번 더 반복하십시오. 총 세 번의 세척. 세포 펠릿을 200 L의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 와류를 사용하여 각 튜브의 펠렛을 부드럽게 완전히 해리시킵니다. 표지된 5 mL를 유동 세포계 튜브로 옮긴다. 유세포 분석기에서 분석 할 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 새로운 실험을 만듭니다. 표본을 클릭하면 튜브 목록이 열립니다. 두 번 클릭하고 이름을 바꿉니다. 자기 형광 제어 튜브를 흡인기기 암에 놓고 조심스럽게 왼쪽으로만 이동하십시오. 데이터 가져오기를 클릭한 다음 데이터 기록을 클릭하고 원하는 중지 조건을 선택합니다. 죽은 세포와 파편을 제외하고 관심있는 세포 주위에 문을 그립니다. 튜브를 분리합니다. 다음 튜브를 클릭하고 기본 제어 샘플을 실행합니다. 데이터 가져오기를 클릭한 다음 데이터 기록에서 소프트웨어를 엽니다. 샘플 추가 작업 단추를 사용하여 샘플을 추가합니다. 샘플 추가를 클릭합니다.실험 날짜 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다.작업공간에서 첫 번째 샘플인 자동 형광 컨트롤을 두 번 누릅니다. 다각형 게이트를 그려 죽은 세포와 파편을 제외한 관심있는 세포를 분리하십시오. 플롯을 히스토그램으로 변경합니다. M 내에서 두 번 클릭