의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석 Xenopus tropicalis
2017년 5월 25일
이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.
이 절차의 전반적인 목표는 Xenopus tropicalis 올챙이의 혈관 구조를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 혈관 신생을 조절하는 방법과 같은 심혈관 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 우물 유형 배아의 혈관을 간단한 형광 염료 주입으로 시각화할 수 있다는 것입니다.
먼저 마이크로 로더를 사용하여 테이퍼 유리 마이크로 피펫에 약 5마이크로리터의 투명 diI 아세틸화 LDL 용액을 채우고 침전된 입자가 적재되지 않도록 주의합니다. 해부 현미경에서 55개의 미세한 집게를 사용하여 피펫 끝을 자르고 업로드된 복합체의 부피를 조정하고 주입당 약 5나노 리터의 용액을 배출하도록 압력 제어 주입 시스템을 설정합니다. 그런 다음 피펫 팁을 0.04%MS-222, 0.1X, 변형된 Barth의 식염수 또는 MBS에 담그고 맞춤형 Sylgard 금형에 넣습니다.
다음으로 Xenopus tropicalis 배아를 Sylgard 주형으로 옮기고 등지느러미 자극에 대한 반응이 없는 완전한 진정을 확인합니다. 해부 현미경 아래에서 배아 복부 쪽을 약간 비스듬한 위치에 있는 주형의 V 모양 움푹 들어간 곳으로 장전합니다. 핀 홀더에 0.1mm minutian 핀 두 개를 단단히 끼우고 핀 하나를 사용하여 눈에 띄게 맥박이 뛰는 심장 위의 피부를 뚫습니다.
심장에 구멍을 뚫지 않고 심장과 피부 사이의 공간에 있는 구멍을 통해 핀을 삽입하고 절개가 이루어질 부위에 삽입된 팁을 위치시킵니다. 그런 다음 두 번째 핀을 삽입된 핀에 문질러 선형 절개를 만들고 두 핀을 함께 사용하여 절개 부위를 부드럽게 넓혀 심장을 노출시킵니다. DiI 아세틸화 LDL 용액을 주입하려면 유리 피펫 팁을 심장에 삽입하고 약 10번의 배출 펄스로 50-60나노 리터의 DiI 아세틸화 LDL을 주입합니다.
모든 염료 용액이 전달되면 심장이 여전히 박동하고 있는지 확인하고 배아를 0.1X MBS가 들어 있는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 5분에서 10분 후에 올챙이가 마취에서 회복되어 움직이기 시작한다. 적절한 수의 배아를 주입한 후, 올바르게 라벨링된 마취된 배아를 형광 현미경으로 육안으로 스크리닝하고 다른 장기가 라벨링된 동물은 모두 폐기합니다.
라벨링이 불충분하게 된 배아는 다시 주입할 수 있습니다. 그런 다음 올바르게 라벨링된 배아의 이미지를 캡처합니다. 혈관을 보다 철저하게 이미징하기 위해 재마취된 배아를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 컨포칼 현미경으로 시각화하기 위해 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 고정합니다.
충분한 양의 diI 아세틸화 LDL이 심장에 주입되면 형광 현미경으로 후방 추기경 정맥(PCV)을 즉시 볼 수 있어야 합니다. 체간 정맥(ISV)은 36단계에서 시작하여 40-41단계에서 끝나는 전방파에서 후방파로 PCV에서 등쪽으로 나타나 43기 주변에서 가볍게 분기됩니다. PCV와 ISV는 엄격한 발달 통제하에 있는 전형적인 혈관형성 패턴으로 성장합니다.
흥미롭게도, 안티센스 모르팔리노에 의한 TIE-2 시그널링의 녹다운은 ISV의 길이와 복잡성을 감소시키는 반면, TIE-2의 구조적 활성 형태의 발현은 과도한 ISV 분기를 유도합니다. 정맥 복잡성 지수를 계산하여 ISV의 복잡성을 평가할 수 있으며, 렌더링된 경로를 생성하여 배아 Xenopus tropicalis vascculature의 전체 아키텍처를 시각화할 수 있습니다. 원래 프로토콜은 Levin과 Colics에 의해 Xenopus laevis를 사용하기 위해 설명되었으며 Xenopus tropicalis에 맞게 조정되었습니다.
이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하기 전에 유전 및 약리학적 조작을 수행하여 어떤 유전자 및 신호 전달 경로가 혈관 발달을 조절하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차를 사용하면 표지된 혈관 구조를 온전한 동물에서 실시간으로 이미지화할 수 있으며, 이는 혈관 발달의 역학을 조사하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.
이 비디오를 시청한 후에는 Xenopus tropicalis 올챙이의 심장에 diI 아세틸화된 LDL을 주입하여 혈관 구조를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 형광 기반의 방법으로 Xenopus tropicalis의 혈관계를 시각화하고 그 복잡성을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 배아의 심장에 형광 염료를 주사한 직후 혈관을 이미지화할 수 있게 해주어, 체내에서 심혈관 발달에 대한 연구를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심혈관 생물학
- 혈관신생
- 발달 생물학
배경
- Xenopus tropicalis는 척추동물 발달 연구를 위한 모델 생물입니다.
- 혈관 발달을 이해하는 것은 다양한 질병에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 형광 이미징 기술은 생물학적 구조의 시각화를 향상시킵니다.
- 이 방법은 혈관 변화를 실시간으로 관찰할 수 있게 합니다.
연구 목적
- Xenopus tropicalis 올챙이의 혈관계를 시각화하기 위함입니다.
- 혈관신생의 조절을 조사하기 위함입니다.
- 심혈관 발달 연구를 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 배아의 심장에 형광 염료 주사.
- 정밀한 염료 전달을 위한 마이크로 로더와 테이퍼드 유리 마이크로 피펫의 사용.
- 해부 현미경 아래 혈관의 시각화.
- 혈관계에 미치는 영향을 연구하기 위한 유전적 및 약리학적 조작의 적용.
주요 결과
- 온전한 배아에서 혈관의 성공적인 시각화.
- 이미징을 통해 달성된 혈관 복잡성의 정량화.
- 심혈관 발달의 역학에 대한 통찰력 획득.
- 형광 염료 주사 방법의 효과성 입증.
결론
- 이 프로토콜은 혈관 발달을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 형광 이미징은 실시간 분석을 위한 강력한 도구입니다.
- 이 접근법은 심혈관 생물학에 대한 추가 연구를 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
