Name: 줄기 세포처럼 Xenopus의 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는 체외 및 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 배아의 blastocoel roof explants를 이용한 초기 신경 발달 메커니즘 연구 방법입니다. 이 기술은 세포 운명 결정과 이동을 분석하는 데 활용됩니다.

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저자는 Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef 및 Anne Hélène Monsoro-Burq의 도움과 조언, 그리고 퀴리 연구소의 동물 시설에 감사드립니다. 저자는 원고에 대한 편집 작업에 대해 Paul Johnson에게 감사를 표합니다. 이 작업은 Centre National de la Recherche Scientifique(CNRS UMR8197, INSERM U1024)와 "Association pour la Recherche sur le Cancer"(ARC 4972 및 ARC 5115; FRC DOC20120605233 및 LABEX Memolife) 및 Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039)가 있습니다.

실험은 과학적 목적 및 교체, 감소 및 정제 국제적으로 확립 된 원칙에 사용되는 동물의 보호에 관한 국가와 유럽의 규정을 준수합니다. Xenopus의 1. 평면 장착 후 올챙이 앞쪽에 신경 튜브를 laevis의 현장 하이브리드에서 전체 마운트 <ol><li> X를 얻습니다 표준 절차 4 그들이 26 세 이상 (Nieuwkoop 및 페이버 발달 테이블 (17)에 따라 neurula 단계에 도달 할 때까지 그들을 나이에 따라 배아를 laevis의. </li><li> 수정 (X) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 용액에 이들을 배양하여 laevis의 올챙이. 38 배아, 나중 단계에서 배아에 대한 실온에서 2 시간 무대 무대 26, 1 실온에서 시간 1.5을 바위와 2 mL 유리 병에 배아를 돌립니다. 주의 : PFA는 연락처 및 의심되는 발암 물질에 의한 독성. 그것은 후드 아래에 조작해야합니다. 참고 : 하나의 X를 laevis의의 무리입니다보통 2 mL 유리 바이알에 고정되지만 큰 유리 바이알이 사용될 수있다. </li><li> 두 번, 0.1 % 트윈 (PBT)와 1X PBS를 사용하여 동일한 유리 병에 배아, 실온에서 3 분을 씻으십시오. 참고 : 그렇지 않으면 사용 된 PBS를 지정하지 않으면 또는 칼슘과 마그네슘없이. </li><li> 동일한 바이알을 실온에서 적어도 12 시간 동안 100 % 메탄올 (MeOH 중)에서 배아 탈수. 플라스틱 마이크로 피펫을 이용하여 후드의 두 배 이상을 MeOH 100 %로 변경. 주 : 메탄올이에 용해 지질로 약간 노란색으로 변합니다. 메탄올은 흡입 독성 및 후드 조작해야합니다주의. </li><li> PBS, 메탄올 PBS에서 50 %, 두 번 PBS, PBS에 메탄올 25 %, 실온에서 각 조 ~ 10 분에 메탄올 75 % : 등급 메탄올 화장실의 시리즈를 통해 같은 병을 사용하여 배아를 재수. 메탄올 용액은 플라스틱 마이크로 피펫 후드 변경된다. </li><li> 플라스틱 피펫을 사용하여 배아 PBT와 정상에 가득 60mm 페트리 접시에 해부 될 전송할 수 있습니다. 두 미세 집게 관리를 사용하여완전히 광학 줄기의 수준에서, 눈과 신경 튜브 사이에 하나의 미세 집게를 삽입하여 눈을 제거합니다. 신경 튜브에서 눈을 분리합니다. 조심스럽게 신경 튜브 위에 놓인 외배엽 아래 집게를 소개합니다. 주의, 머리 뒤에서 시작하는 외배엽을 벗겨 폐기. </li><li> 사용하여 이중 또는 단일 ISH를 수행 제닌 표지 또는 이전 등의 형광 표지 된 프로브 (18, 19)을 설명했다. </li><li> ISH는 PBT는 플라스틱 피펫을 사용하여 함께 상단에 가득 찬 새로운 60mm 페트리 접시에 배아를 전송 한 후. </li><li> 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 배아의 나머지 부분에서 신경 튜브를 분리합니다. 이 단계에서, 전방 신경관은 후방 신경 튜브로부터 분리시킨다. 조심스럽게 신경 튜브, 느슨하게 신경 튜브, 귀의 소포 및 중배엽의 나머지 부분 아래에 붙어있는 척색 위에 놓인 외배엽의 나머지 부분을 분리합니다. 신경관이 어떤 부록없는 있는지 확인이 단계에서. 참고 : 필요한 경우 끝에서 끝 잘라 플라스틱 전송 피펫 모든 신경 튜브 / 배아 이식 또는 마이크로 피펫을 수행 신경관 손상을 방지합니다. 선단의 직경은 신경관의 크기로 조정된다. </li><li> 해부 신경 튜브로 이동 PBS에 희석하여 50 % 글리세롤 가득 1.5 ML 튜브에 (주 단계 1.9 참조). 신경 튜브 글리세롤 솔루션의 바닥에 떨어졌다 때까지 4 ° C에서 일반적으로 O / N, 기다립니다. </li><li> 50 % 글리세롤 용액을 제거 / PBS는 마이크로 피펫 P1000를 사용하고 동일한 1.5 ㎖의 튜브에 마이크로 피펫을 이용 P1000 90 % 글리세롤 / PBS 용액을 추가한다. 신경 튜브를 4 ° C에서 보통, 90 % 글리세롤 / PBS 용액의 바닥에 O / N 떨어질 때까지 기다리십시오. 주 : 장기간 보관시 세균 발생을 예방하기 위해 90 % 글리세롤 / PBS 플러스 항생제를 사용한다. </li><li> 유리판 또는 플라스틱 전송 피펫 현미경 슬라이드에 신경 튜브 옮긴다. </li><li> 지지느러미와 텅스텐 바늘을 사용하여 복부 midlines 따라 신경 튜브 종파. 그 단계에서 신경 튜브는 90 % 글리세롤 / PBS에 보관됩니다. </li><li> 유리 커버 슬립으로 덮여 보강 링을 사용하여 90 % 글리세롤 / PBS에 신경 튜브의 양면을 탑재합니다. </li><li> 니스로 된 커버를 고정하고 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol> 음이온 교환 수지 비즈를 사용하여 2. 동물 모자의 Explants 유도 <ol><li> 마이크로 피펫을 사용 P1000 2 ㎖의 튜브에 음이온 교환 수지 비드 100 ㎕를 전송. 멸균 증류수로 구슬을 적어도 연속 5 회 반복한다. 비드가 튜브의 바닥에 침전 및 마이크로 피펫 P1000을 사용 멸균 증류수를 대체 할 수있다. 구슬을 만지지 마십시오. </li><li> 비즈 4 ° C에서 소 혈청 알부민 (BSA) (10 ㎎ / ㎖)을 멸균 증류수로 채워진 2 ML 튜브에서 O / N을 담가 보자. </li><li> 두 시간 새로운 1.5 ml의로는 ACS, 구슬 대신 절반을 수집하기 전에마이크로 피펫 P1000을 사용하여 관. 분자를 포함하는 매체의 500 μL가 유도 가능성을 테스트하거나 특정 운명을 유도하는 것으로 알려져 수와 멸균 증류수를 교체합니다. 그들은 음성 대조군으로 사용되는 바와 같이, 비드의 나머지 절반을 유지한다. </li><li> 적어도 2 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션 구슬. </li><li> 실체 현미경 아래 모든 후속 단계를 수행하고 마이크로 피펫 모든 AC 전송을 수행합니다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 0.2 % BSA 보완 칼슘, 마그네슘과 PBS로 포배 또는 초기 낭배의 배아를 전송합니다. 참고 : 배아는 20-24 시간에 12 ° C의 범위의 포배와 낭배 단계에서 개발. </li><li> 이전 20 설명 된대로 집게를 사용하여 배아의 난황 막을 제거합니다. 한 집게와 배아를 수정. 다른 집게의 측면과 난황 막 핀치. 막 잡고 천천히 배아를 벗겨. VEN에서이 절차를 수행배아의 TRAL (식물) 측. 배아의 동물 측에 손상을주지 마십시오. </li><li> 이전 21 설명 된 바와 같이 작은 AC들을 격리 할 것. 동물 극은 배아의 착색 된 부분이다. 통해 미세 집게 동물 극에서 조직의 작은 사각형을 잘라. AC 조직은 외배엽 세포가 포함되어 있습니다. 조직이 균일 한 두께의 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 분석에서 AC를 제거합니다. </li><li> 바스의 식염수 (MBS) 4 수정 0.5 배에 테라 사키 멀티 웰 플레이트의 각 교류를 놓습니다. 잘의 둥근 바닥과 접촉, 아래로 착색 된 동물면 우물에 AC를 놓습니다. 주 : 0.1 % BSA 용액으로 코팅 피펫은 플라스틱에 접착 조직의 작은 조각의 접착을 방지한다. </li><li> 마이크로 피펫의 P20를 사용하여 각 캡에 하나의 구슬을 놓습니다. 필요한 경우라면, 상기 캡의 중심에 비드를 배치하는 집게를 사용한다. 주 : 조정 배지에 담가 때, 구슬 핑크 색상으로되어 있습니다. 대부분의 공동 선택lored 구슬. </li><li> 테라 사키 멀티 웰 플레이트를 이동하지 않고 실온에서 6 시간 동안 (18 22 ° C)에서 품어. 비드 미만 2 시간에서 AC 스틱. </li><li> 물에 적신 종이 위에 테라 사키 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 플라스틱 용기와 함께 접시를 커버. 참고 :이 &#39;습도 챔버는&#39;우물의 조기 증발을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 형제 배아가 인자의 효과를 테스트하기 위해 올바른 단계에 도달 할 때까지 배양 0.5X MBS 또는 3/4 남에서 ACS는 15-20 ℃에서 습도 챔버 (단계 4.1 참조). </li><li> 갓 준비한 4 % PFA 1 시간 동안는 ACS를 수정합니다. 이전에 (단계 1.4)에 설명 된대로 100 % 메탄올로는 ACS를 탈수. </li></ol> 3. 동물 캡 세포 해리와 재 응집 Xenopus의 laevis의 Neurula에 접목하기 전에 <ol><li> 코트 배양 접시 (60mm) 또는 칼슘과 마그네슘이없는 PBS 멸균 또는 3 % 아가로 오스 12 웰 플레이트. B를 커버하기에 충분한 아가로 오스 추가페트리 접시 또는 잘 ottom. RT (18 ~ 22 ℃로)에서 번호판을 미리 따뜻하게. 선택적으로, 탈수를 방지하기 위해 4 ° C에서 며칠에 대한 번호판을 저장. </li><li> 준비 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수 (60 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터의 KCl, 4.6 mM의 HEPES, 0.1 % BSA (A-7888 시그마의 pH 7.6)) 및 Holtfreter의 식염수 (60 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터의 KCl, 0.9 mM의 염화칼슘 2, 4.6 밀리미터 HEPES, 0.1 % BSA 산도 7.6) 5. 주 : 염화칼슘 (2)의 용액을 멸균 할 수 없다. </li><li> 아가로 오스 코팅 된 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수 상단에 잘 채 웁니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 자신의 ACS 분리 포배 또는 초기 낭배 배아를 준비 (2.7 2.5 단계). </li><li> 적어도 15, 30, 작은 AC들 (21)까지 격리합니다. 통해 미세 집게 동물 극에서 조직의 작은 사각형을 잘라. AC 조직은 외배엽 세포를 포함하기 때문에 균일 한 두께의입니다. 그렇지 않은 경우, 분석에서 AC를 제거합니다. 주 : 동물 극 엠브리입니다O의 색소 부분. </li><li> 으로는 ACS 이동 아니라 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수 정상에 가득 아가로 오스 코팅. 그들의 착색 된면이 위를 향으로는 ACS를 놓습니다. 주 : 해리 과정은 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수에 신속하게 시작합니다. </li><li> 세포가 해리 시작하는 데 몇 분 정도 기다립니다. 조직의 세분화를 통해이를 준수하십시오. 미세 핀셋을 이용하여, AC의 나머지 부분에서 착색 층을 분리하고 마이크로 피펫 P20 그들을 버린다. 완전한 세포 분리 과정은 서로 세포의 분리를 나타낸다. 참고 : 하나 또는 두 개의 색소 층이 접목 동안 시각화하는 데 도움이 재 집계 절편 내에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 원형 플레이트의 움직임을 이용하여 세포를 중심. 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 가능한 매체를 제거 P1000. 세포를 만지지 않도록주의하십시오. </li><li> 우물에 칼슘 Holtfreter의 식염수 1 ML을 추가합니다. 해리 AC들로 이동1.5 ML 튜브에. 주 : 2 ml의 튜브가 둥근 바닥으로 인해 사용할 수 없습니다. </li><li> 벤치 원심 분리기 (500 XG) 2,000 rpm의 최대 속도로 원심 분리하여 5 분간 세포 펠렛. 마이크로 피펫 P1000 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 해리 세포에 칼슘 Holtfreter의 식염수 (60 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터의 KCl, 0.9 mM의 염화칼슘 2, 4.6 mM의 HEPES의 20 μl를 추가, 0.1 % BSA (A-7888 시그마의 pH 7.6) 5. </li><li> 해리 AC들, 3 (18 ~ 22 ° C를) RT에서 시간 6 유지. 참고 :이 세포가 재 집계를하는​​ 데 필요한 시간이다. 세포가 튜브의 바닥에 작은 공 모양으로 재 응집이 보인다. </li><li> MBS의 0.5 배 또는 3/4 NAM 1 ㎖를 1 ㎖를 첨가하여 튜브의 바닥으로부터 신중 이식편을 분리한다 (단계 4.1 참조). 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 코팅되지 않은 판에 절편을 전송합니다. </li><li> 그들의 통제 형제를 사용하여 외식 무대. 장기 문화를 사용 항생제 : kanamyCIN (50 μg의 / ㎖), 암피실린 (50 μg의 / mL) 및 젠타 마이신 (50 μg의 / ㎖). </li></ol> 동물의 4. 손톱은 X의 신경 플레이트에서의 Explants 모자 laevis의 배아 <ol><li> 3/4 NAM 준비 (110 mM의 염화나트륨, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 칼슘을 (NO 3) 2, 1mM의 황산, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 수 NaHCO3, 0.2X PBS,를 50㎍ / ㎖ 젠타 마이신). 4 ° C에서 해부 및 저장을 위해 1 개 이상의 주 동안 보관하지 마십시오. 오래된 NAM은 아가 로스 코팅 해부 접시 (아래)의 제조에 사용될 수있다. </li><li> 코트 배양 접시 작은 구멍을 실리콘 몰드, 또는 탁구 라켓의 커버 중 하나를 사용하여 제조 된 3/4되는 NAM에 3 % 아가 로스 (60mm). 주 : 아가로 오스는 배양 접시의 바닥을 다룹니다. 페트리 접시는 3/4 NAM으로 채울 수 있도록 공간을 둡니다. 또는 비 건조 모델링 점토와 해부 요리를합니다. 점토 내에서 해부 과정에서 약간 배아를 짠다. 작은 구멍을 파아가로 오스 둥근 집게에게이 &#39;해부 접시&#39;를 사용하여 절개 과정에서 배아를 유지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 해부 도구를 수집 : 플라스틱 전송 피펫을, 22 개의 미세 해부 집게, P1000의 마이크로 피펫, 팁, 확대 8-40X와 stereosmicroscope (유리 파스퇴르 피펫의 끝에서 파라핀에 포함 된 눈썹 머리로 만든) &#39;눈썹 칼&#39; 광섬유 가이드 밝은 광원. 깨끗한 모든 해부 도구를 유지; 각 실험 후, 한 번에 100 % 에탄올, 증류수로 두 번을 세척하여 건조 할 수 있습니다. 금속 해부 도구 먼지로부터 필요한 오토 클레이브 경우 멀리 보관하십시오. </li><li> 하자 해리와 재 집계 AC들 (프로토콜 3), 그들의 형제 자매 (X) 그들은 단 13 (neurula)에 도달 할 때까지 laevis의 배아는 Nieuwkoop 및 페이버 발달 테이블 (17)에 따라 개발한다. 15 배아를 스테이지로 신경 판 단 (13) 내 이식에 사용됩니다. </li><li> 모든 수행실체 현미경 아래에 다음 단계. </li><li> 플라스틱 이전 피펫을 사용하여, 0.2 % BSA로 보충 칼슘 및 마그네슘과 PBS로 배아를 옮긴다. 이전 20 설명 된대로 배아의 난황 막을 제거합니다. 한 집게와 배아를 수정. 다른 집게의 측면과 난황 막 핀치. 단단히 막를 잡고 천천히 배아를 벗겨. 참고 : 배아의 복부 (식물) 측에서이 절차를 수행합니다. 태아에게 신경 판을 손상시키지 마십시오. 배아 난황 막 제거 공정 중에 손상되었을 경우, 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 3/4 NAM을 포함하는 60mm 페트리 접시에 배아를 전송하고 15 분, 치료 과정이 발생 할 수있는 충분한 시간을 기다린다. </li><li> 신선한 3/4 NAM으로 가기 해부 접시에 입력합니다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 해부 접시에 자신의 난황 막없이 배아를 전송합니다. 들로 태아에게 등의 측면 배치우물. 전사 과정 중 배아 X. 보낸 공기 - 액체 계면과의 접촉에 들어 가지 않도록 할 laevis의이 표면 장력에 의해 용해된다. </li><li> AC 이식편을 전송하는 플라스틱 전송 피펫 또는 마이크로 피펫 P1000을 사용하여 절개 판에 이식한다. 피펫은 액체 내부되면, 외식 천천히 중력에 의해 아래로 가라, 또는 아주 부드럽게 밀어 수 있습니다. </li><li> 둥근 집게와 배아를 유지한다. 눈썹 칼 당신이 당신의 절편의 조각을 접목하려는 신경 판에 절개를합니다. 참고 : 신경 판의 전방 굴곡이 랜드 마크로 사용할 수있는 단계 14에서,이 간뇌의 영역 (그림 4)를 표시합니다. </li><li> , neuroepithelium의 작은 조각을 잘라 둥근 집게와 눈썹 있입니다을 사용. 눈썹 칼 이식편의 작은 조각을 잘라. 주 : 이식편의 조각 neuroepithelium 절제 영역과 동일한 크기 및 형상에 관한이어야한다. </리&gt; <li> 눈썹 칼과 미세 집게를 사용 neuroepithelium 절개로 이식편의 조각을 놓습니다. 이식편 빠르게 배아에 연결되었는지 확인합니다. </li><li> 또한 장소에 이식을 유지하기 위해 이식 배아에 유리 커버 슬립의 조각을 놓습니다. 이렇게하려면 거친 집게를 사용하여 아주 작은 조각으로 고급 유리 커버 슬립을 잘라. 크기가 약 1.5 mm이 있는지 확인하십시오. 3/4 NAM 또는 PBS를 사용하여 집게를 포함하는 페트리 접시에 조각을 담가. 그것은 손상을 방지하기 위해서 배아보다 큰 유리 조각을 선택합니다. 배아는 조금 평평하게 될 것입니다. </li><li> 이동하지 않고 적어도 30 분 동안 기다리거나 만 부드럽게 해부 판을 이동합니다. 배아는 2 시간 30 분 동안 회복하고 필요한 경우 부드럽게 커버 슬립을 제거하자. 조심스럽게 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 3/4 NAM 가득 깨끗한 접시에 이식 배아를 피펫. 주 : 그래프트 된 배아는 세균 또는 진균의 오염을 개발하는 경향이있다. 장기 C의 경우가나 마이신 (50 μg의 / ㎖), 암피실린 (50 μg의 / mL) 및 젠타 마이신 (/ ㎖를 50㎍) ulture 항생제를 사용한다. </li></ol>

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신경 개발은 (3,31,32 검토) 주변 조직에서 세포 발달 프로그램과 신호 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 여기서 우리는 X.에 사용될 수있는 프로토콜의 집합을 기술 외부 및 신경 운명 결정과 시험관 및 생체 내에서 신경 형태 형성에 관여하는 본질적인 요소를 탐구하는 배아를 laevis의. 이러한 프로토콜은 X.에 그대로 사용 할 수있다 tropicalis 배아 그러나 X. tropicalis 배아는 X의 다음 네 번 작은 배아를 laevis의. 모두 필요성을 사용하는 집게와 텅스텐 바늘은 미세한한다. 가능하면 X를 사용 laevis의. X의 정확한 시각화 laevis의과 (X) tropicalis 신경 histogenic...

척추 동물의 신경계 세포의 neuroepithelial 균질 층으로서 신경 판으로부터 나온다. 개발 프로그램은 신경 판의 지역화 동안, 유도 인코딩 설립하는 방법을 이해하는 것은, 현재, 발달 생물학의 주요 목표입니다. 다른 시스템에 비해, 실험적 의무 Xenopus의 배아는 신경 발달의 초기 단계 1,2- 분석을위한 선택의 모델이다. 이 배아의 큰 숫자를 얻기 쉽고, 외부 개발 neurulation 3의 첫 번째 단계에 액세스 할 수 있습니다. 많은 도구를 실험적으로 Xenopus의 laevis의 (X를 laevis의) 배아 발달을 조작 할 수 있습니다. 마이크로 주입 함께 약리 도구를 유도 수법의 포함의 mRNA 또는 morpholinos (MO),의는, 함수의 이득 (GOF)과 기능 (LOF)의 손실과 경로 4,5 신호의 특정 변경을 제어 허용한다. 즐stocoel 지붕 외배엽은 포배, 또는 초기 낭배 배아 동물 기둥 주위에 위치하며 &quot;동물 캡 &#39;(AC)라고도 유전자 발현 이전에의 조작에 의해 프로그램 될 수있는 다 능성 세포의 공급원은 준비 외식. 이 원고 X.를 사용하는 상세한 프로토콜은 laevis의 교류 외식은 시험관 및 생체 분자 메커니즘 및 세포 프로세스 기본 신경 개발에서 테스트합니다. 기술은 제노 올챙이 신경 튜브에서의 유전자 발현 패턴의 미세 관찰 운명 결정 큐의 식별에 예비 단계를 허용되게된다. 평면 장착 조직 관찰은 통상적으로 병아리 배아 (6)의 연구에서 사용되는 반면, 그것은 적절 제노 푸스에서 설명되지 않았다. 2 또는 4 세포 단계의 배아의 할구로 합성의 mRNA 또는 MO 주입에 의한 유전자 발현의 조작은 AC의 프로그래밍을 할 수 있습니다(4) 외식. 안티 BMP 요인 머리의 발현에 의해 뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 경로의 예를 억제를 들어, AC 세포 3에 신경 정체성을 제공합니다. 프로토콜은 음이온 교환 수지 입자와 직접 접촉을 통해 외인성 단서 AC 이식편의 로컬 시간 및 노출 제어를 수행하기위한 상세한된다. 마지막 기술은 분해 및 재 관련 프로그램 별개의 세포로부터 제조 된 혼합 외식의 이식에 의해 생체 내에서 신경 전구 세포의 발달 기능을 테스트하기위한 기술되어있다. 개구리 배아 초기 척추 동물의 신경 발달을 연구하는 강력한 모델이다. 유전자 발현의 조작을 결합하여 체외 배양을 절편하기 neuroepithelium의 지역화, 확산 및 형태 형성 7-12의 연구에 중요한 정보를 제공합니다. AC 외식의 프로그래밍은 생체 13,14 기능 중심의 개발을 허용. 사용이식 절편의 15는 신경 능선 차별화 프로그램 (16)을 유도하는 최소한의 전사 스위치의 식별되었다. 조나의 limitans의 intrathalamica (ZLI)는 꼬리 전뇌의 성장과 지역화를 제어하는 소닉 고슴도치 (쉬)를 분비 신호 센터입니다. 연속적 쉬에 노출 될 때, 세 가지 전사 인자 유전자 coexpressing neuroepithelial 세포 - barH 형 호 메오 -2- (barhl2)는 orthodenticle -2- (의 Otx2)과 이로쿼이 -3- (irx3는) - ZLI 구획의 두 가지 특성을 획득 님 역량 쉿 표현, 그리고 앞쪽에 신경 판 세포로부터 분리 할 수있는 능력. 모델 시스템으로, neuroepithelial 세포에 ZLI 운명의 유도는 8 표시됩니다. 이러한 프로토콜은 기본 MEC를 탐험 발달 생물 학자와 다른 연구자에 대한 간단하고 저렴하고 효율적인 도구를 제공을 목표로키 신경 세포 행동의 hanisms. 이러한 프로토콜은 매우 다재다능하고 외부와 고유 신경 결정 큐의 큰 범위의 조사를 할 수 있습니다. 그것은 신경 계통 약속, 유도 상호 작용과 세포 행동의 생체 분석에서 장기를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>파라포름알데히드</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 20909.290</td><td>독성</td></tr><tr><td>음이온 교환 수지 비드</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>동물 캡pH 7.6</td></tr><tr><td>겐타마이신 배양용&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>항생제</td></tr><tr><td>소 세럼 알부민</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp; 비드 준비용</td></tr></tbody></table>

줄기 세포처럼<em&gt; xenopus의</em&gt; 배아의 explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

신경 발달의 기초가 되는 유전 프로그램을 이해하는 것은 발달 및 줄기 세포 생물학의 중요한 목표입니다. 양서류 포반에서 배반구의 지붕에서 나온 세포는 만능입니다. 이러한 세포는 분리될 수 있으며, 유전자 발현 조작 또는 모르포겐에 의한 유도를 통해 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 이 원고에서는 Xenopus laevis blastocoel 지붕 외식식물을 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 시험관 내 기능을 조사하기 위한 분석 시스템으로 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜을 통해 운명 획득, 세포 이동 행동, 세포 자율 및 비자율적 특성을 조사할 수 있습니다. 배반구 지붕 외식은 혈청이 없는 정의된 배지에서 배양하고 숙주 배아에 접목할 수 있습니다. 이러한 배아로의 이식을 통해 장기적인 계통 헌신, 유도 특성 및 생체 내에서 이식된 세포의 거동을 조사할 수 있습니다. 이러한 분석은 신경 발달의 기초가 되는 분자 메커니즘, 세포 과정 및 유전자 조절 네트워크를 조사하는 데 활용될 수 있습니다. 재생 의학의 맥락에서 이러한 분석은 약물 스크리닝에 사용할 수 있는 신경 유래 세포 유형을 in vitro에서 생성할 수 있는 수단을 제공합니다.

다른 종, 배아 조작 및 조절 유전자의 발현 패턴의 형태를 고려하여, 개념적 모델은 신경 판 구별 histogenic 필드를 생성 발달 그리드를 정의하는 가로 및 세로의 세그먼트로 분할되어 있음을 보유하고있다. 신경 판에서 전뇌, 중뇌, 후뇌와 척수의 primordia 모든 이미 (23-25 ​​검토) 낭 배기 중에 안테 - 후부 (AP) 축을 따라 설정됩니다. neurulation 동안 histogenic 필드는 유전자 발현의 공간적으로 제한된 영역으로 검출 할 수있다. 조절 유전자의 발현 패턴에 기초하여, 전뇌 primordium는 prosomeres (p)라고 구별 histogenic 필드를 생성 횡 여섯 개의 세그먼트로 분할된다. 각 prosomere은 복부 (기초)와 (26, 27에서 검토) 지느러미 (ALAR) 부분으로 나누어 져 있습니다. 양서류에서, prosomere 2(P2)는 epithalamus 및 시상 및 그...

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 x laevis 배반포강 천장 또는 동물극 캡 외식편을 사용하여 신경 발달의 기저에 있는 분자적 메커니즘과 세포 과정을 in vitro 및 in vivo에서 테스트하는 것입니다. 이러한 방법들은 운명 결정, 세포 이동, 그리고 신경 세포의 세포 자율적 및 비자율적 특성에 관한 발달 생물학 및 줄기 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 제시된 기술들은 핵심 신경 세포 행동의 근본적인 메커니즘을 탐구하기 위한 간단하고 저렴하며 다목적이고 효율적인 도구를 제공합니다.이 분석법들을 통해 유도 만능 줄기세포의 리프로그래밍을 위한 신경 운명 결정 요인을 테스트하고, 추가 스크리닝을 통해 신경 유래 세포 계통의 성숙한 생성을 확인할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 정교한 수작업 기술이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 저는 세포 분리 행동을 분석하는 방법을 고민하던 중 처음으로 이러한 방법들을 고안하게 되었습니다.xenopus laevis 전방 신경관을 평면 마운트하려면, 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 고정, 탈수 및 재수화된 배아를 PBT로 가득 채운 60 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 시신경 촉 돌기 높이의 눈과 신경관 사이에 미세 핀셋을 삽입하여 눈을 분리합니다. 그런 다음, 머리 뒤쪽 신경관을 덮고 있는 외배엽 아래로 핀셋을 조심스럽게 삽입하여 외배엽을 주의 깊게 벗겨냅니다.적절한 NC2 하이브리다이제이션 표지를 수행한 후, 배아를 PBT가 채워진 새로운 60 milliliter 페트리 접시에 옮기고 미세 핀셋을 사용하여 배아로부터 전방 신경관을 거칠게 분리합니다. 그런 다음 신경관 아래에 느슨하게 붙어 있는 척삭을 조심스럽게 제거합니다. 필요한 경우, 이낭과 중배엽의 나머지 부분도 제거합니다.신경관 부속물을 모두 절단한 후, 전방 신경관을 배아로부터 분리하십시오. 그 다음, 분리된 신경관을 50% glycerol과 PBS가 채워진 1.5 milliliter 원추형 튜브로 옮겨 4°C에서 하룻밤 동안 처리합니다. 90% glycerol로 두 번째 하룻밤 처리를 마친 후, 신경관을 소량의 glycerol과 함께 현미경 슬라이드로 옮기고 텅스텐 바늘을 사용하여 신경관의 등측 및 배측 중앙선을 따라 절개하십시오.그다음, 유리 커버슬립으로 덮인 보강 링을 사용하여 신경관의 양쪽 면을 90% glycerol 및 PBS에 마운팅합니다. 동물 캡 외식편 유도를 위한 비드를 준비하려면, P200 마이크로피펫을 사용하여 BSA 처리된 레진 비드 분량의 절반을 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 그 후, 새 튜브의 멸균 증류수를 관심 있는 실험 분자가 포함된 배지 200 microliters로 교체하고 4°C에서 2시간 동안 둡니다.배양 종료 후, blastula 또는 매우 초기 단계의 gastrula 배아를 0.2% BSA가 첨가된 calcium 및 magnesium 보충 PBS로 옮깁니다. 다음으로, 실체 현미경 하에서 한 쌍의 핀셋 측면으로 난황막을 잡고, 다른 핀셋을 사용하여 배아의 동물극 쪽이 손상되지 않도록 주의하며 식물극 쪽부터 막을 천천히 벗겨냅니다. 그런 다음, 미세 핀셋을 사용하여 각 배아의 동물극에서 작은 정사각형 조각을 절제합니다.BSA가 코팅된 피펫 팁을 사용하여 캡을 0.5X modified Barth's saline이 들어있는 Terasaki 멀티웰 플레이트의 개별 웰로 옮기며, 이때 색소가 있는 동물 쪽이 웰의 둥근 바닥에 닿도록 배치합니다. P20 마이크로피펫을 사용하여 처리 튜브에서 가장 진한 분홍색 비즈를 선택하고, 핀셋을 이용해 비즈를 캡의 중앙에 위치시키며 각 캡 위에 비즈를 하나씩 올립니다. 마지막 비즈를 모두 올리면 플레이트를 물에 적신 종이 위에 놓고, 배양 전 플라스틱 용기로 플레이트를 덮습니다.해리 및 재응집된 동물극 외식편을 준비하려면, 앞서 시연한 대로 15~30개의 동물극을 분리합니다. 미세 핀셋을 사용하여 동물극에서 작은 정사각형 모양의 조직을 잘라냅니다. 분리한 동물극을 칼슘이 없는 Holtfreter 식염수가 채워진 아가로스 코팅 웰에 색소 침착 부위가 위를 향하도록 옮깁니다.몇 분 후, 조직의 분리가 관찰될 것입니다. 미세 핀셋을 사용하여 색소층을 나머지 조직으로부터 분리하십시오. 그런 다음, P20 마이크로피펫을 사용하여 색소를 제거하십시오.색소층의 대부분이 제거되고 세포가 완전히 분리되면, 플레이트를 가볍게 돌려 세포를 중앙으로 모은 뒤 P1000 마이크로피펫을 사용하여 세포를 건드리지 않도록 주의하며 배지를 최대한 제거합니다. 그다음, 웰에 칼슘이 함유된 Holtfreter's saline 1 mL를 첨가합니다. 분리된 동물 캡(animal caps)을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.세포를 원심 분리한 후, P1000 마이크로파이펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 calcium이 포함된 20 µL의 Holtfreter's saline에 재현탁합니다. 세포가 실온에서 3~6시간 동안 다시 응집되도록 둡니다. 그 다음, 1 mL의 3/4 NAM을 천천히 첨가하여 튜브 바닥에서 설명물을 조심스럽게 분리하고, 플라스틱 전송 파이펫을 사용하여 설명물을 각각의 코팅되지 않은 플레이트에 분배합니다.동물극 외배엽(animal cap) 외편을 Xenopus laevis 신경판에 이식하려면, 먼저 60mm 페트리 접시에 3% agarose와 3/4 NAM을 코팅하고 작은 구멍들을 뚫어줍니다. 그다음, 초기 신경관 형성기(early neurula) 배아를 0.2% BSA가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 보충 PBS로 옮겨 난황막을 제거합니다. 이어서 agarose가 코팅된 해부 접시에 신선한 3/4 NAM을 채우고, 배아의 등쪽이 위로 오도록 하여 해부 접시로 옮깁니다.이제 재응집된 동물극 캡-외식편을 해부 플레이트로 옮깁니다. 이때 피펫 팁이 NAM 표면을 뚫고 들어가면 외식편이 중력에 의해 천천히 접시 바닥으로 가라앉도록 합니다. 그런 다음 실체 현미경 하에서, 둥근 핀셋으로 배아를 고정한 상태에서 텅스텐 바늘을 사용하여 외식편을 삽입할 신경판 부위에 절개를 가합니다. 둥근 핀셋과 눈썹 칼(eyebrow knife)을 사용하여 재응집된 동물극 캡-외식편의 작은 조각을 잘라냅니다.조직 파편을 사용하여 이식용 외식편 조각의 크기를 맞춥니다. 이 그림은 전체 마운트 NC2 이중 하이브리드화 후, 앞서 시연한 방식대로 평편하게 마운트된 단계 30, 32, 35의 X laevis 및 X tropicalis 전방 신경관을 보여줍니다. 이 이미지들에서 관찰할 수 있듯이, sonic hedgehog 유전자의 말단 부위가 첨가된 조건화 배지에 적셔진 비드와 접촉한 세포에서는 xenopus sonic hedgehog의 발현이 검출되었으나, 대조 배지로 처리된 비드와 접촉한 세포에서는 검출되지 않았습니다.방금 시연한 바와 같이 해리 및 재응집 과정을 거친 후, 전방화된 동물극 캡 세포가 포함된 이 외식편들을 Otx2를 발현하는 전방화된 동물극 캡 세포들과 혼합하였습니다. 관찰 결과, Otx2 발현 세포들은 Otx2 비발현 세포들로부터 분리되지 않았습니다. 두 유형의 세포 모두 외식편 전체에 걸쳐 자유롭게 섞여 있었습니다.반면, Otx2 발현 세포가 BAR HL-2, Otx2 및 IRX3 발현 세포와 혼합된 외식편의 경우, 다중 유전자를 발현하는 세포들이 응집된 패치를 형성하여 재응집된 외식편 내에서 균일하게 퍼지지 않았습니다. 앞서 시연한 바와 같이 이를 x laevis 배아의 전방 신경판에 이식했을 때, BAR HL-2, Otx2, IRX3를 공동 발현하는 세포와 N-terminus sonic hedgehog 발현 세포로 구성된 혼합 외식편은 내인성 sonic hedgehog 발현을 보였으며 전방 신경 상피 세포로부터 분리되었습니다. 반면, Otx2 및 N-terminus sonic hedgehog 발현 세포로 구성된 혼합 외식편을 x laevis 신경판에 이식했을 때, 이식된 세포들은 sonic hedgehog를 발현하지 않았으며 주변 세포들로부터 분리되지도 않았습니다.숙달되면, 이식하는 배아의 수에 따라 동물 캡 절편을 배아 신경판에 이식하는 과정은 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이는 매우 안정적이며 성과가 좋은 기술입니다. 이 절차를 시도할 때는 박테리아 및 곰팡이 오염에 각별히 주의하는 것이 중요합니다.이식 절차 이후, 이식된 세포의 운명과 행동을 추적하기 위해 전체 마운트 인시츄 하이브리다이제이션(whole mount in situ hybridization)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 신경관 기관 형성을 뒷받침하는 발달 프로그램은 특히 척추동물에서 상당 부분 보존되어 있습니다. 따라서 양서류에서 얻은 정보는 척추동물 발달의 근저에 있는 세포 및 분자적 과정에 대한 이해를 더욱 진전시켰습니다.

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

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의 해부<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 신경 크레스트<em&gt; 시험관</em&gt; 이식편 문화 또는<em&gt; 생체</em&gt; 이식

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우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

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줄기 세포처럼

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