줄기 세포처럼

본 프로토콜의 전반적인 목표는 x laevis 배반포강 천장 또는 동물극 캡 외식편을 사용하여 신경 발달의 기저에 있는 분자적 메커니즘과 세포 과정을 in vitro 및 in vivo에서 테스트하는 것입니다. 이러한 방법들은 운명 결정, 세포 이동, 그리고 신경 세포의 세포 자율적 및 비자율적 특성에 관한 발달 생물학 및 줄기 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 제시된 기술들은 핵심 신경 세포 행동의 근본적인 메커니즘을 탐구하기 위한 간단하고 저렴하며 다목적이고 효율적인 도구를 제공합니다.

이 분석법들을 통해 유도 만능 줄기세포의 리프로그래밍을 위한 신경 운명 결정 요인을 테스트하고, 추가 스크리닝을 통해 신경 유래 세포 계통의 성숙한 생성을 확인할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 정교한 수작업 기술이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 저는 세포 분리 행동을 분석하는 방법을 고민하던 중 처음으로 이러한 방법들을 고안하게 되었습니다.

xenopus laevis 전방 신경관을 평면 마운트하려면, 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 고정, 탈수 및 재수화된 배아를 PBT로 가득 채운 60 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 시신경 촉 돌기 높이의 눈과 신경관 사이에 미세 핀셋을 삽입하여 눈을 분리합니다. 그런 다음, 머리 뒤쪽 신경관을 덮고 있는 외배엽 아래로 핀셋을 조심스럽게 삽입하여 외배엽을 주의 깊게 벗겨냅니다.

적절한 NC2 하이브리다이제이션 표지를 수행한 후, 배아를 PBT가 채워진 새로운 60 milliliter 페트리 접시에 옮기고 미세 핀셋을 사용하여 배아로부터 전방 신경관을 거칠게 분리합니다. 그런 다음 신경관 아래에 느슨하게 붙어 있는 척삭을 조심스럽게 제거합니다. 필요한 경우, 이낭과 중배엽의 나머지 부분도 제거합니다.

신경관 부속물을 모두 절단한 후, 전방 신경관을 배아로부터 분리하십시오. 그 다음, 분리된 신경관을 50% glycerol과 PBS가 채워진 1.5 milliliter 원추형 튜브로 옮겨 4°C에서 하룻밤 동안 처리합니다. 90% glycerol로 두 번째 하룻밤 처리를 마친 후, 신경관을 소량의 glycerol과 함께 현미경 슬라이드로 옮기고 텅스텐 바늘을 사용하여 신경관의 등측 및 배측 중앙선을 따라 절개하십시오.

그다음, 유리 커버슬립으로 덮인 보강 링을 사용하여 신경관의 양쪽 면을 90% glycerol 및 PBS에 마운팅합니다. 동물 캡 외식편 유도를 위한 비드를 준비하려면, P200 마이크로피펫을 사용하여 BSA 처리된 레진 비드 분량의 절반을 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 그 후, 새 튜브의 멸균 증류수를 관심 있는 실험 분자가 포함된 배지 200 microliters로 교체하고 4°C에서 2시간 동안 둡니다.

배양 종료 후, blastula 또는 매우 초기 단계의 gastrula 배아를 0.2% BSA가 첨가된 calcium 및 magnesium 보충 PBS로 옮깁니다. 다음으로, 실체 현미경 하에서 한 쌍의 핀셋 측면으로 난황막을 잡고, 다른 핀셋을 사용하여 배아의 동물극 쪽이 손상되지 않도록 주의하며 식물극 쪽부터 막을 천천히 벗겨냅니다. 그런 다음, 미세 핀셋을 사용하여 각 배아의 동물극에서 작은 정사각형 조각을 절제합니다.

BSA가 코팅된 피펫 팁을 사용하여 캡을 0.5X modified Barth's saline이 들어있는 Terasaki 멀티웰 플레이트의 개별 웰로 옮기며, 이때 색소가 있는 동물 쪽이 웰의 둥근 바닥에 닿도록 배치합니다. P20 마이크로피펫을 사용하여 처리 튜브에서 가장 진한 분홍색 비즈를 선택하고, 핀셋을 이용해 비즈를 캡의 중앙에 위치시키며 각 캡 위에 비즈를 하나씩 올립니다. 마지막 비즈를 모두 올리면 플레이트를 물에 적신 종이 위에 놓고, 배양 전 플라스틱 용기로 플레이트를 덮습니다.

해리 및 재응집된 동물극 외식편을 준비하려면, 앞서 시연한 대로 15~30개의 동물극을 분리합니다. 미세 핀셋을 사용하여 동물극에서 작은 정사각형 모양의 조직을 잘라냅니다. 분리한 동물극을 칼슘이 없는 Holtfreter 식염수가 채워진 아가로스 코팅 웰에 색소 침착 부위가 위를 향하도록 옮깁니다.

몇 분 후, 조직의 분리가 관찰될 것입니다. 미세 핀셋을 사용하여 색소층을 나머지 조직으로부터 분리하십시오. 그런 다음, P20 마이크로피펫을 사용하여 색소를 제거하십시오.

색소층의 대부분이 제거되고 세포가 완전히 분리되면, 플레이트를 가볍게 돌려 세포를 중앙으로 모은 뒤 P1000 마이크로피펫을 사용하여 세포를 건드리지 않도록 주의하며 배지를 최대한 제거합니다. 그다음, 웰에 칼슘이 함유된 Holtfreter's saline 1 mL를 첨가합니다. 분리된 동물 캡(animal caps)을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

세포를 원심 분리한 후, P1000 마이크로파이펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 calcium이 포함된 20 µL의 Holtfreter's saline에 재현탁합니다. 세포가 실온에서 3~6시간 동안 다시 응집되도록 둡니다. 그 다음, 1 mL의 3/4 NAM을 천천히 첨가하여 튜브 바닥에서 설명물을 조심스럽게 분리하고, 플라스틱 전송 파이펫을 사용하여 설명물을 각각의 코팅되지 않은 플레이트에 분배합니다.

동물극 외배엽(animal cap) 외편을 Xenopus laevis 신경판에 이식하려면, 먼저 60mm 페트리 접시에 3% agarose와 3/4 NAM을 코팅하고 작은 구멍들을 뚫어줍니다. 그다음, 초기 신경관 형성기(early neurula) 배아를 0.2% BSA가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 보충 PBS로 옮겨 난황막을 제거합니다. 이어서 agarose가 코팅된 해부 접시에 신선한 3/4 NAM을 채우고, 배아의 등쪽이 위로 오도록 하여 해부 접시로 옮깁니다.

이제 재응집된 동물극 캡-외식편을 해부 플레이트로 옮깁니다. 이때 피펫 팁이 NAM 표면을 뚫고 들어가면 외식편이 중력에 의해 천천히 접시 바닥으로 가라앉도록 합니다. 그런 다음 실체 현미경 하에서, 둥근 핀셋으로 배아를 고정한 상태에서 텅스텐 바늘을 사용하여 외식편을 삽입할 신경판 부위에 절개를 가합니다. 둥근 핀셋과 눈썹 칼(eyebrow knife)을 사용하여 재응집된 동물극 캡-외식편의 작은 조각을 잘라냅니다.

조직 파편을 사용하여 이식용 외식편 조각의 크기를 맞춥니다. 이 그림은 전체 마운트 NC2 이중 하이브리드화 후, 앞서 시연한 방식대로 평편하게 마운트된 단계 30, 32, 35의 X laevis 및 X tropicalis 전방 신경관을 보여줍니다. 이 이미지들에서 관찰할 수 있듯이, sonic hedgehog 유전자의 말단 부위가 첨가된 조건화 배지에 적셔진 비드와 접촉한 세포에서는 xenopus sonic hedgehog의 발현이 검출되었으나, 대조 배지로 처리된 비드와 접촉한 세포에서는 검출되지 않았습니다.

방금 시연한 바와 같이 해리 및 재응집 과정을 거친 후, 전방화된 동물극 캡 세포가 포함된 이 외식편들을 Otx2를 발현하는 전방화된 동물극 캡 세포들과 혼합하였습니다. 관찰 결과, Otx2 발현 세포들은 Otx2 비발현 세포들로부터 분리되지 않았습니다. 두 유형의 세포 모두 외식편 전체에 걸쳐 자유롭게 섞여 있었습니다.

반면, Otx2 발현 세포가 BAR HL-2, Otx2 및 IRX3 발현 세포와 혼합된 외식편의 경우, 다중 유전자를 발현하는 세포들이 응집된 패치를 형성하여 재응집된 외식편 내에서 균일하게 퍼지지 않았습니다. 앞서 시연한 바와 같이 이를 x laevis 배아의 전방 신경판에 이식했을 때, BAR HL-2, Otx2, IRX3를 공동 발현하는 세포와 N-terminus sonic hedgehog 발현 세포로 구성된 혼합 외식편은 내인성 sonic hedgehog 발현을 보였으며 전방 신경 상피 세포로부터 분리되었습니다. 반면, Otx2 및 N-terminus sonic hedgehog 발현 세포로 구성된 혼합 외식편을 x laevis 신경판에 이식했을 때, 이식된 세포들은 sonic hedgehog를 발현하지 않았으며 주변 세포들로부터 분리되지도 않았습니다.

숙달되면, 이식하는 배아의 수에 따라 동물 캡 절편을 배아 신경판에 이식하는 과정은 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이는 매우 안정적이며 성과가 좋은 기술입니다. 이 절차를 시도할 때는 박테리아 및 곰팡이 오염에 각별히 주의하는 것이 중요합니다.

이식 절차 이후, 이식된 세포의 운명과 행동을 추적하기 위해 전체 마운트 인시츄 하이브리다이제이션(whole mount in situ hybridization)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 신경관 기관 형성을 뒷받침하는 발달 프로그램은 특히 척추동물에서 상당 부분 보존되어 있습니다. 따라서 양서류에서 얻은 정보는 척추동물 발달의 근저에 있는 세포 및 분자적 과정에 대한 이해를 더욱 진전시켰습니다.