포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

이 워크플로우의 전반적인 목표는 세포질 내에서 확인된 병소가 세포 생리학에서 중요한 역할을 하는 RNA 과립인 실제 스트레스 과립인지 여부를 확인하는 것입니다. 이 워크플로우의 가장 큰 장점은 응력 과립의 모든 기본 속성을 테스트한다는 것입니다. 이 워크플로우는 인간 골육종 U-2 OS 세포에 대해 제공되지만 다른 유형의 세포주 및 일차 세포에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 모든 스트레스 유발 병소가 스트레스 과립이 아니기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리의 워크플로우는 그것들을 구별하는 데 필요한 모든 실험으로 구성됩니다. Anais Aulus와 함께 이 절차를 시연할 것입니다.

우리는 Paul Anderson과 Pavel Ivanov의 연구실에서 박사 후 연구원입니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 24개의 웰 플레이트에 배치된 커버슬립에 세포를 시드합니다. 하룻밤 배양 후 24웰 플레이트의 웰 B1에서 B4까지, 그리고 C1에서 C4까지 배양 배지를 흡인합니다.

100마이크로몰 비소나트륨이 보충된 배지 500마이크로리터를 웰 B1 및 B2에 첨가한 다음 50마이크로몰 비소나트륨이 보충된 배지 500마이크로리터를 웰 B3 및 B4에 추가합니다. 다음으로, 150 마이크로몰 비노렐빈을 함유하는 배지 500마이크로리터를 웰 C1 및 C2에 추가합니다. 마지막으로, 125마이크로몰의 비노렐빈이 보충된 배지 500마이크로리터를 웰 C3 및 C4에 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 30분의 배양 후, 2열의 세포에 1밀리리터당 1밀리그램의 시클로헥시미드 용액 5마이크로리터를 추가하고, 4열의 셀에 1.25밀리리터당 1.25밀리그램의 푸로마이신 2마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 용액을 혼합하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 추가로 30분 동안 배양합니다.

세포를 고정하려면 웰에서 매체를 제거하고 약 250마이크로리터의 PBS로 세포를 세척합니다. 완충된 250마이크로리터의 4% 파라포름알데히드 용액을 추가하여 세포를 고정하고 커버슬립의 상단이 완전히 덮이도록 합니다. 그런 다음 접시를 실온의 벤치 로커에 15분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 파라 포름 알데히드를 제거하고 적절하게 폐기하십시오. 약 250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가하여 세포를 투과시키고 평평하게 만듭니다. 로커에서 실온에서 플레이트를 추가로 5분 더 배양합니다.

투과화가 완료되면 메탄올을 버리고 실온에서 약 250마이크로리터의 차단 버퍼를 1시간 동안 도포하여 세포를 차단합니다. 그런 다음 3ml의 차단 버퍼에 G3BP1 eIF4G 및 eIF3B에 대한 항체 12마이크로리터를 추가하여 1차 항체 용액을 준비합니다. 250마이크로리터의 항체 용액을 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

실온에서 최소 1시간 동안 로커에서 플레이트를 배양합니다. 배양 1시간 후 항체 용액을 제거하고 약 250마이크로리터의 PBS로 5분 동안 세포를 세척합니다. 다음으로, 12마이크로리터의 Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 및 Anti-Goat Cy5 항체와 3마이크로리터의 후크 염료를 3ml의 차단 완충액에 첨가하여 2차 항체 용액을 준비합니다.

각 웰에 250마이크로리터의 2차 항체 용액을 추가하고 플레이트를 덮어 샘플이 빛으로부터 보호되도록 합니다. 접시를 실온에서 1시간 동안 로커에 배양합니다. 배양이 완료되면 항체 용액을 제거하고 PBS로 5분 동안 세포를 세척합니다.

점도를 낮추기 위해 섭씨 37도의 열 블록에 매체를 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 미리 절단된 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 25마이크로리터의 장착 매체를 라벨이 부착된 유리 슬라이드에 놓습니다. 가는 집게를 사용하여 커버슬립을 웰에서 슬라이드로 옮기고 셀이 장착 매체를 향하도록 상단을 반전시킵니다.

깨끗한 P200 팁을 사용하여 커버슬립을 아래로 누릅니다. 모든 커버슬립이 장착되면 실험실 티슈를 슬라이드에 단단히 눌러 초과 장착 매체를 제거합니다. 그런 다음 슬라이드를 물로 씻어냅니다.

그리고 즉시 실험실 티슈로 다시 한 번 닦아내십시오. 접두사가 있는 세포를 실온에서 10분 동안 250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올로 배양하여 투과화합니다. 그런 다음 플레이트의 비어있는 웰에 약 250 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 추가하고 증발을 방지하기 위해 파라 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.

접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후 에탄올을 제거하고 500마이크로리터의 2XSSC를 첨가하여 세포를 재수화합니다. 커버슬립을 실온의 로커에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 용액을 버리고 500마이크로리터의 SSC를 한 번 더 추가합니다. 부드럽게 저으면서 플레이트를 5분 더 배양합니다. 다음으로, 혼성화 오븐 바닥에 파라필름을 겹겹이 쌓고 그 위에 25마이크로리터의 혼성화 완충액을 피펫팅합니다.

24웰 플레이트에서 커버슬립을 옮기고 세포가 혼성화 완충액을 향하도록 상단을 반전시킵니다. 커버슬립을 섭씨 42도에서 15분 동안 배양합니다. 25마이크로리터의 비오틴 올리고 dT 용액을 하이브리드화 오븐의 파라필름에 피펫팅합니다.

그런 다음 겸자를 사용하여 커버슬립을 집어 들고 가장자리를 실험실 조직에 두드려 과도한 혼성화 완충액을 제거합니다. 커버슬립을 비오틴 올리고 dT 용액으로 옮기고 세포가 앞면이 아래를 향하도록 하고 섭씨 42도에서 60분 동안 배양합니다. 혼성화가 완료되면 약 500마이크로리터의 예열된 2XSSC를 24웰 접시의 웰에 추가합니다.

그런 다음 겸자를 사용하여 커버 슬립을 우물로 옮기고 섭씨 42도에서 10 분 동안 배양합니다. 항체 용액으로 세포를 추가로 염색한 후 형광 현미경을 사용하여 표본을 봅니다. 여기에 제시된 것은 응력 과립 마커 G3BP1, eIF4G 및 eIF3B로 염색된 과립 또는 병소를 포함하지 않는 처리되지 않은 U-2 OS 세포의 이미지입니다.

비소나트륨 또는 비노렐빈으로 처리된 U-2 OS 세포에서 G3BP1, eIF4G 및 eIF3B를 포함하는 세포질 병소의 형성이 유도되었습니다. 이러한 마커의 공동 국소화는 증가된 배율에서 각 채널에 대해 수행된 라인 스캔 분석에 의해 확인된 후 얻어진 그래프의 슈퍼 부과에 의해 확인되었습니다. 또한, 처리된 세포에서 확인된 세포질 병소에는 poly A FISH에서 볼 수 있듯이 mRNA가 포함되어 있습니다.

올리고 dT 신호는 G3BP1 신호와 함께 국소화되어 응력 과립의 식별을 확인합니다. 일단 마스터하면 이 전체 워크플로우를 제대로 수행하기만 하면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 면역형광 및 형광 혼성화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

응력 과립의 올바른 특성화 및 식별에 중요한 단계입니다. 파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 PPE 사용 및 적절한 환기와 같은 예방 조치를 사용해야 합니다.