Name: 포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 스트레스 과립을 정확히 식별하는 방법을 면역형광 및 FISH 기술을 활용하여 U-2 OS 세포 모델로 연구합니다. 이 프로토콜은 세포 스트레스 반응 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는 이바노프 (Ivanov)와 앤더슨 (Anderson) 연구소의 회원들에게 도움이되는 토론과이 원고에 대한 피드백에 감사드립니다. 이 연구는 폴란드의 국립 과학 센터 [UMO-2012 / 06 / M / NZ3 / 00054]를 국립 보건원 (PA)의 GM111700과 CA168872, NSO94918의 PI에게 지원했다. WS는 또한 폴란드에서 과학 및 고등 교육부 (Mobility Plus Program)와 폴란드 - 미국 풀 브라이트 (Fulbright)위원회가 미국에서 자신의 연구를 재정 지원 한 사실을 인정합니다.

1. 세포 준비 <ol><li> 그림 1A 에 표시된 대로, 24 웰 플레이트의 12 우물에 autoclaved coverslips을 추가; 이것은 각 coverslip을 데리러 진공에 첨부 된 살균 파스퇴르 피펫을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 부드럽게 우물의 측면에 coverslip을 눌러서 coverslip가 우물에 떨어질 수 있도록 흡입을 해제하십시오. </li><li> 플레이트 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteoscomcoma 세포를 최종 용적 500 μL의 배양액에 넣습니다. 플레이트의 측면을 위아래로 여러 번 움직여 셀이 고르게 분포되도록합니다. </li><li> 부드럽게 coverslip 깨끗한 P1000 팁 coverslip가 우물의 바닥에 있는지 확인하고 coverslip 아래에 거품이 있는지 확인하십시오. </li></ol> 2. 스트레스 셀 <ol><li> 다음날, 시각적으로 세포가 균등하게 흩어져 있는지 확인하고 커버 슬립을 가로 질러 균등하게 합쳐져 있는지 확인하십시오.mples은 결과의 재현성에 악영향을 줄 수 있습니다. 거꾸로 조직 문화 현미경에 10X 목적을 사용하십시오. </li><li> 37 ° C로 매체를 예열하십시오. 차가운 충격이나 열 충격을 일으킬 수 있으므로 찬물 또는 뜨거운 종이를 셀에 가하지 마십시오. </li><li> 예열 된 약물에서 약물을 희석하십시오. 각각의 다른 약물 농도에 대해 500 μL의 배지가 포함 된 2 개의 웰을 준비하십시오. pipetting 동안 손실을 허용하기 위해 추가 500 μL를 준비하십시오. 나누어지는 4 개의 튜브, 각각 1.5 mL가 들어 있습니다. <ol><li> 아비 산 나트륨 : 500 μL를 함유하는 각 웰에 100 mM 아비산 나트륨 (최종 농도 : 100 μM) 1.5 μL를 첨가하거나 100 mM 아질산 나트륨 (최종 농도 : 50 μM) 0.75 μL를 첨가한다. </li><li> vinorelbine의 경우 : 500 μL를 함유 한 각 웰에 10 mM vinorelbine (최종 농도 : 150 μM) 22.5 μL를 넣거나 10 mM vinorelbine (최종 농도 : 100 μM) 18.75 μL를 넣으십시오. 주 : 아질산 나트륨<html> 잘 특성화되고 일반적으로 사용되는 스트레스 과립 유도제이며 따라서 고전적으로 긍정적 인 컨트롤로 사용됩니다. </li></ol></li><li> 웰 B1 - 4와 C1 - 4에서 미디어를 제거하고 버립니다. 약물로 미디어를 추가하고 60 분 (그림 1A)를 기다립니다. <ol><li> 우물 B1과 B2에 100 μM 아질산 나트륨과 함께 매체 500 μL를 추가합니다. 우물 B3과 B4에 50 μM 아질산 나트륨과 함께 매체 500 μL를 추가합니다. </li><li> 우물 C1과 C2 150 μM vinorelbine와 매체의 500 μL를 추가합니다. 우물 C3와 C4에 125 μm의 vinorelbine과 매체 500 μL를 추가합니다. </li></ol></li><li> 고정 30 분 전에 컬럼 2의 우물을 5μL의 시클로 헥시 미드 (1 mg / mL 주식)로 처리하고 컬럼 4의 우물을 2 μL의 퓨로 마이신 (1.25 mg / mL 주식)으로 처리하십시오. 부드럽게 37 ° C 배양기에 다시 접시를 배치하기 전에 혼합 접시를 흔들어. </li></ol> 3. 세포 고정 및 Immunofluorescence 실험에 앞서 메탄올이 -20 ° C로 냉각되었는지 확인하십시오. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), PBS (5 % 정상 말 혈청 (NHS)) 및 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA )을 PBS에 넣었다. <ol><li> 미디어를 폐기하고 PBS로 coverslips가 포함 된 우물을 씻으십시오. 사용 된 약물에 따라 마약이 들어있는 매체를 적절하게 버리는 것이 중요합니다. 자세한 지시 사항은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. 효율적으로 씻으려면 PBS로 쥐어 짜는 병을 채우고 꽉 짜인 흐름이 아닌 부드러운 흐름이 가능하도록 팁을 잘라내고 원래 PBS를 흡입 한 후 각 웰에 PBS를 넣으십시오. </li><li> 부드러운 교반하에 RT에서 15 분 동안 4 % PFA ~ 250 μL를 사용하여 세포를 고정. 완전히 PFA로 coverslip의 상단을 커버; 250 μL로 충분해야하지만, 그렇지 않은 경우 추가하십시오. 어떤 세포 (또는 세포의 스트레스 처리)가 부착을 변경할 수 있기 때문에 항상 coverslips에 직접 피펫을 피하십시오.그는 피펫 팅에서 세포를 제거 할 수 있습니다. </li><li> PFA를 제거하고 올바르게 버립니다. 파라 포름 알데히드를 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. </li><li> 메탄올 (-20 ° C) ~ 250 μL를 첨가하고 부드러운 흔들림하에 실온에서 5 분 동안 품을; 이것은 세포를 투과시키고 평평하게합니다. </li><li> 제거하고 메탄올을 버리고 4 ℃에서 RT O / N에서 1 시간 동안 5 % NHS ~ 250 μL를 적용하여 세포를 차단하십시오. 메탄올을 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. </li><li> 일차 항체의 경우 5 % NHS에서 항체를 희석합니다. 참고 : 여러 SG 마커를 사용하면 관찰 된 알갱이가 진품 SG인지 여부를 확인할 수 있습니다. 사용할 수있는 SG 마커의 수는 현미경에서 사용할 수있는 필터에 따라 다릅니다. 표준 녹색, 적색 및 원적외선 필터 세트를 사용할 수있는 경우 1/250 희석으로 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b를 사용하십시오. <ol><li&gt;이 실험 (각 250μL 12 coverslips - 총 : 5 % NHS 3 ML)에 다음 12 μL를 추가하십시오 : 항 -G3BP1, 항 -eIF3b 및 항 -eIF4G. 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 적어도 1 시간 동안 부드러운 교반을 사용하여 기본 항체를 품어. </li></ol></li><li> PBS로 웰을 3 회 세척하고 5 분 동안 각 세척을 배양한다. </li><li> 2 차 항체의 경우 5 % NHS에서 모든 2 차 항체 (1/250 희석)와 Hoechst 염료 (1 / 1,000 희석)를 희석하십시오. <ol><li> 이 실험 (각각 250 μL 12 coverslips - 총 : 3 % 5 % NHS)에 Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit 및 Cy5-Goat (각각 1/250 희석액)을 12 μL 씩 넣으십시오 Hoechst 염료 3 μL를 넣는다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 이차 항체와 coverslips을 품어. 이 단계와 다음 단계 동안 상자를 사용하여 플레이트를 덮거나 조직 배양 접시 상단에 호일을 놓아 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. </li></ol></li><li> 우리를 씻어 라.각각 5 분 동안 PBS로 3 회 주사합니다. </li><li> 마운트 매체를 사용하여 레이블이 붙은 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재하십시오. 10 분 37 ° C 열 블록에서 장착 매체를 가열; 이것은 점성을 감소시키고 피펫을 더 쉽게 만듭니다. 컷 P200 팁, 유리 슬라이드에 coverslip 당 장착 매체 25 μL 피펫; 현미경 스테이지가 이것을 허용한다고 가정 할 때 4-8 coverslips는 하나의 유리 슬라이드에 들어갈 수 있습니다. 미세 포 셉를 사용하여 슬라이드에서 well에서 coverslip을 전송, 설치 매체에 세포 측면을 넣어 있는지 확인하십시오. 깨끗한 P200 팁을 사용하여 coverslip을 누르십시오. </li><li> 모든 coverslips가 장착되면 접힌 실험실 조직을 사용하여 슬라이드에 매우 단단히 실험실 조직을 눌러 과도한 장착 매체를 청소합니다. 과도한 장착 매체를 제거하기 위해 H 2 O가 들어있는 짜낸 병을 사용하고 물을 제거하기 위해 접힌 실험실 조직으로 블로 팅을 반복하십시오. </li></ol> 4. 현장에서의 형광 &lt;/ em&gt; 하이브리드 화 (FISH) <ol><li> 단계 1과 2.1-4를 지침으로 사용하여 세포를 처리하고 처리하십시오. 다음 실험에서는 단 3 개의 커버 슬립이 필요하기 때문에 컬럼 1에 세포를 플레이트 할 필요가 있습니다. </li><li> 메탄올이 -20 ° C로 냉각되고 모든 완충액이 준비되었는지 확인하십시오 ( 예 : PBS에 4 % PFA, 물에 70 % 에탄올, 2x 염산 - 나트륨 - 시트르산 (SSC) 및 5 % NHS) 하이브리드 화 오븐은 적절한 온도까지 데워진다. </li><li> 셀을 씻어 고치려면 3.1-3.3 단계를 수행하십시오. </li><li> -20 ° C의 메탄올을 10 분간 첨가하여 세포를 침투시킨다. </li><li> 메탄올을 제거하고 70 % 에탄올로 coverslips을 품어. 접시를 4 ° C에서 밤새 두십시오. 증발을 방지하기 위해 파라 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. </li><li> 다음날, 에탄올을 제거하고 2x SSC 500 μL를 추가하여 세포를 재수 화하십시오. RT에서 부드러운 교반과 coverslips를 5 분 품어. </li><li> 2x SSC를 제거하고 500을 더하십시오.μL의 2X SSC. 온화한 교반하에 5 분 동안 품어 낸다. </li><li> 하이브리드 화 오븐의 바닥에 평행 한 파라핀을 놓습니다. 각 coverslip에 대한 parafilm에 하이브 리다이 제이션 버퍼의 피펫 25 μL. 24 - 잘 접시에서 coverslip을 제거 (이 시점에서, coverslips는 세포 측면입니다) 및 하이브 리다이 제이션 버퍼에 coverslip 셀쪽으로 내려 놓으십시오. 이것을 42 ° C에서 또는 65 ° C에서 15 분 동안 수행하십시오. 참고 : 65 ° C에서이 단계를 완료하면 세포 RNA가 변성됩니다. 이것은 polyA가 단백질과의 상호 작용에 의해 가리워지면 신호를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 버퍼에서 2 ng / μL의 농도로 Biotin-Oligo (dT) 프로브 (100 ng / μL)를 희석하십시오. coverslip 당 25 μL 충분합니다. </li><li> 각 coverslip 들어, parafilm에 Biotin - Oligo (dT)를 포함하는 하이브 리다이 제이션 버퍼 25 μL을 피펫. 집게로 coverslip을 들고 부드럽게 초과 커버를 제거하기 위해 실험실 조직에 coverslip의 가장자리를 만지지하이브리드 화 완충액. Biotin - Oligo (dT)와 하이브 리다이 제이션 버퍼 coverslip을 전송; 셀을 아래로 향하게하십시오. </li><li> 하이브 리다이 제이션 상자에 coverslips를 넣어 증발을 제한하십시오. 42에서 하이브 리다이 제이션 버퍼에 Biotin - Oligo (dT)와 coverslips를 품어 ° C. </li><li> 하이브 리다이 제이션 오븐에 2x SSC를 놓고 42 ° C로 평형을 유지하십시오. </li><li> 따뜻하게 2x SSC의 ~ 500 μL를 24-well dish의 well에 넣고 포셉을 사용하여 coverslips를 well로 옮깁니다. 10 분 동안 품어 낸다. </li><li> 42 ° C에서 두 번 위 세척 단계를 반복 한 다음 RT에서 두 번 반복합니다. </li><li> 3.5-3.10 단계를 완료하여 streptavidin fluorochrome을 사용하여 하나의 일반 항체 대신 Biotin-Oligo (dT)를 검출하십시오. </li></ol> 5. 번역 상태를 평가하기위한 Ribopuromycylation 분석 <ol><li> 1 단계에 표시된대로 coverslips에 U2OS 세포를 플레이트하지만, 조건 당 하나의 coverslip을 플레이트 (이 있음케이스, 3 개의 커버 슬립 : 비 처리, 100 μM 아질산 나트륨, 150 μM vinorelbine) ( 그림 1A). </li><li> 2 단계에서 프로토콜을 사용하여 세포에 스트레스를 가하고 2.1-2.4 단계를 완료하십시오. </li><li> 고정 전에 5 분 puromycin (주식 : 1.25 밀리그램 / ML, 5 μg / ML의 최종 puromycin 농도를 얻기 위해 500 μL에 희석 2 μL) 2 μL를 추가하고 2.9 μL emetine (주식 : 20 μg / ML; 2.9 μL를 이미 puromycin을 함유 한 동일한 용액에) 0.5 mL를 함유하는 각 웰에 첨가 하였다. </li><li> puromycin을 탐지하기 위해 anti-puromycin 항체 (1/1000 희석액)를 사용하여 위의 지시 된대로 3.1-3.10 단계를 완료하십시오. 이상적으로 나머지 채널에는 다른 두 개의 SG 마커를 사용하십시오. </li><li> puromycin 신호를 정량화 할 때 동일한 노출을 사용하여 모든 이미지를 촬영하십시오. 가장 밝은 (응력이 가해지지 않은) 샘플을 사용하고 채도없이 가능한 한 밝은 이미지를 촬영하여이 노출을 선택하십시오. 참고 : 안티 - puromycin 형광 신호의 강도 repres아미노산을 대신하는 퓨로 마이신 (puromycin)으로 진행되는 번역은 초기 단백질에 통합되어 단백질의 조기 종료를 강제합니다. </li></ol> 6. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 스트레스 과립의 정량화 <ol><li> SG를 정량화하기 위해 40X 대물 렌즈를 사용하여 샘플 당 총 100 개 이상의 세포를 3 ~ 5 개의 이미지로 수집합니다. 또는 다른 목표를 사용하여 이미지를 수집하지만 100 개 이상의 셀이 커버 슬립 당 계산되고 배율이 과립을 명확하게 시각화 할 수있을만큼 커야합니다. 커버 슬립을 5 개의 대략 동일한 영역으로 나누고 각 영역에서 임의로 필드를 선택하여이를 수행하십시오 ( 그림 1B ). 동일한 필드의 이미지에는 마커의 동시 표정을 평가하는 모든 채널이 포함되어야합니다. </li><li> 모든 이미지를 가져 오면 채널을 병합하십시오. 일부 카메라 소프트웨어는 자동으로이 작업을 수행하지만 다른 작업에서는 수동 병합이 필요합니다. 이것으로 할 수있다.ImageJ를 열어 모든 이미지를 열고 [이미지 | 색상 | 병합 채널]. </li><li> Hoechst를 핵 마커로 사용하여 핵의 수를 세어 총 세포 수를 수동으로 계산합니다. 셀 당 2 개 이상의 SG를 포함하는 셀 수를 수동으로 계산하십시오. 참고 : 예를 들어 G3BP1 (녹색), eIF4G (적색) 및 Hoechst (파랑)이 표시된 병합 된 3 채널 이미지를 사용하여 파란색 채널을 사용하여 핵 (또는 셀 수)을 계산합니다. 그런 다음 셀당 2 개 이상의 노란 초점을 가진 것으로 SG 양성 세포를 세십시오. 과립은 G3BP1에서 녹색으로, 노란색으로, colocalized 경우 eIF4G에서 빨간색으로 나타납니다. </li><li> 3-5 개의 독립된 지역의 데이터를 결합하여 SG 양성인 세포의 비율을 결정한 후 다음을 계산하십시오 : SG 양성의 수 / 핵의 수) * 100 = SG- 양성 세포의 퍼센트 </li></ol></li><li> 라인 스캔 분석을 통한 Colocalization 평가 - 수동 방법 <ol><li> 열다ImageJ. ()에서 무료로 다운로드하십시오. </li><li> 투자 수익 (ROI) 관리자를 엽니 다 : [분석 | 도구 | ROI 관리자 ...]. </li><li> ImageJ에서 병합 된 이미지를 엽니 다 : [File | 열다]. </li><li> ImageJ 도구 모음에있는 선 도구를 사용하여 SG를 통과하는 선을 추가하고 SG 앞뒤에 포함하십시오. ROI 관리자 창에서 [추가]를 클릭하여 ROI 관리자에이 행을 추가하십시오. </li><li> 병합 된 이미지를 별도의 채널로 분할하여 과립에 대한 각 표식의 현지화를 평가합니다. [이미지 | 색상 | 채널 분할]; 그러면 병합 된 이미지가 3 개의 흑백 이미지로 분할됩니다. </li><li> 흑백 이미지에서 선이 선택되었는지 확인하십시오. 이미지에 나타나면 선이 선택됩니다. 그렇지 않은 경우 ROI 관리자 창에서 패널의 라인을 클릭하십시오. 그러면 ROI 관리자 창에서 파란색 선이 강조 표시되고 흑백 이미지에 선이 표시됩니다. 회선이 여전히 표시되지 않으면 &quot;모두 표시&quot;가 chROI 관리자에서 확인한 다음 이미지의 선을 클릭하십시오. </li><li> 선의 강도를 분석합니다 : [Analyze | 플롯 프로파일]; 이것은 &quot;Plot Profile&quot;창을 불러 오며,이 창은 선을 가로 지르는 신호의 강도를 나타냅니다. </li><li> &quot;Plot Profile&quot;창에서 [List]를 클릭하면 그래프의 원시 데이터가 들어있는 창이 나타납니다. 이 창에있는 모든 데이터를 복사하여 스프레드 시트 파일에 붙여 넣으십시오. 이렇게하려면 창에있는 모든 데이터를 선택하십시오 : [Edit | 모두 선택]을 선택하십시오. 날짜 복사 : [편집 | 부]. 스프레드 시트 파일을 열고 데이터를 붙여 넣습니다 : [편집 | 풀]. </li><li> 각 채널에 대해 단계 6.2.6 - 6.2.8을 따로 완료하십시오. 평가중인 채널을 추적하십시오. </li><li> 스프레드 시트에서 결과의 선 그래프를 생성합니다. [control] 키를 누르고 각 열의 맨 위에있는 문자를 클릭하여 데이터가 포함 된 열을 선택하십시오. 그런 다음 선 그래프를 선택하십시오 : [Insert | 선 그래프]. </li><li> mult에 대해이 분석을 반복하십시오.여러 개의 독립적 인 실험에 걸쳐 스트레스 과립. </li></ol></li><li> 라인 스캔 분석으로 Colocalization 평가 - ImageJ Plugin <ol><li> ImageJ 웹 사이트 (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)에서 RGB 프로파일 도구를 다운로드하여 설치하십시오. 올바르게 설치되면 빨간색, 녹색 및 파란색 (RGB) 줄 아이콘이 도구 모음에 나타납니다. </li><li> ImageJ에서 이미지 ( 예 : Tiff, JPG)를 엽니 다. [File | 열다]. </li><li> ImageJ 도구 모음에있는 RGB 아이콘을 클릭하십시오. </li><li> 클릭하고 드래그하여 인접한 영역을 포함하여 SG를 통해 확장하는 선을 추가합니다. 히스토그램 이미지가 팝업 창에 나타납니다. </li><li> 데이터를 이미지로 저장하십시오 : [File | 다른 이름으로 저장 | 사소한 말다툼]. 또는 위에서 6.2.8 단계를 사용하여 다른 그래프 작성 프로그램에서 데이터를 내보내고 그래프로 나타낼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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만성 스트레스는 여러 질병에 대한 면역 조직 학적 연구에서 입증 된 바와 같이 다양한 세포 내 초점을 형성합니다. 예를 들어, 대부분의 신경 퇴행성 질환은 불용성 단백질의 세포 내 응집체를 특징으로합니다. 그러한 응집체에서 SG- 관련 단백질의 존재는 그러한 초점이 SG라고 결론을 내리기위한 기초가된다. SG 마커 양성 세포질 초점이 새로운 스트레스 자극으로 치료 된 세포에서 관찰되는 경우에도 유사한 결론이 도출된다. 이 프로토콜은 선의 SG를 식별하는 간단한 워크 플로를 제공합니다. 구성과 동역학의 특성을 포함하여 추정 SG를 확인하기 위해서는 몇 가지 기준을 충족해야합니다. 첫째, SGs는 translational stalled mRNPs를 포함하는 세포질 초점입니다. 따라서, 첫 번째 접근법은 두 가지 현미경 기반 기술, 즉 polyA-FISH 및 IF를 사용하여 조성을 특성화하는 것이다. 물고기는 시각적으로 신뢰할 수있는 방법입니다.SGs와 공존하는 m...

세포는 스트레스에 반응하는 많은 메커니즘을 사용합니다. 일부 반응은 전사 후 수준에서 일어나며 mRNA 번역 및 / 또는 안정성을 조절하는 것과 관련됩니다 1 , 2 . 스트레스 - 조절 된 mRNA 번역 정지 및 분해는 특이 적 비 막성 세포 초점의 형성과 관련되며, 가장 잘 특징 지어지는 스트레스 과립 (SGs) 3 . SG는 스트레스 ( 예 : 산화, 열 쇼크, 영양 결핍 및 바이러스 감염)에 반응하여 번역 상 체포 된 세포에 비 번역 mRNP를 집중시키는 세포질 초점입니다 4 . 비 번역 mRNA 외에도 SG에는 번역 개시 인자, RNA 결합 단백질 및 다양한 신호 단백질 5가 들어 있습니다. SG는 억제 된 단백질 번역 및 변형 된 RNA 신진 대사의 바이오 마커이며 세포 생존 및 세포 사멸, 신호 전달 경로와 관련되어있다s 및 핵 과정 5 . SG는 동적 엔티티이며, 그 형성은 셀룰러 변환 6 의 상태와 밀접하게 관련되어 있습니다. 외관상으로 튼튼한 외관에도 불구하고, 대부분의 SG 단백질 성분은 초 단위의 체류 시간으로 빠르게 출퇴근합니다. SG는 몇 시간에서 몇 시간 동안 지속되지만 대부분의 구성 요소는 빠른 속도로 흐릅니다. 번역 개시의 억제와 번역 폴리 소메 우스의 결과적인 분해는 SG의 형성을 촉진한다. 따라서 SG는 번역 폴리 소문과 평형을 이룹니다. 이 polysome / SG 평형은 다른 스트레스 유발 성 초점과 진실 SG를 구별하는 데 중요합니다 6 , 7 . 정지 개시 정지는 mRNA, 번역 개시 인자 (eIF) 및 40S 리보솜 서브 유니트를 함유하는 번역 - 유능한 사전 - 개시 복합체의 전환을 수반한다<html> o-48S 복합체)를 SGs 4 , 6 으로 통합 할 수있는 번역 상 지연된 복합체 (소위 48S * 복합체)로 전환시키는 것이다. SGs는 48S 복합체 형성의 상류의 2 개의 다른 단계에서 번역 정지에 의해 촉진된다 : 캡 결합 eIF4F 복합체 ( 예를 들어, 그의 eIF4A 서브 유닛을 표적으로하는 것)의 기능과의 간섭 또는 번역 개시 인자 eIF2의 α 서브 유닛의 인산화 4 종의 eIF2 키나아제 중 하나 이상을 포함한다. 정지 된 48S 복합체 ( 즉, 40S 리보솜 서브 유닛 및 선택된 번역 개시 인자)의 존재는 SGs 8 , 9 의 특징이다. SG는 바이러스 감염, 신경 변성,자가 면역 및 암과 같은 다양한 병리학 적 상태에 연관되어있다 3 , 10 , 11 ,ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . 몇몇 SG 성분의 돌연변이 형태는 뉴런이 뉴런의 죽음에 적극적인 역할을 할 수있는 세포 내 병적 흠도를 나타내는 신경 퇴행성 질환 ( 예 : 근 위축성 측삭 경화증)과 관련되어있다. 일부 바이러스는 SG 성분을 납치하여 SG 형성을 억제하고 바이러스 복제를 촉진시킵니다 14 . 최근의 연구들은 또한 화학 요법 및 방사선 치료법 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 하에서 SG를 암 15 와 암 세포 생존과 연관시킨다. 이러한 발견이 SG 생물학에 큰 관심을 자극하는 동안, 많은 발표 된 보고서는 선의 SG의 형성을 다른 스트레스 유발 성 초점과 구별하는 중요한 통제가 부족하다. SG는 처음에 T 세포 세포 내 항원 1 (TIA-1) 및 폴리 -A 결합 단백질 (PABP)을 포함하는 선택된 mRNA- 결합 단백질 (RBP)로 구성된 비 막성 세포질 초점으로 기술되었다; 번역 개시 요인; 폴리아 데 닐화 된 mRNA; 작은 리보솜 서브 유닛 4 , 6 , 21 , 22 . 전통적으로, 그들의 구성은 면역 염색과 형광 tagged 단백질 23 , 24 의 이소성 발현과 같은 기술에 의해 결정되었습니다. 그들의 매우 역동적 인 특성으로 인해, SG 단백질 및 / 또는 mRNA의 면역 로컬 ​​리 제이션은 SGs 23 , 24 를 검출하기위한 정의 방법으로 남아 있습니다. 지금까지 많은 RBP와 다른 단백질 (120 종 이상의 서로 다른 단백질)이 SG 구성 요소 11 로 묘사됩니다. 많은 SG- 지방화 된 단백질은 스트레스 의존성 및 독립적 인 방식으로 이들의 국소화를 변화시키고 다른 세포 내 구획 및 병소에 축적 될 수 있으므로, 정확한 SG 마커를 선택하고 SG를 다른 유형의 스트레스 유도 성 초점. 진실 된 SG는 mRNA, 번역 개시 인자 및 작은 리보솜 서브 유닛을 포함하며 번역과 동적 평형을 이룹니다. 이 간단한 작업 흐름은 스트레스에 의해 유발 된 초점이 진실한 SG인지 여부를 결정하도록 설계되었습니다. 이 워크 플로우에는 U2OS 세포를 사용하는 몇 가지 실험적 접근 방법이 포함되어 있습니다. SG는 SG를 연구하는 데 일반적으로 사용되는 세포입니다. 이 세포들은 큰 세포질을 가지고 비교적 평평하며 유리 커버 슬립에 강하게 부착되어 이상적입니다. SG를 연구하기 위해 다른 세포 유형을 사용할 수도 있지만 타이밍, 약물 농도 및 SG 핵 결정 단백질의 차이가 동질성을 변화시킬 수 있다는 사실을 알고 있어야합니다.상황. 또한 일부 세포는 세포 표면 표백제를 형성하여 파라 포름 알데히드 고정에 반응하여 일부 SG 마커의 점을 찍은 국소화를 유발하는 겉치레 모양을 나타낸다. 신중한 분석 없이는 SG로 잘못 분류 될 수 있습니다. 이것은 스트레스 유발 성 초점을 진실 SG로 식별하는 데 필요한 모든 기준을 평가할 필요성을 강조합니다. SG 22 를 촉진시키는 암 치료제 인 Vinorelbine (VRB)과 강력하고 잘 특성화 된 SG 유도제 인 Sodium Arsenite (SA)가이 프로토콜에서 실험을위한 스트레스로 사용됩니다. 표준 SG에는 세포질 초점에서 공존하는 여러 SG 마커 (단백질과 mRNA 모두)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 단백질 마커와 polyadenylated mRNA 22 의 국한을 각각 감지하기 위해 immunofluorescence와 형광 in situ hybridization (FISH)을 사용합니다. 간략하게, 간접 면역 형광법은 항체 ( 즉,이자형. 일차 항체)를 세포 내에서 검출 할 수 있습니다. 그런 다음 형광 색소에 부착 된 2 차 항체 (보통 종 특이성)가 1 차 항체를 인식하고 표적 단백질의 위치를 ​​밝혀냅니다. 형광 현미경 검사는 세포 내에서 국부 신호를 감지하는 데 사용됩니다. 다른 종에서 생산 된 항체를 사용하고 색이 다른 2 차 항체로 검출하면 여러 항체의 동시 발현을 검출 할 수있어 단백질 표적이 동일한 위치에서 발견됨을 나타냅니다 23 . 진실 된 SG에서 공존하는 것으로 확인 된 마커를 선택하는 것이 중요합니다. FISH는 특정 RNA 또는 DNA 서열과 염기쌍을 이루는 표지 된 프로브를 사용합니다 25 . mRNA를 검출하기 위해이 프로토콜은 mRNA의 polyA 꼬리 ( 즉, polyA FI)와 하이브 리다 이즈 (또는 염기쌍)하는 바이오 티 닐화 올리고 (dT) 40 프로브를 사용합니다SH). 그런 다음 streptavidin이 biotin에 대해 높은 친 화성을 가지기 때문에 형광 결합 형 streptavidin을 사용하여 biotinylated probe를 검출합니다. SG를 평가할 때 polyA FISH와 SG marker를 검출하는 immunofluorescence를 결합하는 것이 중요합니다. 실제 SG와 마찬가지로 두 신호가 함께 있어야합니다. 이 프로토콜을 사용하여 colocalization은 여러 가지 방법으로 평가됩니다. 다중 채널 ( 즉, RGB : 적색, 녹색 및 청색) 이미지에서 colocalization은 중첩 신호의 색상을 변경합니다 ( 예 : colocalized 빨간색과 녹색이 노란색으로 나타남). 또한, 각 색의 강도가 주어진 라인 8 , 20 에서 측정되는 라인 스캔 분석을 사용하여 동시 기록이 그래픽으로 정량화됩니다. 이 프로토콜은 ImageJ 26을 사용하는 두 개의 라인 스캔 분석 절차를 설명합니다. 하나의 절차는 수동이며 전체 프로세스를 진행합니다.다른 하나는 매크로를 사용하거나 수동 단계를 자동화하는 간단한 프로그램을 사용합니다. 매크로 절차를 이해하려면 수동 프로그램을 거치는 것이 중요합니다. SG가 번역이 억제 된 세포에서 형성된다; 따라서 SG가있는 세포는 처리되지 않은 세포에 비해 전체적인 번역 수준이 감소해야합니다. 실험적으로 ribopuromycylation이 사용됩니다. puromycin과 emetine은 고정되기 전에 짧은 기간 동안 세포에 첨가되어 puromycin이 적극적으로 폴리 펩타이드를 형성하게하여 종결을 일으킨다. 재 시술을 막기 위해 emetine을 사용한 치료가 필요합니다 29 . Puromycin은 Anti-Puromycin 항체를 사용하여 검출 할 수 있으며 활성 번역의 스냅 샷을 제공합니다. 이 방법은 빠르고, 특정 아미노산이 결핍 된 배지를 미리 굶주 리지 않아도 (그리고 잠재적으로 세포에 압박을 가하는) 필요가 없기 때문에 사용됩니다.단백질 변환의 세포 내 지방화. &quot;click-it&quot;화학 물질 30 과 결합 된 메티오닌 아날로그 L- 아지도 모아 라 인 (AHA)과 같은 변형 된 아미노산 유사체를 사용하는 다른 방법은 SG를 함유하는 세포가 이웃 세포보다 훨씬 낮은 번역을 나타내는 것을 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나,이 기술은 메티오닌 기아와 15-30 분 동안의 펄스 표지가 필요합니다. 메티오닌 기아 현상은 추가적인 스트레스를 구성하는 반면, 긴 표지 시간 ( 즉, 15-30 분)은 누적 이동보다 누적 이동의 측정을 초래하고 새로 합성 된 단백질이 합성 위치에서 세포. 대조적으로, 리보 푸로 마이신 화는 훨씬 빠르며 포도당 결핍을 통해 SG를 유도하는 데 사용되는 글루코스가없는 배지와 같은 모든 배지와 호환됩니다. 정식 SG는 동적 평형 상태에있다.적극적으로 폴리 소문을 번역합니다. 이것은 polysomes를 안정화 시키거나 불안정하게하는 약물로 시료를 처리하여 SG와 polysomes 사이의 균형을 바꾸어 실험적으로 평가할 수 있습니다 23 . Cycloheximide (또는 유사하게 행동하는 emetine)는 mRNA에 리보솜을 &quot;동결 시킴&quot;으로써 신장을 막아 SG를 형성 할 수있는 유효한 non-polysomal mRNP의 수를 감소시킨다. 실험적으로, 이것은 두 가지 방법으로 사용할 수 있습니다 : SG 생성을 막기 위해 스트레스를 가하기 전에 cycloheximide (또는 emetine)를 첨가하거나 SG가 형성 된 후에 cycloheximide (또는 emetine)를 첨가하여 스트레스를 제거하지 않고도 SG 해체 선발 착물은 서서히 폴리 소메 분획으로 들어간다. 대조적으로 puromycin은 조기 종결을 일으키고 폴리섬 해체를 촉진하여 SG로 조립할 수있는 mRNA 개시 풀을 증가시킵니다. 실험적으로 puromycin 치료는 SG의 수를 늘리거나 threshol을 낮 춥니 다.d는 등급이 매겨진 스트레스 나 약물 복용량에 반응하여 형성됩니다. puromycin의 영향을 평가할 때, puromycin이 약물의 효과를 증가시키고 SG를 나타내는 세포의 비율을 증가시킬 것으로 기대되기 때문에, 관심있는 약물의 최대 이하의 수준을 사용하는 것이 중요합니다. 이것은 약물 / 스트레스는 초기에 세포의 100 %에서 SG를 일으킨다. 이는 SG를 분해하고 세포의 ~ 95 %가 SG를 처음 표시 할 때 가장 잘 작동하여 최대 감소 가능성을 관찰하고 정확하게 정량화 할 수있는 cycloheximide 치료법과 대조됩니다. 이 프로토콜은 포유류 세포에서 SG를 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 방법은 다음과 같습니다 : (1) 추정 SG에서 전통적인 SG- 관련 마커 eIF4G, eIF3b 및 Ras GTPase- 활성화 단백질 - 결합 단백질 1 (G3BP1)을 동정 (colocalization)을 평가하기위한 면역 형광 염색 및 ImageJ 분석; (2) polyadenylated mRNA를 검출하기위한 올리고 (dT) 형광 in situ hybridization (polyA FISH); (3) 스트레스에 의해 유발 된 초점이 폴리 소메 움과 동적 평형에 있는지 여부를 결정하기위한 시클로 헥시 미드 및 푸로 마이신 치료; (4) 추정 SG를 함유하는 세포의 번역 상태를 평가하기위한 리보 푸로 마이신 화. 함께, 이러한 assays는 스트레스에 의해 유발 된 초점이 진실 된 SG로 분류 될 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; HTB-96&트레이드;</td><td>일반적으로 쓰여지는 "U2OS" Culture at 37 &deg; C 10% FBS/DMEM에서 5% 미만의 CO2</td></tr><tr><td>Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4.5g/L 포도당, 피루베이트 및 페놀 레드 함유 10% FBS, 10mM HEPES 및 페니실린/스텝토마이신 사전 예열 이전 약물 희석</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td> 배지 HEPES (1 M)<td>를 보충하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>배지 페</td></tr><tr><td>니실린 스트렙토마이신</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>배지 보충에 사용</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>실험실 티슈(kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>성장 커버 안경용 커버 글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>사용 전 오토클레이브 조직 배양 후드에서 멸균 상태 유지</td></tr><tr><td>나트륨(메타)비소 &ge; 90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>물에 1m 농도로 용해시킨 다음 100 &마이크로로 희석합니다. M 작업 원료로서의</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td> 에 물에 용해 <td>번역 수준 (리보푸로마이실화)을 평가하는 데 사용됨 -활성 번역 물에 10 mg/mL</td></tr><tr><td>에메틴 디하이드로클로라이드 수화물</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>로 희석일반적인 번역 수준을 평가하기 위해 퓨로마이신과 함께 사용 활성 번역 - 물에 10mg/mL</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td>로 희석 <td>활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용 물에 10mg/mL</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Wash buffer for immunofluorescence</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 시약 등급, 결정질 (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>흄 후드의 뜨거운 PBS에 4% 용액을 만들고 용해될 때까지 저어줍니다 부분 표본은 -20°C에서 저장할 수 있습니다. C 몇 달 동안 위험, 환기 사용 특수 폐기물</td></tr><tr><td>메탄올, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Prechill -20 &deg; C 사용 전 특수 폐기물에 폐기</td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>PBS 에서 5%로 희석 4°C에서 보관을 위해 아지드화나트륨을 첨가합니다. C 면역형광</td></tr><tr><td>차단 솔루션 에탄올, 순수, 200 프루프 (100%), USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>물로 70%로 희석</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 G3BP1 항체 (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>4 &deg; C 1/100 희석</td></tr><tr><td>토끼 anti eIF4G 항체 (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>4 &deg; C 1/250 희석</td></tr><tr><td>염소 항 eIF3&eta; (N-20) 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; eIF3b Store at 4 &deg; C 1/250 희석</td></tr><tr><td>마우스 안티 puromycin 12D10 항체</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>4 &deg에서 저장; C 1/1,000 희석</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstitute in water per manufacturer' s 명령어는 4 &deg; C 1/250 희석</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>제조사에 따라 물에서 재구성 s 명령은 4°Eg에 저장합니다. C 1/2,500 희석</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 염소 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>제조사에 따라 물에서 재구성 s 명령은 4°Eg에 저장합니다. C 1/250 희석</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 용액</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>2차 항체로 배양 dH20에서 ><0.5 mg/mL 저장 -4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>제조사별 수중 재구성 s 지침, 그런 다음 4 &deg에 보관하십시오. C 1/250 희석</td></tr><tr><td>올리고-(dT)40x 프로브 비오틴화</td><td>통합 DNA 기술(IDT)/</td><td></td><td>수중에서 100ng/mL로 재구성, 분취 및 -20°°C에서 보관; C 사용 전에 혼성 버퍼 1/50에 희석 맞춤 주문</td></tr><tr><td>혼성화 상자</td><td>/</td><td>/</td><td>바닥에 가습된 종이를 추가하여 모든 보관 슬라이드 박스로 수분 챔버를 만드십시오 - 사용 전에 상자를 미리 예열하십시오</td></tr><tr><td>20x SSC 버퍼</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>RNase Free water (DEPC 처리)를 사용하여 2x SSC로 희석하십시오 RT 에 보관하십시오. FISH</td></tr><tr><td>용 세척 버퍼PerfectHybPlus 혼성화 버퍼</td><td>시그마</td><td>H7033-50ml</td> FISH 슬라이드 장착 매체<td>용 블록 및 프로브 배양 버퍼</td></tr><tr><td></td><td>홈메이</td><td>드/</td><td>믹스 5g " 냉용성" 폴리 (비닐 알코올) 20 mL의 PBS < / > 혼합에 의해 초음파 처리에 의해 혼합 한 후, RT 에서 O / N을 교반 한 후 글리세롤 5 mL와 20 % 아지드 나트륨 0.2 mL를 첨가하고, 20 분 동안 20,000 g에서 RT 원심분리에서 16 시간 동안 교반하고, 큰 펠릿 < > 부분 표본 점성 액체를 버리고, -20 &deg의 장기 보관; C, 1 주일 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>폴리(비닐 알코올)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>비놀</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>비놀</td></tr><tr><td>아지드나트륨</td> 제조용 시약 <td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>방부제 및 vinol 물에 20% 희석</td></tr></tbody></table>

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

세포는 갑작스런 환경 변화로 종종 어려움을 겪습니다. 스트레스 조건에 노출 된 세포에서 형성되는 세포질 리보 뉴클레오타이드 복합체 인 스트레스 과립 (SGs)은 세포 대사 및 생존의 다양한 측면과 연관되어있다. SG는 세포 신호 전달 경로, 전사 후 유전자 발현 및 스트레스 반응 프로그램을 조절합니다. 이러한 mRNA- 함유 과립의 형성은 세포 번역에 직접 연결된다. SG 어셈블리는 억제 된 번역 개시에 의해 유발되고, SG 해체는 번역 활성화 또는 억제 된 번역 신장에 의해 촉진된다. 이 관계는 SG 구성에 의해 더 강조됩니다. 핵심 SG 요소는 번역 사전 개시 복합체, mRNA 및 선택된 RNA 결합 단백질 (RBP)이 정지 된 것입니다. SG 어셈블리의 목적은 번역 적으로 정지 된 하우스 키핑 (housekeeping) mRNA를 격리함으로써 세포 에너지를 보존함으로써 스트레스 반응성 단백질의 향상된 번역을 허용하는 것입니다. additi에서stalled translation preinitiation complexes와 같은 핵심 구성물에 SG는 다른 단백질과 신호 분자를 과다하게 포함하고있다. SG 형성의 결함은 스트레스에 대한 세포 적응을 손상시킬 수 있고 따라서 세포 사멸을 촉진시킬 수있다. SG 및 이와 유사한 RNA 함유 과립은 신경 퇴행성 장애 및 암을 비롯한 다수의 인간 질환과 관련되어있어 RNA 과립 아형의 분류 및 정의에 최근 관심을 갖게되었습니다. 이 프로토콜은 포유류 SG를 특성화하고 정량하기위한 분석을 설명합니다.

스트레스 유발 초점은 반드시 SG가 아닙니다. SG는 mRNA, 번역 개시 인자 및 RNA 결합 단백질을 포함하고 활성 번역과 평형을 이루는 세포질 초점으로 분류됩니다. 위의 프로토콜은 주어진 응력이 진정한 SG를 유도하는지 여부를 특성화하기위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다. SGs는 단백질과 mRNA를 포함한 다른 알려진 SG 마커와 함께 국소화됩니다. SA와 VRB는 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b를 포함하는 세포질 초점을 유도한다 ( 도 2A ). 이러한 마커의 동시 발색은 라인 스캔 분석 및 증가 된 확대율을 갖는 단일 채널 이미지를 사용하여 확인됩니다 ( 그림 2A ). 또한, 이러한 초점은 polyA FISH로 표시된 Mrna를 포함하고 oligo (dT) 신호는 G...

스트레스 과립 (SGs)은 다양한 스트레스에 노출 된 세포에서 형성되는 비 세포 성 세포질 구조입니다. SG는 mRNA, RNA 결합 단백질, 작은 리보솜 서브 유닛, 번역 관련 인자 및 다양한 세포 신호 전달 단백질을 포함한다. 이 프로토콜은 선량있는 SG를 탐지, 특성화 및 정량화하기위한 몇 가지 실험적 방법을 사용하는 워크 플로를 설명합니다.

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

이 워크플로의 전반적인 목표는 세포질 내에서 확인된 foci가 세포 생리에서 중요한 역할을 하는 RNA 과립인 실제 스트레스 과립(stress granules)인지 여부를 결정하는 것입니다. 이 워크플로의 주요 장점은 스트레스 과립의 모든 기본적인 특성을 테스트한다는 점입니다. 본 워크플로는 인간 골육종 U-2 OS 세포를 대상으로 제시되었지만, 다른 종류의 세포주 및 일차 세포에도 적용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 모든 스트레스 유도 초점이 스트레스 과립인 것은 아니기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 당사의 워크플로우에는 이를 구분하는 데 필요한 모든 실험 과정이 포함되어 있습니다. Anais Aulus와 함께 이 절차를 시연하겠습니다.저희는 Paul Anderson과 Pavel Ivanov 교수님 연구실의 박사후 연구원입니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 24-웰 플레이트에 배치된 커버슬립 위에 세포를 파종합니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 24-웰 플레이트의 B1에서 B4 및 C1에서 C4 웰의 배양액을 흡입하여 제거합니다.100 µM sodium arsenite가 첨가된 배지 500 µL를 B1 및 B2 웰에 넣고, 이어서 50 µM sodium arsenite가 첨가된 배지 500 µL를 B3 및 B4 웰에 넣습니다. 다음으로, 150 µM vinorelbine이 포함된 배지 500 µL를 C1 및 C2 웰에 넣습니다. 마지막으로, 125 µM vinorelbine이 첨가된 배지 500 µL를 C3 및 C4 웰에 넣습니다. 플레이트를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 30분간의 배양 후, 2열의 세포에는 1 mg/mL cycloheximide 용액 5 µL를, 4열의 세포에는 1.25 mg/mL puromycin 2 µL를 첨가합니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 용액을 섞은 후, 다시 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 추가로 배양합니다.세포를 고정하려면 웰에서 배지를 제거하고 약 250 µL의 PBS로 세포를 세척합니다. 세포를 고정하기 위해 약 250 µL의 완충된 4% 파라포름알데히드 용액을 추가하며, 이때 커버슬립의 윗부분이 완전히 덮이도록 합니다. 그런 다음, 실온의 벤치 로커에서 플레이트를 15분 동안 둡니다.다음으로 파라포름알데히드를 제거하고 적절하게 폐기합니다. 세포를 투과화하고 평평하게 펴기 위해 얼음처럼 차가운 메탄올 약 250 µL를 첨가합니다. 플레이트를 로커 위에서 실온으로 5분 더 배양합니다.투과화 과정이 완료되면 메탄올을 제거하고, 약 250 µL의 블로킹 버퍼를 처리하여 실온에서 1시간 동안 세포를 블로킹합니다. 그 다음, 3 mL의 블로킹 버퍼에 G3BP1, eIF4G 및 eIF3B 항체 12 µL를 첨가하여 1차 항체 용액을 준비합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 항체 용액 250 µL를 분주합니다.플레이트를 로커(rocker) 위에 올려놓고 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 1시간의 배양 후, 항체 용액을 제거하고 약 250 µL의 PBS로 5분 동안 세포를 세척합니다. 다음으로, 3 mL의 블로킹 버퍼에 12 µL의 Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 및 Anti-Goat Cy5 항체와 3 µL의 hooks dye를 함께 첨가하여 2차 항체 용액을 준비합니다.각 웰에 2차 항체 용액 250 µL를 첨가하고, 샘플을 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 덮습니다. 실온의 로커(rocker) 위에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양이 완료되면 항체 용액을 제거하고 PBS로 5분 동안 세포를 세척합니다.점도를 낮추기 위해 마운팅 매질을 37 °C 가열 블록에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 미리 절단된 200 µL 피펫 팁을 사용하여 라벨이 부착된 유리 슬라이드 위에 마운팅 매질 25 µL를 분주합니다. 미세 핀셋을 사용하여 커버슬립을 웰에서 슬라이드로 옮기되, 세포가 마운팅 매질을 향하도록 윗부분을 뒤집어 놓습니다.깨끗한 P200 팁을 사용하여 커버슬립을 아래로 누릅니다. 모든 커버슬립의 마운팅이 완료되면, 실험용 티슈를 슬라이드에 밀착시켜 눌러 과량의 마운팅 용액을 제거합니다. 그 후, 슬라이드를 물로 세척합니다.그런 다음 즉시 실험용 티슈로 다시 한번 닦아냅니다. 고정된 세포를 실온에서 250 µL의 얼음처럼 차가운 methanol과 함께 10분 동안 배양하여 투과화합니다. 그 후, 비어 있는 플레이트 웰에 약 250 µL의 70% ethanol을 넣고 증발을 방지하기 위해 parafilm으로 플레이트를 밀봉합니다.플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 에탄올을 제거하고 500 µL의 2XSSC를 첨가하여 세포를 재수화합니다. 커버슬립을 상온의 로커(rocker)에서 5분 동안 배양합니다.그 후, 용액을 버리고 SSC 500 µL를 다시 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어주며 5분 동안 추가로 배양합니다. 다음으로, 하이브리다이제이션 오븐 바닥에 파라필름을 깔고 그 위에 하이브리다이제이션 버퍼 25 µL를 피펫으로 분주합니다.24-웰 플레이트에서 커버슬립을 옮기되, 세포가 하이브리디제이션 완충액을 향하도록 윗부분을 뒤집습니다. 커버슬립을 42 °C에서 15분 동안 배양합니다. 하이브리디제이션 오븐 내 파라필름 위에 biotin oligo dT 용액 25 µL를 피펫으로 분주합니다.그 다음, 핀셋을 사용하여 커버슬립을 집어 올리고 실험용 티슈로 가장자리를 닦아 과잉의 하이브리드화 완충액을 제거합니다. 세포 면이 아래로 향하도록 하여 커버슬립을 biotin oligo dT 용액으로 옮긴 후 42 °C에서 60분 동안 배양합니다. 하이브리드화가 완료되면, 24웰 플레이트의 각 웰에 미리 데워둔 2XSSC를 약 500 µL씩 추가합니다.그 다음, 핀셋을 사용하여 커버슬립을 웰로 옮기고 42 °C에서 10분 동안 배양합니다. 항체 용액으로 세포를 추가 염색한 후, 형광 현미경을 사용하여 시료를 관찰합니다. 여기 제시된 이미지는 스트레스 과립 마커인 G3BP1, eIF4G 및 eIF3B로 염색된 과립이나 포커스가 없는 처리되지 않은 U-2 OS 세포의 모습입니다.sodium arsenite 또는 vinorelbine을 처리한 U-2 OS 세포에서 G3BP1, eIF4G 및 eIF3B를 포함하는 세포질 초점(cytoplasmic foci)의 형성이 유도되었습니다. 이러한 마커들의 공동 국소화(co-localization)는 고배율에서 각 채널에 대해 수행된 라인 스캔 분석(line scan analysis) 후 얻어진 그래프들을 중첩시켜 확인하였습니다. 또한, 처리된 세포에서 확인된 세포질 초점은 poly A FISH 결과에서 나타난 바와 같이 mRNA를 포함하고 있었습니다.oligo dT 신호가 G3BP1 신호와 함께 국소화되어 스트레스 과립(stress granule)의 정체성이 확인되었습니다. 숙달되면, 적절하게 수행할 경우 이 전체 워크플로를 3일 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 면역형광 염색 및 형광 하이브리다이제이션을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.스트레스 과립의 정확한 특성 분석 및 식별을 위해 중요한 단계들입니다. 파라포름알데히드를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있음을 유념하십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구(PPE) 착용 및 적절한 환기와 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Vonaesch, P. 외, 포유류 세포의 박테리아 도전 후 스트레스 과립 형성의 면역형광 분석. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 병원성 박테리아인 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri )에 의해 상피세포가 감염되고 그로 인한 숙주 세포 반응을 보여줍니다. 박테리아 효과 단백질은 숙주 번역을 방해하여 세포의 적응 반응인 스트레스 과립이라 불리는 막 없는 소기관 형성을 촉진합니다.

암성 상피세포의 시겔라 감염 중 스트레스 과립 형성

이 비디오는 mRNA, RNA 결합 단백질(RBP) 및 기타 다양한 단백질로 구성된 포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다.

포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 면역형광 분석

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

사회적 아메바 Dictyostelium discoideum은 최근 단백질 미스폴딩과 프로테오스타시스를 연구하는 시스템으로 확립되었습니다. 여기에서는 D. disccoideum에서 온도 유도 단백질 응집과 세포 스트레스 반응을 연구하기 위한 새로운 이미징 기반 방법론에 대해 설명합니다.

단백질의 품질 관리 시스템을 공부<em&gt; D. discoideum</em&gt; 온도 제어 라이브 셀 이미징을 사용하여

우리는 세포가 박테리아와 여러 가지 스트레스에 도전을받은 후 포유류 세포에서 스트레스 과립 형성의 정성 및 정량 분석 ​​방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 광범위한 호스트 - 박테리아 상호 작용에서 세포 스트레스 과립 반응을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

배우세요 포유류 세포에서 스트레스 과립을 정확히 식별하는 방법을 면역형광 및 FISH 기술을 활용하여 U-2 OS 세포 모델로 연구합니다. 이 프로토콜은 세포 스트레스 반응 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

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