Whitefly에서 Endosymbionts의 추출을위한 방법 베미 시아 타바시

이 실험의 전반적인 목표는 추가 실험을 위해 작은 곤충에서 내공생체를 추출하는 것입니다. 이 방법은 대부분의 내공생체는 체외에서 배양할 수 없기 때문에 곤충학 및 거시생물학 관점의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 추가 실험을 위해 적절한 양의 박테리아를 분리하는 방법이 매우 중요합니다.

이 기술의 주요 장점은 흰파리 박테리아 내공생체를 편리하게 분리할 수 있다는 것입니다. 이것은 또한 진딧물, 식물 호퍼 및 총채벌레와 같은 다른 곤충으로부터 내부 공생체를 분리하는 데 적용될 수 있습니다. 먼저 개별 성체 흰나비를 채취하여 30마이크로리터의 용해 완충액에서 균질화합니다.

균질산염을 섭씨 65도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 100도에서 10분 동안 기다립니다. whitefly DNA 및 미토콘디아 시토크롬 산화효소 1 프라이머를 사용하여 다음 시약을 사용하여 25마이크로리터 PCR 반응을 준비합니다.

그런 다음 여기에 표시된 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 실행합니다. 다음으로, 권장 프로토콜에 따라 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 산물을 세척합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 시퀀스 분석을 수행합니다.

흰나비 내 각 내공생체의 특정 유전자를 증폭하기 위해 흰나비 DNA에 PCR을 수행합니다. 이전에 발표된 프로토콜에 따르면, 증폭된 샘플을 아가로스 겔 전기영동 및 염기서열분석을 실시하여 흰나비 내의 박테리아 종을 결정하고 각 박테리아의 특정 유전자를 식별합니다. 흰나비균을 해부하고 정제하려면 100마이크로리터의 1x PBS 용액을 현미경 슬라이드에 추가합니다.

그런 다음 목화 잎에서 세 번째 또는 네 번째 instar 유충을 선택하십시오. 그리고 PBS에 몰입시키세요. 현미경으로 미세한 곤충 바늘을 사용하여 흰나비 몸에서 박테리아를 빼냅니다.

박테리옴은 작고 깨지기 쉬우므로 분리할 때 주의하십시오. 유충의 한쪽에 구멍을 부드럽게 자르고 다른 쪽을 살짝 눌러 박테리아를 배출합니다. 그런 다음 20 마이크로리터 마이크로로더를 0.5 - 10 마이크로리터 피펫에 장착하고 PBS에서 개별 박테리오메를 마이크로로더로 추출합니다.

박테리옴을 세척하여 다른 흰나비 조직의 오염을 제거하려면 박테리옴을 PBS에 파이프로 삽입하고 추출합니다. 세탁을 세 번 반복합니다. 가능한 한 많은 오염을 제거하기 위해 세탁을 반복하는 것이 좋습니다.

세척된 박테리아를 60마이크로리터의 PBS가 들어 있는 원심분리 튜브에 즉시 피펫으로 넣습니다. 주사기는 5마이크로미터 필터 멤브레인을 통해 조립된 박테리아를 여과합니다. 여과를 여러 번 반복하여 혼합된 액체를 멤브레인을 통해 완전히 이동합니다.

여과액을 증폭하려면 일부 변형이 있는 혈액 또는 세포의 게놈 DNA를 증폭하기 위해 권장되는 프로토콜과 함께 사용할 완충액 D2를 준비합니다. 1.5마이크로리터의 여과액을 원심분리 튜브에 직접 첨가한 다음 1.5마이크로리터의 완충액 D2를 추가합니다. 잘 섞어 얼음 위에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 1.5 마이크로 리터의 정지 용액을 첨가하십시오.

15마이크로리터의 반응 완충액과 1마이크로리터의 DNA 중합효소를 넣고 부드럽게 섞습니다. 혼합물을 섭씨 30도에서 16시간 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 3분 동안 배양합니다. 박테리아 종을 확인하기 위해 박테리아용으로 설계된 특정 프라이머를 사용하여 증폭된 여과액에 대해 직접 PCR을 수행합니다.

또한 이전에 발표된 방법에 따라 흰나비 유전자 beta-actin 및 EF1에 대한 프라이머를 사용하여 숙주 게놈의 오염 여부를 확인하기 위해 PCR을 수행합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 메타 게놈 염기서열분석을 수행합니다. 이 그림에서는 흰 파리를 기르기위한 목화와 흰 파리의 여러 발달 단계가 나와 있습니다.

성체와 첫 번째, 두 번째, 네 번째 instar 애벌레를 포함합니다. MEAM1의 네 번째 instar 유충 내에 있는 내공생체 Portiera와 Hamiltonella의 FISH 분석이 여기에 나와 있습니다. 두 박테리아의 중복이 관찰되며 둘 다 흰 파리의 박테리아 세포에 국한됩니다.

여기에 표시된 것은 흰나비의 Portiera 내공생체의 투과 전자 현미경 이미지로, Portiera가 세포벽을 잃을 수 있음을 나타냅니다. 어댑터와 복제에 대한 오염 데이터를 염기서열분석하고 정리한 후, 절대 공생체 Portiera의 완전한 게놈을 획득했습니다. 그 결과 358, 232 염기쌍의 원형 게놈

또한, 쌍을 이루는 말단 관계를 기반으로 89개의 골격으로 조립된 138개의 콘티그를 포함하는 해밀턴넬라의 게놈 초안을 얻었습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 20시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플이 환경 박테리아에 오염되지 않도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 RA 염기서열 및 질량 박테리옴과 같은 다른 분석을 수행하여 내공생체 유전자 발현 및 대사와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 곤충학 및 미생물학 분야의 연구자들이 곤충이나 절지동물에서 내공생체의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 곤충 박테리아에서 공생체를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일부 시약으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.