Name: 필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (TTFields를) 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 학습하세요 종양치료전기장(TTFields)을 활용한 암세포 성장 억제 방법을. 200kHz 주파수에서 최적의 효능을 확인하고 임상 적용을 위한 전임상 빈도를 식별하는 기술입니다.

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1. TTFields In Vitro Application System -베이스 플레이트 및 접시 유지 관리 <ol><li> 흐르는 수돗물에서 접시와 접시 커버를 헹구십시오. 그런 다음 탈 이온수로 헹구고 공기가 마른면이 아래를 향합니다. </li><li> 이전의 실험에서 화학 요법 제 / 약물을 접시에 첨가 한 경우, 각 접시에 5 %의 가벼운 세제 용액을 채우고 밤새도록 두십시오. <ol><li> 접시 안의 세제가 묻지 않도록 흐르는 수돗물에서 철저히 헹구십시오. 접시와 접시 커버를 탈 이온수로 헹구고 공기가 마른면이 아래로 향하게합니다. </li></ol></li><li> 뚜껑이있는 깨끗하고 건조한 접시를 멸균 봉투에 넣습니다. 봉인하고 접시를 아래로 향하게하여 봉투를 고압 증기 멸균기에 넣으십시오. 121 ° C 이하에서 30 분간 오토 클레이브합니다. </li><li> 건식 프로그램에 오토 클레이브를 넣고 오토 클레이브 도어를 열고 30 분 동안 접시를 말립니다. </li><li> 70 % 에탄올로 가볍게 적신 천으로 밑판을 닦으십시오. </li> &lt;/ OL&gt; 2. 실험 설정 참고 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 장비 및 재료는 재료 목록에 설명되어 있습니다. 멸균 조건이 유지되는 동안 모든 단계 이하 층류 캐비닛 내부에서 수행되어야한다. <ol><li> 섹션 1에서 설명 된 바와 같이 깨끗하고 멸균 TTFields 요리 및 커버를 준비 가볍게 70 % 에탄올로 적신 천으로 기판을 닦아 낸다. </li><li> 접시에 가볍게 누르면서 상기베이스 플레이트의 핀에 세 접시 잠금 가장자리까지 약 5mm 시계 방향으로 회전하여 기판 상에 덮개와 TTFields 요리를 설치한다. 각 접시의 바닥에 멸균 22 mm의 커버 슬립 (처리 된 플라스틱 또는 유리)를 놓는다. </li><li> 완전 성장 배지에서 세포 현탁액 (U-87 MG 및 F98에 대한 둘 베코 변성 이글 배지를 준비;를 RPMI A2780 및 OVCAR-3]에 기재된 바와 같이 보충 재료 목록). 참고 : CE1 농도는 세포 유형과 실험 기간에 따라 다르며, 80 % -90 %의 합류 세포 성장은 실험이 끝날 때까지 초과되어서는 안됩니다. 주의 : 사람의 세포주는 생물학적 위험을 나타낼 수 있으므로 적절한 안전 조치를 취해야합니다. </li><li> 접시의 뚜껑을 덮고 각 coverslip의 중심에 드롭으로 세포 현탁액 (배증 시간에 따라 72 시간 실험 200 μL에 일반적으로 5,000-20,000 셀) 200 μL를 놓으십시오. </li><li> 세포가 고착 될 때까지 CO2 배양기에서 37 ° C로 인큐베이션하십시오. 이 단계에서 하룻밤 배양이 가능합니다. </li><li> 200 또는 1,000 μL 피펫을 사용하여 액체 방울을 토출하십시오. </li><li> 부드럽게 각 접시를 채우기 위해 완벽한 성장 매체 2 ML 피펫. 멸균 팁을 사용하여 피펫 팅하고 부드럽게 슬라이드 아래에 붙잡힌 기포를 풀어 coverslip 가장자리를 누릅니다. </li><li> 그들의 뚜껑을 가진 접시를 덮고 그 (것)들을 안으로 두십시오TTFields 처리 개시까지 37 ° C에서 CO 2 인큐베이터 IDE. </li></ol> 3. TTFields 응용 프로그램 <ol><li> 냉장 CO 2 인큐베이터에 부착 TTFields 요리베이스 플레이트를 옮긴다. 참고 : 체외 TTFields 응용 프로그램이 열을 발생시킵니다에서; 따라서, 냉장 인큐베이터는 요리의 온난화 보상하기 위해 필요합니다. TTFields 높은 강도는 더 많은 열을 생성하며 배양기 낮은 주위 온도를 (표 1 참조)를 필요로한다. TTFields 애플리케이션 인큐베이터 온도는 18-30 ℃의 범위에있을 때, 임상 적 TTFields 강도를 얻을 수있다. </li><li> 베이스 플레이트에 플랫 케이블의 암 커넥터를 연결합니다. 에 TTFields 발생기를 전환합니다. </li><li> 생체 응용 시스템 소프트웨어의 TTFields를 시작하고 실험 설정을 선택합니다. <ol><li> 새로운 실험을 정의합니다. 특급의 이름을 입력컴퓨터 화면의 소프트웨어 사용자 인터페이스에서 실험 주체와 실험자를 선택합니다. 각 접시 또는베이스 플레이트의 주파수 및 목표 온도를 조정하십시오. </li></ol></li><li> 소프트웨어를 사용하여 TTFields 응용 프로그램을 시작하십시오. </li><li> 모든 요리가 제대로 연결되고 모니터에 하늘색으로 표시되는지 확인하십시오. 접시에 빨간색 프레임이 원을 그리면 (제대로 연결되어 있지 않음을 의미) 부드럽게 아래로 누르고 연락처가 복원되고 접시가 하늘색으로 나타날 때까지 앞뒤로 천천히 회전합니다. </li><li> TTFields 체외 진단 시스템을 최대 24 시간 동안 작동 상태 로 두십시오. </li><li> 실험이 종점에 도달하면 소프트웨어에서 END EXPERIMENT 버튼을 클릭하여 실험을 중지하고 5 단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 PAUSE 실험을 클릭합니다. </li><li> 베이스 플레이트에서 플랫 케이블 커넥터를 분리하십시오. 인큐베이터의 접시로 바닥 판을 층류 캐비닛으로 옮긴다. </li><li> 모든 접시에 매체를 넣으십시오.ES마다 24 시간 및 냉장 인큐베이터로 기판을 반환. 플랫 케이블을 사용하여 발생기에베이스 플레이트를 연결합니다. 계속 버튼을 클릭하여 실험을 계속합니다. </li></ol> 4. 제어 샘플 참고 : TTFields 응용 프로그램을 제외한 TTFields 처리 된 세포와 유사한 조건에서 대조군 세포를 성장. <ol><li> 동일한 서스펜션과 TTFields 처리 된 샘플을 도금에 사용되는 유사한 표면 플레이트 대조 시료. </li><li> 37 ℃에서 CO2 인큐베이터에서 제어 요리를 놓는다. </li><li> 요리의 매체에게 TTFields 처리 접시 매체 환경에 맞는 24 시간마다 교체합니다. </li></ol> 5. 실험 종료 <ol><li> 최종 실험을 클릭하면, 시스템에서 모든 레코드를 검색하기 위해 소프트웨어를 기다리고 컴퓨터에 기록을 저장합니다. </li><li> 온도, 전류, 저항 로그 F를 검토 보고서 버튼을 사용하여각베이스 플레이트 세틸 모든 음식이 실험 계획에 따라 처리되었는지 확인한다. 참고 : 모든 보고서 및 로그 실험이 끝난 후 컴퓨터에 저장되어 언제든지 검토 할 수 있습니다. </li><li> TTFields 생성기를 끕니다. </li><li> 상기베이스 플레이트로부터 플랫 케이블을 분리하고 배양기로부터 제거한다. </li><li> 아래 세라믹 접시 눌러 제거하고베이스 플레이트에서 잠금을 해제 시계 반대 방향으로 접시를 돌립니다. </li><li> 층류 캐비닛에 요리를 가지고 무균 커버 슬립을 제거합니다. 상기 검사 및 평가를위한 신선한 배지 또는 인산 완충 식염수 (PBS)를 함유하는 페트리 접시를 멸균로 전송. </li></ol> TTFields 효과의 평가 6 참고 : TTFields &#39;효과는 여러 가지 방법으로 측정 할 수있다. 처리되지 않은 대조군 세포에 처리 한 세포를 비교하려면 다음 방법 중 하나 이상을 사용합니다 : <ol><li> 셀 수<ol><li> 각 coverslip - 포함 접시에서 매체 / PBS를 제거합니다. </li><li> 각 접시에 0.25 % 트립신 / EDTA 0.5 ML을 추가하고 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 최대 10 분 ( 즉, 세포가 coverslip 표면에서 분리 시작할 때까지)에 품어. </li><li> 트립신을 중성화하고 위아래로 부드럽게 pipetting하여 세포를 다시 일시 중지 완전한 성장 매체 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 낮은 세포 농도 ( 즉, 약 20,000 세포 / ML) 계산과 호환되는 표준 세포 계수 기술을 사용하여 세포를 세십시오. </li></ol></li><li> 클로 론젠 지아 분석법 <ol><li> 신선한 완전한 성장 매체의 2 ML을 포함하고 새로운, 살균 페트리 접시 또는 6 잘 접시에 각 접시에서 세포 (접시 당 100-500 셀)의 비슷한 번호를 접시. </li><li> ~ 50 세포로 구성된 식민지가 형성 때까지 1-3 주 (각 세포 라인의 속성에 따라) 37 CO 2 배양기에서 품어 ° C. 세포 평가광학 현미경에 의한 식민지 당 번호입니다. </li><li> 매체를 제거하고 PBS로 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 빙냉 메탄올 (1ml)에 추가한다. 10 분 이상 -20 ° C에서 품어. </li><li> 메탄올을 제거합니다. </li><li> 크리스탈 바이올렛 용액 (0.1 % w / 물 25 % V / V의 메탄올 V)를 첨가하고, 20 분 동안 배양한다. 주의 : 크리스탈 바이올렛은 잠재적 인 발암 물질; 크리스탈 바이올렛과 함께 작업하는 동안 장갑을 사용합니다. </li><li> 상기 크리스탈 바이올렛을 분리, 탈 이온수로 3 회 세척하고, 공기 건조. </li><li> 각각의 접시에 형성 식민지를 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blot Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna 및 Kirson D. Eilon D는 이스라엘의 Novocure Ltd에서 유급 직원입니다. Weinberg Uri는 Luzern의 Novocure GmbH의 유급 직원입니다. Yoram Palti는 NY의 Novocure Ltd의 주주입니다.

TTFields는 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 번 전기장을 적절하게 조정 한 지속적인 응용을 바탕으로하는 새로운 항 종양 치료법입니다. 항 종양 효능을 극대화하는 것은 모든 치료 양식에있어 바람직한 결과입니다. 따라서 암세포 성장 억제의 모든 추가 백분율에 대한 &quot;싸움&quot;은 환자의 장기적인 임상 결과에 유의 한 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 TTFields 응용 프로그램의 필수 연속 특성 및 그 결과 누적 효과 때문입니다. TTFields 적용 극대화는 여러 가지 방법으로 달성 할 수 있습니다. (1) 전계 강도를 높이고 (1), (2) 치료 기간을 길게하십시오 ( 5) , (3) 가장 효과적인 조합을 찾는 것최적의 주파수 1 , 2 , 4 , 6 , 7을 정의하는 다른 치료 양식 18 , 19 , (4)를 사용하십시오. 종양 부위의 전계 강도를 최대화하는 것은 환자 피부에서 어레이의 위치를 ​​최적화함으로써 달성된다; 이것은 환자의 개별적인 해부학에 근거하여 종양에 최대 전계 강도를 전달할 수있게 해줍니다. 치료 기간 연장은 대부분 환자의 치료법 준수에 달려 있습니다 (하루 18 시간 이상). 다른 치료법과 적절한 조합을 찾고 최적의 빈도를 결정하는 것은 현재 TTFields 치료 결과에 대한 유효성이 입증 된 마커가 없기 때문에 시험 관내 결과에 크게 의존합니다. 이 작업에서 우리는 실험적 procedures는 TTFields 체외 응용 시스템을 이용하여 암 세포주에 대한 최적 TTFields 주파수를 결정하는 데 필요한. 여기에 설명 된 방법은 잠재적 TTFields 다른 암 치료 방법 (예를 들어, 화학 요법 제 또는 방사선)의 조합을 선별하고, 각 특정 조합 치료 TTFields 관리에 대한 최적의 주파수를 결정하는 데 사용될 수있다. 이전의 간행물에 맞춰, 여기 나타낸 결과는 양쪽 교종 세포 및 난소 암 세포의 치료를위한 최적의 주파수가 200 kHz의 1, 7임을 보여준다. 본 연구에서 우리는 클론 원성 잠재 성을 감소시키는 최적 TTFields 주파수가 최대 세포 독성 효과를 유도하는 주파수와 관련되는 것을 처음으로 보여 주었다. 이 연구에서 사용되는 방법은 TTFields의 영향을 정량화하는 (즉, 세포 독성 및 클론 원성)을치료 결과를 평가할 수있는 가능한 많은 표준 종료점 분석 중 단지 2 가지만을 사용하십시오. 추가 치료 결과 검사는 다음을 포함합니다 : (1) 고정, 염색 및 세포 내 구조의 시각화를 위해 현미경 위에 세포가 도금되는 coverslips 장착; (2) TTFields 자체 또는 새로운 일회용 접시에 coverslip을 옮긴 후에 단백질 및 RNA 추출물의 분석을 수행합니다. 및 (3) 유동 세포 계측법 분석을 위해 염색 된 세포를 트립신 처리한다. 주의 깊은 실험 계획은 TTField를 전달한 후 치료 결과에 영향을 줄 것입니다. 중요한 단계는 민감한 세포주에 적용될 때 너무 높은 강도로 인해 실험을 통해 세포 증식이 지나치게 성장하지 않고 적절한 전계 강도를 사용하도록 보장하는 것입니다. 최적의 주파수. 반대로, TTField는 매우 낮은 강도로 적용됩니다.덜 민감한 세포주에서는 고유 한 변이에 의해 가려 질 수있는 작은 영향을 초래할 수 있습니다. 치료 로그는 실험 전반에 걸쳐 각 접시에 대한 온도 안정성, 전류 및 저항에 대한 중요한 정보를 조사해야합니다. 치료 시작시 결함있는 접시를 교체하고 원하는 치료 매개 변수를 충족시키지 못한 접시에서 데이터를 제외하면 복제 간 변동성을 최소화 할 수 있습니다. 요약하면, TTFields는 임상 설정 8 , 9 , 10 에서 이미 효능과 안전성을 입증 한 새로운 항암 치료 요법입니다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 시험관 환경 에서 TTField를 테스트하면 임상 환경에서 TTFields 치료 매개 변수를 최적화 할 수 있으며 기본 메커니즘에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.

종양 치료 필드 (TTFields)은 교 모세포종의 홍반 및 잠재적으로 다른 암 종류의 치료를위한 항 유사 분열 양상이다. 필드는 암 (1, 2)의 영역에 교번 전계를, 저 강도의 연속 프로그램 (1-3 V / cm) 중간 주파수 (100 내지 500 kHz에서)를 통해 전달된다. 시험 관내 및 생체 내 TTFields 애플리케이션은 다양한 암 세포주의 성장 및 여러 동물 종양 모델 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7에서 종양의 진행을 모두 억제하는 것으로 나타났다. 아교 모세포종과 비소 세포 폐암을 포함하여 고형 종양 환자에서 파일럿 임상 시험 더 큰 무작위 연구 demonst이연속 TTFields 응용 프로그램 8, 9, 10의 안전성과 효능을 평가. TTFields의 효능 인 것으로 밝혀졌다 : (1) 주파수 별 상이한 기원 1, 2, 4, 5, 6에서 세포주의 세포 수의 최대 감소로 이어지는 특정 최적의 주파수를 갖는, 7; (2) 전계 강도 의존성 약 1 V / cm보다 더 강력한 강도 1, 2, 7, 11 활동 최소 임계치와; 처리 시간은 5 이상이었을 때 (3) 개선; (4) 더 높은 2 방향 TTFields 각 OTH 수직으로인가 될 때ER, 단일 방향 (1)로부터인가 전계에 비해. 위의 연구 결과를 바탕으로, TTFields 종양 침대 (12), (13)의 전기장 강도를 극대화하기 위해 환자의 피부에 국소 트랜스 듀서 어레이의 2 개 세트를 사용하여 오랜 기간에 대한 환자에게 적용 할 수 있습니다. 체외에서 암 세포에 TTFields의 효과를 공부하는 것은 현재 특정 종양 유형에 적용 할 수있는 최적의 주파수를 결정하는 유일한 방법을 제공합니다. 최적의 주파수에 대한 테스트는 세포 배양에 (RMS) 제곱 평균 100 ~ 500 kHz의 범위의 상이한 주파수의 애플리케이션에 대한 최대 3 V / cm의 강도를 루트로 할 수있는 장치가 필요하다. TTFields 응용 프로그램이 열을 발생로서, 응용 시스템은 온도에 엄격한 제어를 유지하면서 과도한 열을 방출 할 수있는 능력이 필요합니다. 여러 가지 장치 WER수년에 걸쳐 개발 된 전자는 세포 배양 1, 2, 5, 14, 15, 16 TTFields 응용 프로그램을 허용합니다. 이러한 모든 장치에서 사용되는 전극 등의 전자 전극 표면에서 교환 매체 (1)에 유독 금속 이온의 방출과 같은 전도성 전극의 사용과 관련된주의 사항을 방지하기 위해 절연 하였다. 시험 다양한 TTFields 응용 시스템의 주요 차이점은, 예를 들어 절연체 (2), 14, 15, 16의 얇은 필름 또는 고 유전율 재료로 절연 된 금속 배선으로 이루어지는 하나의 전극 (함께 사용될 전극 절연막의 유형 납 마그네슘 나이 오 베이트 - 납 titanate (PMN-PT)) 6 . 절연 와이어 전극은 TTField 애플리케이션에 비교적 간단하고 비용 효율적인 솔루션을 제공하지만 1V / cm 임계 값 이상의 유효 전계 강도를 달성하고 셀 도금에 사용할 수있는 표면에 필요한 고전압, 전극 사이의 거리가 상대적으로 작기 때문이다. 고 유전 상수 물질을 사용하여 절연 된 전극을 기반으로 한 시스템은 특별한 설계 및 제조 기능을 필요로하지만, 고전압을 필요로하지 않으며 전극 사이의 세포 성장을위한보다 넓은 영역을 제공 할 수 있습니다. 이 연구 에서 사용 된 TTFields in vitro 응용 시스템은 후자의 시스템 계열에 속하며 핵심 단위는 고유 전율 세라믹 (PMN-PT)으로 구성된 페트리 접시 (TTFields dish, 그림 1 참조)입니다. 두 쌍의 전극이 외벽에 수직으로 인쇄됩니다.2 방향에서 전기장을 가할 수 있도록 TTFields 접시가 있습니다. 전극은 정현 파형 발생기와 증폭기에 연결되어 50-500 kHz의 주파수 범위에서 TTField를 적용 할 수 있습니다. 과도한 열을 분산시키기 위해, TTFields 요리는 접시 온도의 지속적인 모니터링과 시스템에 의해 적용된 전압 조정을 사용하여 수행되는 중온 조절과 함께 냉각 된 인큐베이터 내부에 보관됩니다. 실제로, 인큐베이터를보다 낮은 온도로 설정하면, 시스템은 접시 내의 목표 온도가 달성 될 때까지 전압을 증가시키기 때문에,보다 높은 전계 강도를 유도 할 것이다. 접시 내의 온도와 인큐베이터 온도의 차이는 온도 구배에 따라 약간의 증발을 유발할 수 있습니다. 따라서 적절한 성장 조건을 유지하기 위해 매 24 시간마다 배지를 교체해야합니다. 아래의 프로토콜셀에서의 최대 감소를 계산하고 생존 한 세포의 가능성의 감소가 달성된다 콜로니 형성하기 때문에 암 세포에 TTFields 주파수의인가를 최적화하기 위해 실험 절차를 설명한다.

<table><tbody><tr><td>inovitro 시스템 및 소프트웨어</td><td>Novocure</td><td>ITG1000 및 IBP1000</td><td>각 장치에는 1개의 TTFields 생성기, 1개의 베이스 플레이트, 8개의 TTFields 접시와 커버 및 1개의 플랫 케이블이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>살균 백</td><td>Westfield medical</td><td>24882</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 커버 슬라이드</td><td>Thermo Scientific (NUNC)</td><td>174977</td><td>사전 처리 및 멸균</td></tr><tr><td>유리 커버 슬라이드</td><td>Thermo Scientific (Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>CB00220RA1</td><td>필요한 경우</td></tr><tr><td>Dulbecco를 살균하십시오. s 변형 된 독수리' s 매체</td><td>생물 산업 (이스라엘)</td><td>01-055-1A</td><td>따뜻한 37 &deg; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>37°C에서 따뜻하게 C 목욕 사용 전</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>생물 산업 (이스라엘)</td><td>04-007-1A</td><td>37 &deg에서 따뜻한; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10,000 U/mL 페니실린, 10,000 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트 용액 100 mM&nbsp;</td><td>생물 산업 (이스라엘)</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hepes buffer 1 M</td><td>Biological Industries (이스라엘)</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 Insuline 솔루션</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>10516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>0.25 % 트립신 / EDTA</td><td>생물 산업 (이스라엘)</td><td>03-050-1B</td><td>37 &deg에서 따뜻한; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Merck</td><td>1.06009.2511</td><td>-20으로 냉각 &deg; C 사용하기 전에 냉동실에</td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마-알드리치</td><td>120M1445</td><td>유해합니다. 25% 메탄올 75% 물에 0.1% w/v 크리스탈 바이올렛 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>경질 세제</td><td>Alcononx</td><td>242985</td><td>물에 5% 용액을 준비하거나 제조업체의 지침에 따라 준비합니다.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries (이스라엘)</td><td>02-023-1A</td><td>칼슘과 마그네슘 없이</td></tr><tr><td>A2780</td><td>ECACC</td><td>는</td><td>RPMI 1640에서 성장93112519 FBS (10%), 펜/스트렙 (100&nbsp; U/mL / 100&nbsp; &마이크로; g/mL), 피루브산 나트륨(1&nbsp; mM) 및 Hepes buffer(12&nbsp; mM)입니다.</td></tr><tr><td>F98</td><td>ATCC</td><td>CRL-2397</td><td>둘베코에서 성장 s 변형 된 독수리' FBS(10%), 펜/연쇄상구균(100&nbsp; U/mL / 100&nbsp; &마이크로; g/mL), 피루브산 나트륨(1&nbsp; mM) 및 글루타민(2&nbsp; mM)입니다.</td></tr><tr><td>Ovcar-3</td><td></td><td>ATCC HTB-161</td>은 <td>FBS (20%), 펜/스트렙 (100&nbsp; U/mL / 100&nbsp; &마이크로; g/mL), 피루브산 나트륨(1&nbsp; mM), 헤페스 완충액(12&nbsp; mM)과 인슐린(10&nbsp; &마이크로; g/mL)입니다.</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>둘베코에서 성장 ' s 변형 된 독수리' FBS(10%), 펜/연쇄상구균(100&nbsp; U/mL / 100&nbsp; &마이크로; g/mL), 피루브산 나트륨(1mM) 및 글루타민(2&nbsp; mM)입니다.</td></tr><tr><td>냉장 CO2 인큐베이터</td><td>CARON</td><td>7404-10-3</td><td></td></tr><tr><td>층류 캐비닛</td><td>ADS Laminair</td><td>Bio12 및 VSM12</td><td></td></tr></tbody></table>

필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (ttfields를) 결정

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

종양 치료 필드 (TTFields)는 수백 KHz의 주파수 범위에서 저 강도 (1-3 V / cm)의 교류 전계를 연속적이고 비 침습적으로 적용하여 효과적인 치료 방법입니다. 조직 배양에서 TTField의 연구는 높은 유전 상수 (≥ 5,000)를 갖는 세라믹 페트리 접시에 다양한 주파수와 강도의 전기장을 적용 할 수있는 TTFields in vitro 응용 시스템을 사용하여 수행됩니다. 세라믹 페트리 접시의 바닥에있는 coverslips에 도금 암세포 라인은 세포 카운트 및 clonogenic assays와 같은 치료 결과 테스트를 용이하게하기 위해 다양한 주파수에서 두 개의 직각 방향으로 전달되는 TTField에 적용됩니다. 이 보고서에 제시된 결과는 난소 및 신경 교종 세포 모두에서 세포 수와 clonogenic assay와 관련하여 TTField의 최적 빈도가 200kHz임을 보여줍니다.

<html> 상이한 주파수를 스캔 TTFields인가 후의 결과는 이러한 특수 높은 벽 TTFields 내부에 배치 된 Boyden 챔버를 이용하여 침입하는 세포의 수의 변화에 ​​세포 수, 비색 분석법, 클론 원성 분석 및 검사 등 다양한 분석에 기초하여 정량화 될 수있다 세포 배양 접시. 미리 정해진 세포 배가 시간에 따라 신중하게 실험 계획은 세포 따라서 치료 결과를 극대화 치료 기간 동안 유사 분열 이벤트의 최대 수에 도달 할 수 있습니다. (즉, 래트 신경 교종 세포 7 및 F-98 (도 2a 즉, 인간 난소 암 세포)도 2는 평균 세포 수 (즉, 세포의 수) 및 A2780의 클론 원성 분석을위한 전형적인 주파수 스캔 결과를 나타낸다;&quot;&gt;도 2B) 1 (두 방향 TTFields 처리 주파수 범위 : 100 내지 500 ㎑의, RMS는 1.7 V / cm, 및 인큐베이터 온도 :. 18 ° C) 결과를 보여주기 모두에서의 세포 수의 현저한 감소는 주파수를인가 (다중 비교 단방향 ANOVA) 테스트 한 모든 세포주를 200 kHz에서의 최대 감소. 클론 원성 포텐셜 최대 감소로 이어지는 최적 주파수는 모두 A2780 및 F98 세포 (도 2B와 C)에서 동일했다 . 셀 번호, 각 주파수에서의 클론 원성 효과 사이의 피어슨 상관 계수는 0.967 (P = 0.002) 각각 A2780 및 F98에 대한 0.755 (p = 0.083)가 있었다. 도 3은 OVCAR-3에 대한 평균 세포 수에 대한 주파수 스캔 결과를 보여준다 (즉, 인간 난소 암 세포가도 3A) 및 U-87 MG (즉, 인간의 신경 교종 세포;도 3b) 세포는 다양한 농도에서 TTFields의 양방향 처리 (RMS : 1.7, 1.3, 및 1.0 V / cm 각각과 인큐베이터 온도 : 18 ° C, 24 ° C, 28 ° C 각각). 효과는 세포를 처리했을 때 얻은 결과에 비해 상대적으로 작다 : 결과는 여전히 1.3 V / ㎝의 TTFields 치료 (24 ° C 배양기 온도) 이후 OVCAR-3 세포 수의 현저한 감소가있을 것으로 보여 1.7 V / cm로 (인큐베이터 온도 : 18 ° C). U-87 MG 세포를 1.0 V / ㎝의 TTFields 처리 (인큐베이터 온도 : 28 ℃) 1.7 V / cm로 처리 할 때와 같은 세포 수의 감소에 비슷한 경향을 보여, 아직 그 효과는 더 낮은 농도에서 유의하지 않았다 . <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" /> 으로 나뉘어진다전자 1. TTFields 요리는 기판 부 상에 설치된 평면 TTFields 제어 케이블에 접속되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" /> 그림 2. (A) A2780 및 (B) F98 세포 최적 TTFields 억제 주파수의 결정에 대한 주파수 스캔. 셀은 서로 다른 주파수의 TTFields (1.7 V / cm 및 100 ~ 500 kHz로)로 72 시간 동안 처리 하였다. TTFields 치료의 효과는 세포 수 및 클론 원성 분석을 사용하여 추정 하였다. 화살표는 최적의 주파수를 나타낸다. 결과는 시험 주파수마다 적어도 6 회 반복에 기초하여 평균 ± SD를 나타낸다. (C)에 클론 원성 (S)의 대표 이미지<html> 다양한 주파수에서 TTFields 처리 다음 A2780 세포의 urvival. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" /> 그림 3. (A) 및 OVCAR-3 (B)에 대한 최적 TTFields 억제 주파수의 결정에 대한 주파수 스캔 U-87 MG 세포. 셀은 서로 다른 주파수 (100 내지 500 kHz에서) 및 강도의 TTFields로 72 시간 동안 처리 하였다 (OVCAR-3 : 1.3 내지 1.7 V / cm, U-87 MG 1.0 1.7 V / cm)를. TTFields 치료의 효과는 세포 수를 사용하여 추정되었다. 화살표는 최적의 주파수를 나타낸다. 결과는 각 시험 주파수에서 적어도 6 회 반복에 기초하여 평균 ± SD를 나타낸다.페이지 &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 주위 온도를 인큐베이터 </td><td> 예상 TTFields 강도 </td></tr><tr><td> (기음) </td><td> (V / cm의 RMS) </td></tr><tr><td> (18) </td><td> 1.62 </td></tr><tr><td> (19) </td><td> 1.55 </td></tr><tr><td> (20) </td><td> 1.48 </td></tr><tr><td> (21) </td><td> 1.41 </td></tr><tr><td> (22) </td><td> 1.33 </td></tr><tr><td> (23) </td><td> 1.26 </td></tr><tr><td> (24) </td><td> 1.19 </td></tr><tr><td> (25) </td><td> 1.12 </td></tr><tr><td> (26) </td><td> 1.04 </td></tr><tr><td> (27) </td><td> 0.97 </td></tr><tr><td> (28) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> (29) </td><td> 0.83 </td></tr><tr> &lt;td&gt; 30 </td><td> 0.76 </td></tr></tbody></table> 표 1. TTFields 요리 내부의 인큐베이터 주변 온도 및 예상되는 TTField 강도.

종양 치료 필드 (TTFields)은 낮은 강도, 중간 주파수, 전기장을 교류의 연속적인 비 관혈적 애플리케이션을 통해 전달되는 효과적인 항암 치료 방법이다. TTFields 체외 응용 시스템을 이용하여 세포주 TTFields 애플리케이션 세포 수의 높은 감소를 유도하는 최적의 주파수의 결정을 허용한다.

필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (TTFields를) 결정

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

TTFields in vitro 적용 시스템의 전반적인 목표는 다양한 종양 유형의 암세포에 미치는 영향을 조사하여, TTFields의 임상 투여를 안내하고 치료 결과를 최적화하는 것입니다. 이 방법은 다양한 TTField 파라미터가 암세포에 미치는 영향을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 암세포주의 성장을 억제하는 가장 효과적인 TTField 주파수를 전임상 단계에서 식별할 수 있게 하여, 궁극적으로 인체에 적용할 수 있다는 점입니다.이 기술을 약간 수정함으로써 TTField와 화학요법제 및 방사선 치료와 같은 다른 치료 양식의 병용 치료 효능을 테스트할 수 있습니다. 이 절차는 저희 팀의 연구원인 Yaara Porat가 시연할 것입니다. 먼저, 덮개가 있는 TTFields 디쉬를 베이스 플레이트에 설치하고, 대조군 세포 배양에 사용할 추가 디쉬 8개를 준비하십시오.각 디쉬 바닥에 멸균된 2mm 커버슬립을 놓습니다. 다음으로, 5×10⁴개의 U-87 MG 세포를 1mL의 DMEM 배지에 부유시킵니다. 각 디쉬에 분주하는 적절한 세포 수는 사용하는 세포주의 특성에 따라 달라집니다.세포의 과성장을 방지하기 위해 실험 전 이를 교정하는 것이 매우 중요합니다. 세포 현탁액 200 µL를 각 커버슬립 위에 떨어뜨려 표면에 방울이 형성되게 한 후, 디쉬의 뚜껑을 덮습니다. 모든 디쉬를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 부착되도록 합니다.세포가 부착되면 200 µL 피펫을 사용하여 커버슬립에서 배지를 흡입한 후, 각 디쉬에 2 mL의 완전 성장 배지를 조심스럽게 피펫팅합니다. 멸균된 피펫 팁으로 커버슬립 가장자리를 가볍게 두드려 슬라이드 아래에 갇힌 기포를 제거합니다. 그 후, TTFields 처리가 시작될 때까지 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.TTFields 치료를 시작하려면, 37 °C 인큐베이터에서 베이스 플레이트를 꺼내 냉각 이산화탄소 인큐베이터에 넣으십시오. 냉각 인큐베이터의 온도가 전기장 강도를 결정합니다. TTFields에 대한 세포 민감도에 따라 적절한 강도를 사용하는 것이 중요합니다.그 다음 플랫 케이블 암커넥터를 베이스 플레이트에 연결하고 TTFields 생성기를 켭니다. TTFields in vitro 적용 시스템 전용 소프트웨어를 실행합니다. 실험명과 실험자 이름을 입력하여 새로운 연구를 정의한 후, 각 디쉬에 대한 주파수와 목표 온도를 조절합니다.소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 TTFields 치료를 개시하고, 모니터상에서 모든 디쉬가 연한 파란색으로 표시되는지 확인하여 제대로 연결되었는지 확인하십시오. 연결을 다시 설정하려면 디쉬를 가볍게 누른 상태에서 화면에 연한 파란색으로 표시될 때까지 천천히 앞뒤로 회전시키십시오. 치료 24시간 후에 소프트웨어의 일시 정지 버튼을 클릭하여 실험을 중단하십시오.베이스 플레이트에서 플랫 케이블 커넥터를 분리한 후 베이스 플레이트를 층류 작업대(laminar flow cabinet)에 놓습니다. 그런 다음 표준 조건에서 배양된 대조군 세포와 디쉬가 담긴 베이스 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 모든 디쉬의 배지를 신선한 완전 성장 배지로 교체한 후, 대조군 세포는 37 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에 넣고 베이스 플레이트는 냉장 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 베이스 플레이트를 발생기에 다시 연결합니다.계속하기 버튼을 클릭하여 처리를 이어갑니다. 처리가 완료되면 소프트웨어의 실험 종료 버튼을 클릭하여 실험을 마치고, 시스템에서 업로드된 데이터를 저장합니다. TTFields 발생기를 끈 후, 베이스 플레이트에서 플랫 케이블을 분리하고 인큐베이터에서 시스템을 꺼냅니다.세라믹 디쉬를 아래로 누른 상태에서 시계 반대 방향으로 돌려 베이스 플레이트에서 분리합니다. 다음으로, 추가 평가를 위해 TTFields 처리군 및 대조군 커버슬립을 신선한 배지가 담긴 멸균 페트리 접시에 무균적으로 옮깁니다. TTFields 처리 효과를 평가하려면, 커버슬립이 들어 있는 각 디쉬에서 배지를 제거한 후 0.25%trypsin/EDTA 0.5 milliliters를 첨가하고, 세포가 커버슬립 표면에서 분리될 때까지 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건에서 디쉬를 배양합니다.0.5 milliliters의 완전 성장 배지로 트립신을 중화하고, 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 마지막으로 유세포 분석법으로 세포 수를 측정합니다. 여기 제시된 결과는 A2780 세포에서 수행된 주파수 스캔 결과이며, 이는 연구 대상 세포의 성장 및 클론 형성 능력에 미치는 TTFields의 주파수 의존적 영향을 보여줍니다.200 kHz의 주파수를 적용했을 때 가장 두드러진 치료 효능이 관찰되었습니다. 두 가지 서로 다른 강도로 수행된 TTFields 치료의 효능을 OVCAR-3 세포에서 조사하였습니다. 본 연구는 적용된 강도와 치료 결과 사이에 명확한 상관관계가 있음을 보여주며, 전기장의 강도가 높을수록 성장 억제 활성이 더 크게 나타났습니다.인가된 전기장 강도와 관계없이, TTFields 처리의 가장 강력한 효과는 200 kilohertz 주파수에서 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하면 하루에 30분 미만으로 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 배지가 쏟아지지 않도록 주의하고, 인큐베이터에서 후드로, 또는 그 반대로 디쉬를 옮길 때 수평을 유지하는 것이 중요합니다.TTField 적용 후, 치료 결과와 관찰된 활성의 기저 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 유세포 분석, 알라닌 단백질 분석 또는 면역형광 현미경법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 암 유형에 대해 임상 환경에서 적용할 최적의 TTFields 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, in vitro TTFields 실험을 계획하고 실행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.인간 세포주를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 장갑 및 의복과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 - 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 - 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

이 동영상은 TTField 적용이 in vitro 난소암 세포주 성장에 미치는 영향을 보여줍니다. 이 분석은 암세포의 수를 최대한 줄일 수 있는 전기장의 최적 주파수를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

암세포에 대한 최적의 억제성 종양 치료 자기장 빈도 결정: 암세포 생존력에 대한 TTFields의 효과를 평가하기 위한 비침습적 체외 방법

이 동영상은 인간 뇌종양 모델에 Tumor Treating Fields 또는 TTFields를 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 비침습적 기술은 저강도 교대 전기장을 뇌에 직접 전달하여 세포 분열과 그에 따른 세포사멸을 억제합니다.

인간 뇌종양 모델의 종양 치료 필드 응용 프로그램: 뇌종양 치료를 위해 인간 뇌에 교대 전기장을 전달하는 비침습적 기술

재발 성 아교 모세포종의 치료에 사용되는 신규 한 방법을 설명한다. 이러한 치료 방법은 베바 시주 맙은 현재 FDA는 단일 요법으로 승인 대상 에이전트와 조합 TTF 요법으로 알려진 전기 종양 필드 (TTFields)을 치료를 교대로의 적용을 사용한다.

재발 성 아교 모세포종의 치료를 위해 베바 시주 맙과 조합하여 필드 요법 치료 종양

인간 백혈병 세포의 선택적 손상은 백혈병 및 정상 조혈 세포의 화학 요법 전처리 유무에 관계없이 저주파 초음파를 적용하는 새로운 접근 방식을 통해 달성 할 수 있습니다.

생성 및 펄스 저주파 초음파의 정량 분석​​은 종 양성 세포를 치료하지의 소닉 감도를 결정하고 치료합니다

세포종은 가장 일반적이 고 적극적인 주 뇌 암 성인, 대부분 종양 초기 치료 후 재발 이다. 종양 치료 분야 (TTFields) 치료는 세포종에 대 한 최신 치료 양식 적임 이다. 여기, 우리는 적절 한 응용 프로그램 설명 TTFields 변환기 배열의 환자에 이론 및 치료의 측면을 토론.

종양 세포종 필드 치료 치료의 임상 적용

갓 절제된 인간 유방암 종양은 테라헤르츠 분광법 및 이미징을 특징으로 하며 신선한 조직 처리 프로토콜을 따르게 된다. 조직 포지셔닝은 효과적인 특성화를 가능하게 하는 동시에 향후 수술 중 응용 분야에 대한 적시에 분석을 제공하기 위해 고려됩니다.

테라헤르츠 새로 절제된 유방암 종양을 위한 테라헤르츠 이미징 및 특성화 프로토콜

이 작업은 3D 뇌종양 모델, 즉 시험관 내 배양, 생체 내 모델 및 생체 내 쥐 모델에서 구현하기 위한 유연한 상호 디지털화 전극의 개발을 설명합니다. 제안된 방법은 상이한 수준의 복잡성에서 종양에 대한 펄스 전기장의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.

교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치

이 기사에서는 이극자 고주파 온열요법 시스템에 의해 전달되는 가열에 따른 간질 유체 압력의 과도 온도 프로파일과 결합된 시공간 변화를 시뮬레이션하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 중재적 온열요법 기술에 대한 종양 미세환경을 특성화하는 생물물리학적 매개변수의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

종양 미세환경에 대한 온열요법의 영향을 조사하기 위한 컴퓨터 모델링 접근 방식

이 프로토콜은 척추 전이에 대한 환자별 전기장 시뮬레이션 및 검증을 위한 완전하고 재현 가능한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우는 다중 모달 영상, 반자동 및 수동 분할, 조직 전도도 모델링, 선형 유한 요소 전기장 시뮬레이션, 그리고 시술 후 MRI 기반 괴사 중복 분석을 통한 실험적 검증을 통합합니다.

척추 전이 전기화학요법에서의 환자별 전기장 시뮬레이션

학습하세요 종양치료전기장(TTFields)을 활용한 암세포 성장 억제 방법을. 200kHz 주파수에서 최적의 효능을 확인하고 임상 적용을 위한 전임상 빈도를 식별하는 기술입니다.

필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (TTFields를) 결정

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