xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

다음 실험의 전반적인 목표는 EXOGEN 시스템을 사용하는 임피던스 기반 접근법과 크롬 방출 분석을 비교하여 세포독성 T-세포 활성을 측정하는 것입니다. 첫 번째 단계는 fial을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포를 전혈에서 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, PBMC를 펩타이드 항원, 인간 재조합 IL 2 및 방사선 조사된 PBMC와 함께 웰에 첨가하여 항원 특이적 CD 8 T 세포를 생성합니다.

그런 다음 항원 특이적 CD 8개의 T 세포를 종양 세포 사멸을 유발하기 위해 두 분석에서 종양 세포와 공동 배양합니다. 임피던스 방법과 크롬 방출 분석을 모두 사용하여 종양 세포의 용해 비율을 보여주는 결과를 얻었습니다. 크롬 방출 분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 임피던스 기반 시스템이 실시간 데이터를 수집하고 라벨링이 필요하지 않은 세포가 더 적다는 것입니다.이 프로토콜의 경우 정상적이고 건강한 HLA A 두 명의 양성 공여자의 혈액은 제조업체의 프로토콜에 따라 pbmc 또는 말초 혈액 단핵 세포의 공급원을 제공합니다.

F call PA plus를 사용하여 혈액에서 P BMC를 분리합니다. 다음으로 6개의 웰 플레이트에 웰당 2밀리리터의 매체에 약 400만 개의 P BMC를 로드합니다. 각각에 HLAA 2 결합 펩타이드를 첨가하여 최종 농도를 밀리리터 배양당 10마이크로그램으로 만듭니다.

T 세포를 자극하고 확장하는 데 도움이 되는 격일로 세포를 사용합니다. 인간 재조합 IL 2로 보충된 새로운 배지를 추가하여 최종 농도를 밀리리터당 50단위까지 농도화합니다. 일주일 후, 자가 pbmc 배양을 준비하고 세포를 조사한 다음 동일한 hla로 2시간 동안 펄스를 합니다.

밀리리터당 10마이크로그램의 2개 결합 펩타이드는 각각 1밀리리터의 방사선 조사된 자가 PBM CS를 첨가하여 배양액을 복원합니다. 글쎄, 또 다른 주가 지난 후 교일로 IL 2로 보충 된 신선한 배지를 계속 추가하고, 두 번째로 같은 방식으로 배양을 재 조정하십시오. 6일 더 배양하면 세포를 사용할 준비가 됩니다.

지능형 임피던스 측정 스테이션을 최소 한 시간 동안 5% 이산화탄소 농도에서 섭씨 37도로 평형을 이루어 사용할 수 있도록 준비합니다. 0.25%트립신과 원심분리를 사용하여 75%의 인간 종양 세포를 융합합니다. 혈세포 분석기를 사용하여 종양 세포를 세고 RPMI에서 재구성합니다.

마이크로리터당 7, 500개 세포 농도의 종양 배지. 다음 프로그램에서 Excel 에이전트 소프트웨어는 웰 레이아웃으로 레이아웃 페이지를 설정합니다. 처음 18시간 동안 40시간 동안 5분마다 임피던스 판독값을 취하도록 일정 페이지를 설정하면 Xceligent 시스템은 종양 세포의 임피던스 판독값만 측정합니다.

그런 다음 웰당 100마이크로리터의 RPMI 종양 배지를 추가합니다. 세포가 없는 상태에서 임피던스를 측정하여 EPL에 대한 배경 판독을 하십시오. 종양 세포가 추가된 후, 그 스테이션에 플레이트를 로드하고 판독을 시작합니다.

종양 세포는 즉시 EPL에 달라붙기 시작합니다. 약 18시간의 배양 후 종양 세포는 EPL에 부착되어 웰당 15,000개의 종양 세포로 두 배로 증가합니다. 이때, 수확물은 부드러운 긁어내기와 교반 원심분리기에 의해 T 세포를 제조하였다.

T 세포는 10%FBS로 RPMI 배지에서 재구성하고 혈구 분석기를 사용하여 계수합니다. 세포 밀도가 알려지면 200마이크로리터의 T 세포를 종양 세포에 추가할 때 종양 세포당 40개의 T 세포가 가장 높은 농도가 되도록 T 세포를 2배 희석하여 준비합니다. 시리즈의 마지막 희석은 종양 세포당 1.25 T 세포를 제공해야 합니다.

EXOGEN 스테이션을 일시 중지하고 피펫을 사용하여 EPL을 제거합니다. 웰에서 매체를 제거한 다음 희석 계열의 모든 농도를 음성 대조군으로 사용하여 200마이크로리터의 T 세포를 로드합니다. 순수한 매체를 사용하고, EPL을 스테이션으로 되돌려 놓고 분석이 끝날 때 프로그램을 계속하십시오.

결과를 정규화합니다. 크롬 51 및 크롬 51 표지 표적 세포로 작업할 때는 항상 기관의 방사선 안전 절차를 따르고 차폐를 사용하여 방사선 노출을 줄이십시오. 먼저 밀리리터당 100만 개의 세포로 2시간 동안 종양 세포를 펄스하여 밀리리터당 10마이크로리터의 신선한 크롬 51을 펄싱합니다.

다음으로, 10% FBS로 10ml의 RPMI 배지로 종양 세포를 세척하고 세포를 1밀리리터당 100만 개의 세포로 동일한 배지에서 재구성합니다. 그런 다음 96 웰 라운드 바닥 플레이트로. 웰당 100, 000개의 종양 세포를 추가하여 자연 방출을 계산합니다.

이 우물 중 6개에 다른 우물 6개에 다른 것을 추가하지 마십시오. 100마이크로리터 Triton X 100을 추가하여 세포를 lyce하고 나머지 모든 웰에 대한 최대 방출을 계산합니다. 이전에 준비된 희석 시리즈를 사용하여 플레이트에 T 세포를 추가합니다.

이제 플레이트를 5 시간 동안 배양하고 각각에서 50 마이크로 리터의 상등액 샘플을 수집하고 실온에서 밤새 후드의 플레이트를 건조 한 후 샘플을 루마 플레이트에 잘 적재합니다. 감마 계수기 T-cell 및 SKBR three를 사용하여 CPM을 측정합니다. 암세포를 X 지능판에서 배양하고 세포 지수를 측정했는데, 이는 T 세포가 증식하기 위해 부착을 필요로 하지 않기 때문에 판 임피던스를 반영합니다.

임피던스에 대한 그들의 영향은 40시간 배양 동안 무시할 수 있는 수준이었습니다. 단독으로 배양된 암세포는 임피던스 측정이 증가하는 것을 보여주었습니다. 그러나 18시간에 T 세포를 추가하면 이러한 추세가 중단됩니다.

이 이벤트는 T 세포를 추가한 후 소프트웨어 정규화가 필요하며 다음 실험에서 추가로 조사됩니다. 다양한 농도의 T세포로 SK BR 3개의 세포를 공동 배양한 경우, 임피던스의 감소는 10시간 표시에서 3번의 시도를 통해 5분마다 수집된 T 세포 데이터의 용량에 따라 매우 명확하게 달라졌습니다. 세포 지수는 T 세포의 범위에 대한 2차 다항식을 따랐으며, 이는 Exogen station이 T 세포에 의한 SK BR three의 임피던스 감소가 항원 특이적인지 확인하기 위해 CD 8 T 세포 매개 사멸(SD B 3 종양)을 세포 지수의 저하로 실시간으로 모니터링한다는 것을 나타냅니다.

SK KBR 3개의 세포는 HER을 인식하지 못하는 2개의 새로운 HLA A 양성 FLU 특이적 T 세포와 공동 배양되었습니다. 이 세포는 용해 활성이 현저히 적어 그녀의 두 개의 새로운 특정 T 세포가 빠른 리간드에 대한 항원 특이적 방식으로 죽이고 있는지 여부를 추가로 확인할 수 있습니다. 항체는 2개의 새로운 P 360 9 특이적 T 세포의 용해 활성을 감소시키지 않았다.

그러나, 항 CD 3, CD 28 비드로 비특이적으로 활성화된 T 세포의 경우, 항체는 살해가 HLA 클래스 1 의존적 방식으로 발생하는지 확인하기 위해 용해를 억제했습니다. 항 HLA 클래스 1 항체 또는 동형 대조 항체를 co 배양에 첨가했습니다. 결과는 이 가설을 강력하게 뒷받침했습니다.

다음으로 T 세포를 1 대 5의 비율로 다른 암세포와 공동 배양했습니다. HLA A 2 음성 종양 세포주 BT 20을 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 이 방법이 여러 표적 부착 종양 세포에 유용하다는 것을 보여줍니다.

두 개의 새로운 P 360 9 특이적 T 세포의 공동 배양을 크롬 51 표지 표적 세포에 첨가한 후 CRA 분석을 수행했습니다. 지능 분석은 분석 일관성에 더 민감한 것으로 보입니다. 인트라 분석 변동은 1 대 40 및 1 대 5 사이의 각 세포 비율에서 변동 계수 비율로 계산되었습니다.

이것은 가장 낮은 세포 비율에서 15% 미만으로 측정되었습니다. 그러나 CV 비율이 높거나 예측할 수 없었습니다. 또한, 상이한 P 360 9 특이적 T세포주와의 공동배양에 의한 SK BR 3 T세포 용해의 가변성을 조사하였다.

데이터는 30일 간격으로 생성되었습니다. 분석은 3회에 걸쳐 수행되었으며 결과는 매우 유사했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 임피던스 기반 접근법을 사용하여 항원 특이적 CD 8 T 세포 및 종양 세포를 사용하여 세포 독성 T 세포 활성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.