Name: xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 학습하세요 xCELLigence 임피던스 기반 분석을 사용하여 CD8 T 세포의 세포독성 활성을 실시간으로 측정하는 방법을. 이 기술은 크로뮴 방출 분석보다 높은 감도와 적은 세포 필요량으로 항원 특이적 종양 세포 용해를 정량화합니다.

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이 작품은 치료 재단과 NIH / NCI 9R01 CA152045 및 P50-CA116201를위한 수잔 G. 코멘에서 키스 L. Knutson의에 교부금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li>
<li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor%2C+viral+peptide+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li>
<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li>
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<li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li>
<li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+a+HER-2%2Fneu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2%2Fneu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li>
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<li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li>
</ol>

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CD8 T 세포에 직접 감염된 또는 악성 세포에게 4를 죽일 수있는, 적응 면역 반응에 중요하다. 항원에 특정한 CD8 T 세포 (예 : ELISPOT, 사량, 유동 세포 계측법)의 수를 측정하는 방법은 여러 가지가 있지만, 종종 이러한 세포가 3 기능적 세포 독성 여부를 알고 도움이됩니다. 세포 독성 기능을 평가하기위한 가장 인식 할 수있는 분석은 황금 표준 분석 4 간주됩니다 CRA입니다. CRA의 주요 한계는 방사능 (1) 요구 사항, 감도 (2) 부족, 기계론의 정보 (3) 부족, 세포의 대량 (4)를위한 요구 사항, 그리고 (5) 힘드는 세트까지입니다. 따라서, 지난 10 년 동안, 이러한 한계를 최소화하기 위해 새로운 전략을 채택에 관심이있어왔다. 새로운 접근 방식을 포함하는 측정하는 caspase의 릴리스 4, BLT 에스 테라 activity5, 및 CD107 6 표면 발현.에게 본 논문은 제안하는로슈 xCelligence 시스템에서 수행 임피던스 기반의 분석은 또한 CRA에 대한 대안으로 유용 할 수 있습니다. 임피던스 기반의 접근 방식을 적용 할 수있는 능력은 표면에 단단히 부착하지 않는 T 세포, 따라서 측정과 T 세포의 직접적인 간섭의 우려를 감소 임피던스에 많은 영향을 미칠 것으로 나타나지 않는 것을 관찰에 달려있다. 임피던스 분석 시스템 사용에 필요한 노동력은 훨씬 적은 주로 방사능의 사용에 대한 규제 문제의 제거로 인해 것으로 예상된다. 임피던스 기반 시스템의 유일한 주목할만한 단점은 50,000 달러에서 $ 60,000 지출이 xCelligence 단위의 구입이 필요합니다 것입니다. 그러나 xCelligence 장치는 방사선 카운터에 대한 필요성을 제거하고 T 세포 독성 8 이외에 약물 및 마이그레이션에 대한 세포 반응을 평가하는데 유용되고, 훨씬 더 다재다능하다. 그 관찰종양 세포의 임피던스 감소가 용량 의존적이며, 같은 간단한 보조 차 함수에 따라 합리적으로 가파른 기울기, 그림 2는 분석이 9 세포 독성 세포의 빈도를 추정하기 위해 희석 분석 (LDAs)를 제한하는 데 사용할 수 있다고 제안 . 임피던스 기반의 접근 방식을 가진 하나의 장점은 필요한 T 세포와 종양 세포의 수가 LDA는 잠재적으로 더 가능하고, CRA 미만이다. 예를 들어, CRA에 1시 40분 비율로 잘 당 1 × 10 5 종양 세포뿐만 당 4 X 10 6 총 T 세포를 필요로하는 도금입니다. 그러나, 임피던스 기반의 분석에 잘 당 1.5 × 10 4 종양 세포가 잘 당 6 × 10 5 총 T 세포를 소모하는 필요합니다. 따라서, 임피던스 기반의 분석은 85 % 이하 T 세포와 종양 세포를 사용합니다. 이 감소는 임피던스 기반의 시스템은 인간의 임상 실험에서 면역 감시에 적용 할 수 있다고 제안 여기서 t혈액의 그 볼륨은 제한 될 수 있습니다립니다. CRA가 하나의 시점에 제한되는 동안 또한, 임피던스 기반의 분석은 사용자가 최소한의 추가 노동과 세포와 같은 실험을 여러 용해 시점을 비교할 수 있도록, 지속적인 실시간 데이터를 수집합니다. 주파수 계산은 잠재적으로 총 10 항원에 특정한 CD8 T 세포에 기능적인 세포 독성 T 세포의 비율을 설정하는 등 사량 분석 등의 기능을 측정하지 않는 다른 전략과 결합 될 수있다. 임피던스 기반의 접근 방식의 가장 매력적인 기능 중 하나는 다른 대부분의 분석과는 달리, 세포 독성이 잠재적으로 쉽게 억제제 또는 항체의 사용과 세포의 상호 작용을 연구하고, 실시간으로 감시 할 수 있다는 것입니다. 또 다른 방법은 라벨에 저항 종양 세포에 적합 할 수 있다는 것입니다. 비 살해 종양 세포를 표시하고 유지되지 않기 때문에 마지막으로, 살균, 더 수확 T 세포 내성 세포 연구 possib입니다르. 두 시스템이 특정 T 세포의 질문에 답변 종양 살해 데이터를 제공하지만 요약하면, 임피던스 기반의 분석은 CRA보다 더 민감하고 더 유연한 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>혈액에서 말초혈액단핵구(PBMC)를 분리하는 데 사용됨 </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>세포 배양 배지 </td></tr><tr><td>태아송아지혈청 </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>세포 배양 배지 </td></tr><tr><td>인간 IL-2 </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>T 세포의 성장 촉진을 위해 </td></tr><tr><td>인간 인터페론 감마 </td><td>세포 과학</td><td>CR2026</td><td>종양 세포의 MHC 발현 촉진을 위하여 </td></tr><tr><td>HER-2/neu p369-377 펩타이드 </td><td>메이요 클리닉 펩타이드 합성 코어 시설</td><td>아미노산 서열 KIFGSLAFL</td><td>HLA-A2에 결합함 </td></tr><tr><td>인플루엔자 p58-66 펩타이드 </td><td>메이요 클리닉 펩타이드 합성 코어</td><td>아미노산 서열 GILGFVFTL</td><td>HLA-A2에 결합함 </td></tr><tr><td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>비특이적 T 세포 활성화 및 증식을 위하여 </td></tr><tr><td>크로뮴-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>CRA 라벨링 시약 </td></tr><tr><td>E-플레이트 </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 로슈 그룹(Roche Group)</a></td><td>05469830001</td><td>xCelligence 임피던스 장비용 </td></tr><tr><td>Luma 플레이트 96 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Top Count NXT를 이용한 방사능 측정. </td></tr><tr><td>xCelligence RTCA DP 스테이션 </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche 응용 과학</a></td><td>실시간 세포 분석(RTCA) 이중 파라미터(DP)</td><td>임피던스 단위 </td></tr><tr><td>Top Count NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>섬광 &amp;amp; 발광 측정기 </td></tr><tr><td>Fas 리간드 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>Fas-Fas 리간드 상호작용 차단을 위해</td></tr><tr><td>HLA-A2 BB7.2 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>HLA class I 차단을 위해</td></tr><tr><td>마우스 IgG2b, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>HLA class I에 대한 이소형 대조군(Isotype control)</td></tr><tr><td>SKBR3 종양 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>선암종</td></tr><tr><td>MCF7 종양 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>선암종</td></tr><tr><td>HCC1419 종양 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>원발성 관암종</td></tr><tr><td>BT20 종양 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>암종</td></tr></tbody></table>

xcelligence 시스템으로 cr51 릴리스 분석을 비교하여 인간 her2neu 특정한 cd8 t 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

세포 독성 CD8 T 세포가 감염되거나 악성 숙주 세포 1의 죽음을 유도 할 수있다 T 세포의 하위 그룹을 구성합니다. 이러한 세포는 특수한 수용체를 내가 2 분자가 HLA 클래스에 바인드 특정 항원 펩티드를 인식 할 수있는 T 세포 수용체 (TCR)라고 표현한다. 이러한 목표 세포의 죽음의 결과로 granzymes와 퍼포 같은 용해성 물질의 생산에 자신의 HLA 클래스 I 분자 결과를 통해 감염된 세포 나 종양 세포의 참여. 이 같은 ELISPOT 또는 흐름 세포 계측법으로 분석을 사용하여 항원 특이 CD8 T 세포의 주파수를 결정하는 데 유용하지만, 그것은 세포 독성 분석에게 3를 사용하여 CD8 T 세포 반응의 강도를 확인하기 위해 도움이됩니다. 세포 독성 기능을 평가하기위한 가장 인식 할 수있는 분석은 표준 분석 4 간주되는 크롬 출시 분석 (CRA)입니다. CRA는 감마 방사선에 세포의 노출, L 등 여러 가지 한계를 가지고재현성 및 세포의 큰 숫자에 대한 요구 사항의 ACK. 지난 10 년간 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 전략을 채택에 관심이있어왔다. 새로운 접근 방식을 포함하는 측정하는 caspase의 릴리스 4, BLT의 에스테르 가수 분해 효소 활동 5와 CD107 6 표면 발현.에게 로슈 xCelligence 시스템을 사용하여 임피던스 기반의 분석은, CRA에 대한 대안으로 가능성을 위해 본 논문에서 조사 하였다. 자기편 종양 세포가 전극 판에 바인딩 할 때 임피던스 또는 전류에 대한 반대가 발생합니다. 종양 세포 살해 후 분리 및 전기 임피던스는 xCelligence 시스템에 의해 측정 할 수있는 줄어 듭니다. 세포 매개 살인을 평가하기 위해 임피던스 기반의 접근 방식을 적용 할 수있는 능력은 T 세포는 대부분의 표면에 단단히 부착하지 않고 따라서 T 세포의 직접적인 간섭의 우려를 감소 임피던스에 많은 영향을 미칠 것으로 나타나지 않는 것을 관찰에 달려있다 와측정. 결과는 임피던스 기반의 분석은 표준 CRA에 상대적으로 증가 감도 항원 특이 세포 독성 CD8 T 세포의 수준의 변화를 감지 할 수 보여줍니다. 이러한 결과를 바탕으로, 임피던스 기반의 접근 방식은 CRA의 또는 세포 독성 CD8 T 세포의 기능을 측정하는 것을 목표로 다른 방법에 대한 좋은 대안이 될 수 있습니다.

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

세포독성 CD8 T 세포는 감염되었거나 악성인 숙주 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 세포의 하위 그룹을 구성합니다1. 이 세포들은 ...

다음 실험의 전체적인 목표는 EXOGEN 시스템을 이용한 임피던스 기반 방식과 크롬 방출 분석법을 비교하여 세포독성 T-세포 활성을 결정하는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 fial을 사용하여 전혈에서 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분리합니다. 그다음, 항원 특이적 CD8 T-세포를 생성하기 위해 펩타이드 항원, 인간 재조합 IL-2 및 방사선 조사된 PBMC와 함께 PBMC를 웰에 첨가합니다.그 다음 두 분석법 모두에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 종양 세포와 공동 배양하여 종양 세포 사멸을 유도합니다. 임피던스법과 크롬 방출 분석법 모두를 사용하여 종양 세포의 용해 백분율을 보여주는 결과를 얻습니다. 크롬 방출 분석법과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 임피던스 기반 시스템이 실시간 데이터를 수집하며, 표지가 필요 없는 더 적은 수의 세포가 필요하다는 점입니다. 본 프로토콜에서는 제조업체의 프로토콜에 따라 정상 건강한 HLA-A2 양성 기증자의 혈액으로부터 PBMC(말초혈액 단핵구)를 추출하여 사용합니다.F call PA plus를 사용하여 혈액에서 P BMC를 분리합니다. 다음으로 6-웰 플레이트의 각 웰에 2mL의 배지가 포함된 약 400만 개의 P BMC를 분주합니다. 각 웰에 HLAA 2 결합 펩타이드를 추가하여 최종 농도가 10µg/mL가 되도록 합니다.T 세포의 자극과 증식을 돕기 위해 격일로 세포를 처리합니다. 최종 농도가 50 units/mL이 되도록 인간 재조합 IL-2가 보충된 신선한 배지를 첨가합니다. 1주일 후, 자가 pbmc 배양액을 준비하고 세포를 조사한 뒤 동일한 hla로 2시간 동안 펄싱합니다.10 µg/mL 농도의 결합 펩타이드 2개를 사용하여, 각 웰에 조사된 자가 PBM CS 1 mL를 첨가하여 배양물을 재자극합니다. IL-2가 보충된 신선한 배지를 격일로 계속 첨가하고, 일주일 후 동일한 방식으로 배양물을 두 번째로 재자극합니다. 배양 후 6일이 더 지나면 세포를 사용할 준비가 됩니다.지능형 임피던스 측정 스테이션을 5% carbon dioxide 환경에서 37 °C로 최소 1시간 동안 평형화하여 사용할 준비를 합니다. 0.25% trypsin과 원심분리를 사용하여 75% confluence에 도달한 인간 종양 세포를 수확합니다. 혈구계수기를 사용하여 종양 세포 수를 측정하고 RPMI에 재현탁합니다.마이크로리터당 7,500 cells 농도의 종양 배지입니다. 다음으로, Excel 에이전트 소프트웨어에서 웰 레이아웃을 통해 레이아웃 페이지를 설정합니다. 스케줄 페이지를 설정하여 40시간 동안 5분마다 임피던스를 측정하도록 합니다. 처음 18시간 동안 xCELLigence 시스템은 종양 세포의 임피던스만 측정하게 됩니다.그다음 각 웰에 100 µL의 RPMI 종양 배지를 추가합니다. 세포가 없는 상태에서 임피던스를 측정하여 EPLs의 배경 값을 읽습니다. 종양 세포를 추가한 후, 플레이트를 장비에 장착하고 측정값을 읽기 시작합니다.종양 세포는 즉시 EPLs에 부착되기 시작합니다. 약 18시간 동안 배양하면 종양 세포가 EPLs에 부착되고 웰당 15,000개의 종양 세포로 두 배로 증가합니다. 이때 부드러운 스크래핑과 교반 원심분리법을 통해 준비된 T 세포를 수확합니다.T 세포를 10% FBS가 함유된 RPMI 배지로 재구성하고 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 밀도가 확인되면, 200 µL의 T 세포를 종양 세포에 첨가했을 때 최고 농도가 종양 세포당 40개의 T 세포가 되도록 T 세포의 2배 희석 계열을 준비합니다. 이 희석 계열의 마지막 희석 단계는 종양 세포당 1.25개의 T 세포가 되도록 해야 합니다.EXOGEN 스테이션을 일시 정지하고 피펫을 사용하여 EPL을 제거합니다. 웰의 배지를 제거한 다음, 희석 시리즈의 모든 농도를 음성 대조군으로 사용하여 T 세포 200 µL를 로딩합니다. 순수 배지를 사용하고, EPL을 다시 스테이션에 넣은 후 분석 종료 시점에 프로그램을 재개합니다.결과를 정규화합니다. chromium 51 및 chromium 51 표지 표적 세포를 사용할 때는 항상 기관의 방사선 안전 절차를 준수하고, 방사선 노출을 줄이기 위해 차폐물을 사용하십시오. 먼저 10 µL/mL의 신선한 chromium 51을 사용하여 1 x 10⁶ cells/mL 농도로 종양 세포를 2시간 동안 펄싱합니다.다음으로, 10% FBS가 포함된 RPMI 배지 10 milliliters로 종양 세포를 세척한 후, 세포를 원심 분리하고 동일한 배지를 사용하여 1 milliliter당 1 million cells의 농도로 재현탁합니다. 그다음 96-well round bottom plate에 well당 100,000 tumor cells를 분주하여 자발적 방출(spontaneous release)을 측정합니다.이 중 6개의 웰에는 아무것도 추가하지 않고, 다른 6개의 웰에는 대조군으로 둡니다. 나머지 모든 웰에는 세포를 용해하여 최대 방출량을 계산하기 위해 100 µL의 Triton X 100을 첨가합니다. 이전에 준비한 희석 계열을 사용하여 플레이트에 T-세포를 첨가합니다.이제 플레이트를 5시간 동안 배양하고, 각 웰에서 50 µL의 상층액 샘플을 수집하십시오. 플레이트를 후드 내 실온에서 하룻밤 동안 건조시킨 후, 샘플을 luma 플레이트에 로딩하십시오. 감마 카운터를 사용하여 T세포와 SKBR3 암세포의 CPM을 측정하십시오. 암세포는 X intelligence 플레이트에서 배양되었으며, 세포 지수(cell index)를 측정하였습니다. T세포는 증식을 위해 부착이 필요하지 않으므로, 이는 플레이트 임피던스를 반영합니다.40시간의 배양 기간 동안 이들이 임피던스에 미치는 영향은 무시할 수 있는 수준이었습니다. 암세포만 단독으로 배양했을 때는 임피던스 측정값이 증가하는 양상을 보였습니다. 그러나 배양 18시간 후에 T 세포를 추가하자 이러한 경향이 중단되었습니다.이 이벤트는 T 세포 추가 후 소프트웨어 정규화가 필요하며, 다음 실험에서 더 자세히 조사합니다. SK BR 3 세포를 다양한 농도의 T 세포와 공배양했을 때, 임피던스의 감소는 T 세포의 용량에 따라 매우 분명하게 의존적이었습니다. 데이터는 10시간 시점에서 3회에 걸쳐 5분마다 수집되었습니다. 세포 지수는 T 세포 범위에 따라 2차 다항식을 따랐으며, 이는 Exogen 스테이션이 세포 지수의 하락을 통해 SK BR 3 종양의 CD8 T 세포 매개 사멸을 실시간으로 모니터링함을 나타냅니다. T 세포에 의한 SK BR 3의 임피던스 감소가 항원 특이적인지 결정하고자 하였습니다.SK KBR 3개 세포를 HER2neu를 인식하지 않는 HLA A2 양성 FLU 특이적 T 세포와 공동 배양하였습니다. 이 세포들은 용해 활성이 현저히 낮았습니다. HER2neu 특이적 T 세포가 항원 특이적 방식으로 살상을 수행하는지 추가로 확인하기 위해, 공동 배양 시스템에 Fas 리간드 항체를 첨가하였습니다. 해당 항체는 HER2neu P360 9 특이적 T 세포의 용해 활성을 감소시키지 않았습니다.하지만 anti CD3, CD28 비드로 비특이적으로 활성화된 T 세포의 경우, 살상 작용이 HLA class I 의존적 방식으로 일어나는지 확인하기 위해 항체를 처리했을 때 용해(lysis)가 억제되었습니다. 공동 배양액에 anti HLA class I 항체 또는 isotype 대조 항체를 첨가하였으며, 그 결과는 이 가설을 강력하게 뒷받침하였습니다.다음으로 T 세포를 다른 암세포와 1:5 비율로 공동 배양하였습니다. HLA A 2 음성 종양 세포주인 BT 20을 음성 대조군으로 사용하였습니다. 결과는 본 방법이 여러 표적 부착성 종양 세포에 유용함을 보여줍니다.HER-2 신규 P 360 9 특이적 T 세포의 공배양물을 chromium 51로 표지된 표적 세포에 추가한 후, CRA 분석을 수행하였습니다. 해당 분석법은 일관성을 분석하는 데 더 민감한 것으로 나타났습니다. 분석 내 변동성은 1:40에서 1:5 사이의 각 세포 비율에서 변동 계수 백분율로 계산되었습니다.가장 낮은 세포 비율에서 이는 15% 미만으로 측정되었습니다. 그러나 CV 백분율은 높거나 예측 불가능했습니다. 또한, 서로 다른 P 360 9 특이적 T세포주와의 공동 배양에 의한 SK BR three T세포 용해의 변동성을 조사하였습니다.데이터는 30일 간격으로 생성되었습니다. 분석은 3회 반복 수행되었으며 결과는 매우 유사했습니다. 이 영상을 시청한 후에는 임피던스 기반 접근 방식을 활용하여 항원 특이적 CD8 T 세포와 종양 세포를 이용해 세포독성 T 세포 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

매우 정확한 체외 고처리량 분석 시스템은 암 조직과 유사하지만 96웰 및 384웰 플레이트를 가진 체외 고처리량 분석 시스템에 적합하지 않은 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs)를 사용하여 항암제를 평가하기 위해 개발되었다.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

여기에서는 ADCC bioassay kit를 사용하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 ADCC 메커니즘을 규명하고 암 면역 요법에서 항체의 치료 가능성을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

항체 의존성 세포 매개 세포 독성 리포터 생물학적 분석을 사용하여 암세포의 항체 의존성, 세포 매개 세포 독성 평가

본 프로토콜은 전처리된 종양 세포를 사용한 동종 공동 배양 시스템에서 인간 T 세포 자극의 생체 외 분석을 가능하게 하는 실험 워크플로우를 설명합니다.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

새로운 anti-HER2 단클론 항체를 사용하여 검증된 샌드위치 ELISA 분석을 제시합니다. 이 분석을 통해 체외 배양 세포 및 혈액 및 조직을 포함한 기타 샘플에서 세포 결합 및 방출 HER2 단백질을 정밀하게 정량화할 수 있습니다.

세포에서 방출되고 세포에 결합하는 인간 표피 성장 인자 수용체 2의 포괄적인 측정을 위한 검증된 면역화학 분석

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

학습하세요 xCELLigence 임피던스 기반 분석을 사용하여 CD8 T 세포의 세포독성 활성을 실시간으로 측정하는 방법을. 이 기술은 크로뮴 방출 분석보다 높은 감도와 적은 세포 필요량으로 항원 특이적 종양 세포 용해를 정량화합니다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

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