xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

다음 실험의 전반적인 목표는 EXOGEN 시스템을 이용한 임피던스 기반 방식과 크롬 방출 분석법(chromium release assay)을 비교하여 세포독성 T 세포 활성을 결정하는 것입니다. 첫 번째 단계에서는 fial을 사용하여 전혈에서 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분리합니다. 다음으로, 항원 특이적 CD8 T 세포를 생성하기 위해 펩타이드 항원, 인간 재조합 IL-2 및 조사된 PBMC와 함께 PBMC를 웰에 첨가합니다.

그 후 두 분석법 모두에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 종양 세포와 공동 배양하여 종양 세포 사멸을 유도합니다. 임피던스 방법과 크롬 방출 분석법을 모두 사용하여 종양 세포의 용해 백분율을 나타내는 결과가 얻어집니다. 크롬 방출 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 임피던스 기반 시스템이 실시간 데이터를 수집하며 라벨링이 필요 없는 더 적은 수의 세포를 요구한다는 점입니다. 본 프로토콜에서는 제조사의 프로토콜에 따라 정상 건강한 HLA-A2 양성 기증자의 혈액으로부터 PBMC(말초혈액 단핵구)를 확보합니다.

F call PA plus를 사용하여 혈액에서 P BMC를 분리합니다. 다음으로 6-웰 플레이트의 각 웰에 2mL의 배지에 현탁된 약 400만 개의 P BMC를 분주합니다. 각 웰에 HLAA two 결합 펩타이드를 첨가하여 최종 농도가 10µg/mL가 되도록 합니다.

T세포를 자극하고 증식시키기 위해 격일로 세포를 처리합니다. 최종 농도가 50 units per milliliter가 되도록 인간 재조합 IL-2가 첨가된 신선한 배지를 추가합니다. 일주일 후, 자가 pbmc 배양물을 준비하고, 세포를 조사한 다음 동일한 hla로 2시간 동안 펄싱합니다.

10 µg/mL 농도의 2-결합 펩타이드를 사용하고, 각 웰에 조사된 자가 PBM CS 1 mL를 첨가하여 배양물을 재자극합니다. IL-2가 보충된 신선한 배지를 격일로 계속 첨가하고, 일주일 후 동일한 방식으로 배양물을 두 번째로 재자극합니다. 배양 후 6일이 더 지나면 세포를 사용할 수 있는 상태가 됩니다.

지능형 임피던스 측정 스테이션을 5% carbon dioxide 조건 하에 37 °C에서 최소 1시간 동안 평형화하여 사용할 준비를 합니다. 0.25% trypsin과 원심분리를 이용하여 75% 합류도를 보이는 인간 종양 세포를 수확합니다. 혈구계수기로 종양 세포의 수를 측정하고 RPMI에 재현탁합니다.

마이크로리터당 7,500 cells 농도의 종양 배지입니다. 다음 프로그램으로, Excel 에이전트 소프트웨어를 사용하여 웰 레이아웃이 포함된 레이아웃 페이지를 설정합니다. 스케줄 페이지를 설정하여 40시간 동안 5분마다 임피던스를 측정하도록 하며, 처음 18시간 동안 Xceligent 시스템은 종양 세포의 임피던스만 측정합니다.

그런 다음 웰당 100 µL의 RPMI 종양 배지를 추가합니다. 세포가 없는 상태에서 임피던스를 측정하여 EPLs의 배경 값을 읽습니다. 종양 세포를 추가한 후, 플레이트를 스테이션에 적재하고 측정값을 읽기 시작합니다.

종양 세포는 즉시 EPL에 부착되기 시작합니다. 약 18시간 동안 배양하면 종양 세포가 EPL에 부착되고 웰당 15,000개의 종양 세포로 증식하게 됩니다. 이때, 부드러운 스크래핑과 교반 원심분리법을 통해 준비된 T 세포를 수확하십시오.

T 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지로 재구성하고, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 밀도가 확인되면, T 세포 200 µL를 종양 세포에 첨가했을 때 최고 농도가 종양 세포당 40개의 T 세포가 되도록 T 세포의 2배 희석 계열을 준비합니다. 이 희석 계열의 마지막 단계에서는 종양 세포당 1.25개의 T 세포가 제공되어야 합니다.

EXOGEN 스테이션을 일시 정지하고 피펫을 사용하여 EPL을 제거합니다. 웰 내의 배지를 제거한 다음, 음성 대조군으로서 희석 시리즈의 모든 농도가 포함된 T 세포 200 µL를 로딩합니다. 순수 배지를 사용하고, EPL을 다시 스테이션에 넣은 후 분석 종료 시점에서 프로그램을 계속 진행합니다.

결과를 표준화합니다. chromium 51 및 chromium 51로 표지된 표적 세포를 다룰 때는 항상 기관의 방사선 안전 절차를 준수하고, 방사선 노출을 줄이기 위해 차폐 장치를 사용하십시오. 먼저 10 µL/mL의 신선한 chromium 51을 사용하여 1 x 10⁶ cells/mL 농도로 종양 세포를 2시간 동안 펄싱합니다.

다음으로, 10% FBS가 포함된 RPMI 배지 10 mL로 종양 세포를 세척한 후 세포를 원심 분리하고, 동일한 배지를 사용하여 mL당 100만 개의 세포 농도로 재현탁합니다. 그런 다음 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 웰당 100,000개의 종양 세포를 분주하여 자발적 방출량을 계산합니다.

이 중 6개의 웰에는 아무것도 추가하지 않고, 다른 6개의 웰에는 대조군으로 둡니다. 나머지 모든 웰에는 세포를 용해하여 최대 방출량을 계산하기 위해 100 µL의 Triton X 100을 첨가합니다. 이전에 준비한 희석 시리즈를 사용하여 플레이트에 T-세포를 분주합니다.

이제 플레이트를 5시간 동안 배양하고, 각 웰에서 50 µL의 상층액 샘플을 수집합니다. 플레이트를 후드 내 상온에서 하룻밤 동안 건조시킨 후, 샘플을 luma 플레이트에 로딩합니다. 감마 카운터를 사용하여 T-cell과 SKBR3 암세포의 CPM을 측정합니다. 암세포는 X intelligence 플레이트에서 배양되었으며, 플레이트 임피던스를 반영하는 세포 지수를 측정하였습니다. T세포는 증식하는 데 부착이 필요하지 않기 때문입니다.

40시간의 배양 기간 동안 이들이 임피던스에 미치는 영향은 미미했습니다. 암세포만 배양했을 때는 임피던스 측정값이 증가하는 경향을 보였습니다. 그러나 18시간째에 T 세포를 추가하면 이러한 추세가 중단됩니다.

이 현상은 T 세포 추가 후 소프트웨어 정규화가 필요하며, 다음 실험에서 추가로 조사됩니다. SK BR 3 세포를 다양한 농도의 T 세포와 공동 배양했을 때, 임피던스의 감소는 T 세포의 농도에 따라 매우 명확하게 의존적이었습니다. 데이터는 10시간 시점에서 3회 반복 실험을 통해 5분마다 수집되었습니다. 세포 지수(cell indices)는 T 세포 범위에 대해 2차 다항식을 따랐으며, 이는 Exogen station이 세포 지수의 하락을 통해 CD8 T 세포 매개 SK BR 3 종양의 사멸을 실시간으로 모니터링함을 나타냅니다. T 세포에 의한 SK BR 3의 임피던스 감소가 항원 특이적인지 결정하기 위해 분석을 수행하였습니다.

SK KBR 3 세포를 HER2 neu를 인식하지 않는 HLA A2 양성 FLU 특이적 T 세포와 공동 배양하였습니다. 이 세포들은 용해 활성이 현저히 낮았습니다. HER2 neu 특이적 T 세포가 항원 특이적 방식으로 살상을 수행하는지 추가로 확인하기 위해, Fas 리간드 항체를 공동 배양에 포함시켰습니다. 해당 항체는 HER2 neu P360 9 특이적 T 세포의 용해 활성을 감소시키지 않았습니다.

하지만 anti CD three, CD 28 비드로 비특이적으로 활성화된 T 세포의 경우, 항체가 용해를 억제하였습니다. 이는 살상 작용이 HLA class one 의존적 방식으로 일어나는지 확인하기 위한 것이었습니다. 공동 배양물에 anti HLA class one 항체 또는 isotype 대조 항체를 첨가하였습니다. 결과는 이 가설을 강력하게 뒷받침하였습니다.

다음으로 T 세포를 다른 암 세포와 1:5 비율로 공동 배양하였습니다. HLA A2 음성 종양 세포주인 BT 20을 음성 대조군으로 사용하였습니다. 결과는 본 방법이 여러 표적 부착성 종양 세포에 유용함을 보여줍니다.

HER two new P 360 9 특이적 T 세포의 공배양물을 크롬 51로 표지된 표적 세포에 추가한 후, CRA 분석을 수행하였습니다. 이 분석법은 일관성을 분석하는 데 더 민감한 것으로 나타났습니다. 분석 내 변동은 1:40에서 1:5 사이의 각 세포 비율에서 변동 계수 백분율로 계산되었습니다.

가장 낮은 세포 비율에서 이 값은 15% 미만으로 측정되었습니다. 하지만 % CV는 높거나 예측 불가능했습니다. 또한, 서로 다른 P 360 9 특이적 T세포주와의 공배양을 통한 SK BR three T세포 용해의 변동성을 조사하였습니다.

데이터는 30일 간격으로 생성되었습니다. 분석은 3회 반복 수행되었으며 결과는 매우 유사했습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 임피던스 기반 방식을 이용하여 항원 특이적 CD8 T 세포와 종양 세포를 통해 세포독성 T세포 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.