CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

이 프로토콜의 전반적인 목표는 여러 guide RNA를 하나의 CRISPR-concatemer 벡터로 클로닝하고 마우스 장 오가노이드에서 고효율 전기천공을 달성하여 여러 유전자의 동시 knockout을 얻는 것입니다. 이 방법은 병렬 보상의 잠재적 효과를 극복할 수 있도록 함으로써 손실된 기능 연구의 효율성을 크게 향상시킬 수 있습니다. CRISPR-concatemer 전략의 주요 장점은 단일 클로닝 단계의 편리함과 최대 4개의 서로 다른 유전자를 동시에 knockout할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Alessandra Merenda가 수행할 것입니다. guide RNA 또는 gRNA를 CRISPR-concatemer 벡터로 클로닝하는 것은 각 gRNA 올리고뉴클레오타이드의 상단 및 하단 가닥을 어닐링하고 말단을 인산화하는 단일 반응으로 시작됩니다. 얼음 위에서 반응 혼합물을 준비하고, 3개의 연결체에 대해 3마이크로리터의 상단 가닥 gRNA, 3마이크로리터의 하단 가닥 gRNA, 2마이크로리터의 T4 DNA 리가제 완충액, 1마이크로리터의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 최대 총 20마이크로리터의 물을 사용합니다.

피펫팅을 하고 다음 설정을 사용하여 thermocycler를 실행하여 잘 혼합합니다., 섭씨 37도에서 30분, 섭씨 95도에서 5분, 분당 섭씨 0.3도에서 섭씨 25도까지 내리고 섭씨 4도에서 유지합니다. 다음 단계는 Bbs1 셔플링 반응으로, 사전 어닐링된 gRNA 올리고뉴클레오티드를 concatemer 벡터의 적절한 위치에 통합합니다. 반응 혼합물을 DNA, RNA 자유수에 1에서 100까지 희석하여 3개 및 4개의 gRNA concatemer 벡터를 생성합니다.

얼음 위에서 Bbs1 셔플링 반응을 조립합니다. CRISPR-concatemer 벡터 100나노그램, 올리고 혼합물 10마이크로리터, 제한 효소 완충액 1마이크로리터, DTT 1마이크로리터, ATP 1마이크로리터, Bbs1 효소 1마이크로리터, T7 리가아제 1마이크로리터 및 총 부피 20마이크로리터까지의 물을 사용합니다. 피펫팅으로 잘 혼합하고 벡터를 포함하는 negative control을 포함합니다.

3개 및 4개의 gRNA 연결체를 클로닝하기 위해 다음 설정을 사용하여 열순환기에서 반응을 실행하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 50회, 섭씨 21도에서 5분 동안 50회를 실행하고, 섭씨 37도에서 15분 동안 유지한 다음 섭씨 4도에서 무기한 유지합니다. 두 개의 gRNA concatemer에 대해 step 1의 25 cycles로 동일한 설정을 실행합니다. Bbs1 셔플링 반응이 완료되면 각 ligation mix 11 microlit를 취하여 총 부피 15 microl에 exonuclease buffers 1.5 μl, ATP 1.5 μl, DNA exonuclease 1 microl 및 물을 추가합니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 70도에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 반응 혼합물은 표준 프로토콜에 따라 화학적으로 유능한 E.Coli 박테리아를 변형시키는 데 사용됩니다. CRISPR-concatemer 벡터에 gRNA insert가 있는지 확인하려면 접종 루프로 박테리아 군체를 선택하고 각각 4ml의 LB 배지를 접종합니다.

클론을 섭씨 37도의 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 성장시킵니다. 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 miniprep 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. 각 DNA 샘플 약 200나노그램을 10마이크로리터 반응에서 10단위의 EcoR1 및 5단위의 BglII와 혼합합니다.

크기 비교를 위해 해당 원래 벡터를 positive control로 사용하는 별도의 반응 혼합물을 포함합니다. 섭씨 37도에서 3시간 동안 반응을 배양합니다. 1% 아가로스 젤에서 90볼트에서 약 20분 동안 분해 반응을 실행합니다.

UV transilluminator를 사용하여 겔을 시각화하여 올바른 인서트 크기를 가진 클론을 식별합니다. gRNA가 올바른 위치로 클로닝되어 모든 Bbs1 인식 부위가 손실되었는지 확인하기 위해 선택한 클론을 5단위의 Bbs1로 분해합니다. 별도의 반응 mix를 포함하고, 해당 original vector를 control로 사용합니다.

섭씨 37도에서 3시간 동안 배양하고 90볼트에서 약 20분 동안 1% 아가로스 젤에서 분해 반응을 실행합니다. UV transilluminator를 사용하여 겔을 시각화하여 Bbs1에 의해 절단되지 않은 벡터를 식별합니다. 전기천공을 위해 오가노이드를 분할할 때, transvection당 48웰 플레이트의 최소 6웰을 파종합니다.

20마이크로리터 지하 매트릭스 방울에 오가노이드를 파종하고 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도의 웰과 5%이산화탄소에서 250마이크로리터의 WENR과 니코틴아미드 배지로 성장시킵니다. 2일차에는 WENR과 니코틴아미드 배지를 항생제가 없는 250마이크로리터의 EGF 플러스 노긴, GSK3 억제제 및 암석 억제제 배지로 교체합니다. 3일차에는 오가노이드 배지를 EGF와 노긴, GSK3 억제제, 암석 억제제 및 항생제를 사용하지 않는 1.25% 디메틸설폭사이드로 변경합니다.

4일차에는 1ml 피펫 팁을 사용하여 지하 매트릭스 돔을 파괴하고 오가노이드를 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 48웰 플레이트의 웰 4개 내용물을 하나의 튜브로 당깁니다. P200 피펫으로 약 200회 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 작은 조각으로 분해합니다.

실온에서 600배 G로 5분간 원심분리기를 사용합니다. 원심분리 후 모든 튜브에서 배지를 제거하고 팔레트를 1ml의 세포 배양 등급 재조합 프로테아제에 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 최대 5분 동안 배양합니다.

프로테아제 처리를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요한데, 그 이유는 전기천공법의 성공 여부가 단일 세포 대신 세포의 클러스터를 포함하는 세포 현탁액을 얻는 데 달려 있기 때문입니다. 4배 대물렌즈가 있는 도립광 현미경으로 50마이크로리터의 샘플 방울을 확인합니다. 10 내지 15개의 세포로 구성된 클러스터는 전기천공법 후 세포 생존을 증가시키기 때문에 바람직합니다.

세포 현탁액을 결합력이 낮은 15ml 튜브로 옮기고 항생제 없이 9ml의 기저 배지를 첨가하여 해리를 호거합니다. 실온에서 600배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 1ml의 환원된 세럼 배지에 팔레트를 다시 현탁시킵니다.

burkes 약실을 가진 세포의 수를 세십시오, electroporation 반응 당 5번째 세포에 10에 최소한의 1 곱하기 세포는 필요합니다. 세포 현탁액과 원심분리가 들어 있는 15ml 튜브에 9ml의 환원된 혈청 배지를 400배 G로 실온에서 3분 동안 첨가하여 이 절차를 시작합니다. 모든 상층액을 제거하고 electroporation 용액에 팔레트를 다시 현탁시킵니다.

두 개의 새 튜브에 총 10마이크로그램의 DNA를 추가합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 최종 부피에 전기천공법을 첨가하고 세포 DNA 혼합물을 얼음 위에 유지합니다. 세포 DNA 혼합물을 electroporation 큐벳으로 옮기고 큐벳을 electroporator 챔버에 놓습니다.

electroporator의 해당 버튼을 눌러 임피던스를 측정하고 0.030-0.055옴인지 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 표시된 설정에 따라 electroporation을 수행합니다. 큐벳에 400마이크로리터의 전기천공 완충액과 암석 억제제를 첨가한 다음 모든 내용물을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

세포가 회복될 수 있도록 실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 실온에서 3분간 400회 G로 돌립니다. 상층액을 제거하고 지하 매트릭스의 웰당 20마이크로리터에 팔레트를 다시 현탁합니다.

48 웰 플레이트에서 웰 당 10에서 4 배에서 10 배에서 5 번째 세포를 약 1 배 파종하고 EGF와 노긴, GSK3 억제제, 암석 억제제 및 1.25 % 디메틸 설폭 사이드 배지를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음 날, 배지를 EGF와 노긴, GSK3 억제제, 암석 억제제로 변경하고 GFP 발현을 관찰하여 형질전환 효율을 확인합니다.

오가노이드를 섭씨 37도로 유지하십시오. 2일 후 배지를 새 배지로 교체하십시오. electroporation 4 일 후에 매체를 WENR과 니코틴아미드 및 암석 억제제 배지로 변경하고 섭씨 37도에서 세포를 계속 배양합니다.

concatemer vector에 정확한 수의 gRNA inserts가 있는지 여부는 EcoR1 및 BglII를 사용한 이중 제한 분해에 의해 확인됩니다. lower band의 예상 크기는 4개의 gRNA concatemer vector의 경우 약 1.6 kilobase이고 3개의 gRNA concatemer vector의 경우 1.2 kilobase입니다. 또한 Bbs1을 사용한 절단은 gRNA가 올바른 위치로 클로닝되어 결과적으로 모든 Bbs1 인식 부위가 손실되었음을 확인합니다.

확인된 구조체는 전기천공법을 통해 마우스 장 오가노이드에 전달되어 GFP 발현에서 볼 수 있듯이 최대 70%의 transvection 효율을 달성합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 여러 유전자를 동시에 knockout하기 위해 gRNA concatemer 벡터를 생성하는 방법과 전기천공법을 사용하여 3D 오가노이드 배양에 효율적으로 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.