CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

본 프로토콜의 전반적인 목표는 여러 개의 가이드 RNA를 하나의 CRISPR-concatemer 벡터로 클로닝하고, 마우스 장 오가노이드에서 고효율의 전기천공법을 달성하여 여러 유전자를 동시에 녹아웃시키는 것입니다. 이 방법은 병렬 보상 작용의 잠재적 영향을 극복할 수 있게 함으로써 기능 상실 연구의 효율성을 크게 향상시킬 수 있습니다. 당사의 CRISPR-concatemer 전략의 주요 장점은 단 한 번의 클로닝 단계로 간편하게 수행할 수 있으며, 최대 4개의 서로 다른 유전자를 동시에 녹아웃시킬 수 있다는 점입니다.

시연은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Alessandra Merenda가 진행하겠습니다. CRISPR-concatemer 벡터로의 가이드 RNA(gRNA) 클로닝은 각 gRNA 올리고뉴클레오타이드의 상단 및 하단 가닥을 어닐링하고 말단을 인산화하는 단일 반응으로 시작됩니다. 얼음 위에서 반응 혼합물을 준비하며, 3개의 concatemer를 위해 3 µL의 상단 가닥 gRNA, 3 µL의 하단 가닥 gRNA, 2 µL의 T4 DNA ligase buffer, 1 µL의 T4 polynucleotide kinase를 넣고 총 부피가 20 µL가 되도록 물을 추가합니다.

피펫팅으로 잘 혼합한 후, 다음과 같은 설정으로 써모사이클러(thermocycler)를 작동시키십시오: 37 °C에서 30분, 95 °C에서 5분, 분당 0.3 °C 속도로 25 °C까지 온도를 내린 후 4 °C에서 유지합니다. 다음 단계는 Bbs1 셔플링 반응으로, 사전 어닐링된 gRNA 올리고뉴클레오타이드가 컨카테머 벡터의 적절한 위치에 삽입됩니다. 반응 혼합물을 DNA 및 RNA-free water로 1:100 비율로 희석하여 3개 및 4개의 gRNA 컨카테머 벡터를 생성하십시오.

Bbs1 셔플링 반응액을 얼음 위에서 조제합니다. CRISPR-concatemer 벡터 100 nanograms, 올리고 혼합물 10 microliters, 제한 효소 버퍼 1 microliter, DTT 1 microliter, ATP 1 microliter, Bbs1 효소 1 microliter, T7 ligase 1 microliter를 넣고, 최종 부피가 20 microliters가 되도록 물을 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞어주며, 벡터만 포함된 음성 대조군을 함께 준비합니다.

다음 설정을 사용하여 써모사이클러(thermocycler)에서 반응을 진행합니다. 3개 및 4개 gRNA 연결체(concatemer)를 클로닝하는 경우, 37 °C에서 5분, 21 °C에서 5분 동안 50회 반복한 후, 37 °C에서 15분 동안 유지하고 이어서 4 °C에서 무기한 유지합니다. 2개 gRNA 연결체의 경우, 첫 번째 단계를 25회 반복하는 것을 제외하고 동일한 설정을 적용합니다. Bbs1 셔플링(shuffling) 반응이 완료되면, 각 라이게이션 믹스 11 µL에 exonuclease 버퍼 1.5 µL, ATP 1.5 µL, DNA exonuclease 1 µL 및 증류수를 추가하여 총 부피를 15 µL로 맞춥니다.

37 °C에서 30분 동안 배양한 후, 이어서 70 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 표준 프로토콜에 따라 화학적로 유능한 E.Coli 박테리아에 반응 혼합물을 형질전환시킵니다. CRISPR-concatemer 벡터 내 gRNA 삽입물의 존재를 확인하기 위해, 백금이로 박테리아 콜로니를 선택하여 각각 4 mL의 LB 배지에 접종합니다.

클론을 37 °C의 오비탈 셰이커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 제조사의 지침에 따라 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. 각 DNA 샘플 약 200 ng을 10 U의 EcoR1 및 5 U의 BglII와 함께 10 µL 반응액에 혼합합니다.

크기 비교를 위한 양성 대조군으로 해당하는 원래 벡터를 포함한 별도의 반응 혼합물을 준비하십시오. 반응액을 37 °C에서 3시간 동안 배양하십시오. 1% agarose gel에서 90 V로 약 20분 동안 제한 효소 처리 반응물을 전기영동하십시오.

UV 투과조명기를 사용하여 겔을 시각화하고, 삽입물 크기가 정확한 클론을 식별합니다. gRNA가 올바른 위치에 클로닝되어 결과적으로 모든 Bbs1 인식 부위가 소실되었는지 확인하려면, 선택한 클론을 5 unit의 Bbs1으로 제한효소 처리합니다. 대조군으로 해당 원래의 벡터를 포함한 별도의 반응 혼합물을 준비합니다.

37°C에서 3시간 동안 배양한 후, 1% agarose gel에서 90V로 약 20분간 소화 반응물을 전기영동합니다. UV transilluminator를 사용하여 gel을 시각화하고 Bbs1에 의해 절단되지 않은 벡터를 확인합니다. 전기천공법을 위해 오가노이드를 분할할 때, 트랜스벡션당 48-well plate의 최소 6개 well에 분주합니다.

오가노이드를 20 µL의 basement matrix 방울에 시딩하고, 가습 인큐베이터 내 37 °C 및 5% CO2 조건에서 웰당 250 µL의 WENR 및 nicotinamide 배지에서 배양합니다. 2일 차에, WENR 및 nicotinamide 배지를 항생제가 포함되지 않은 250 µL의 EGF, noggin, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제 배지로 교체합니다. 3일 차에, 오가노이드 배지를 항생제가 포함되지 않은 EGF, noggin, GSK3 억제제, ROCK 억제제 및 1.25% dimethyl sulfoxide 배지로 변경합니다.

4일 차에 1 mL 피펫 팁을 사용하여 기저막 매트릭스 돔을 파쇄하고 오가노이드를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 48웰 플레이트의 4개 웰 내용물을 하나의 튜브에 모읍니다. P200 피펫으로 약 200회 정도 파이펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 작은 조각으로 분쇄합니다.

실온에서 600 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 모든 튜브에서 배지를 제거하고 펠렛을 1 mL의 세포 배양 등급 재조합 프로테아제에 재부유시킵니다. 37 °C에서 최대 5분 동안 배양합니다.

전기천공법의 성공 여부는 단일 세포가 아닌 세포 군집이 포함된 세포 현탁액을 얻는 것에 달려 있으므로, 프로테아제 처리를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. 4배율 대물렌즈가 장착된 도립 광학 현미경으로 50 µL의 샘플 방울을 확인하십시오. 10~15개의 세포로 이루어진 군집이 형성되는 것이 바람직하며, 이는 전기천공 후 세포 생존율을 높여줍니다.

세포 현탁액을 low binding 15 milliliter 튜브로 옮기고, 항생제가 포함되지 않은 basal medium 9 milliliter를 첨가하여 해리를 중단시킵니다. 이를 상온에서 600 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 1 milliliter의 reduced serum medium에 다시 현탁합니다.

Burkes chamber를 사용하여 세포 수를 측정하며, 전기천공법 반응당 최소 1 × 10⁵개의 세포가 필요합니다. 우선 세포 현탁액이 들어 있는 15 mL 튜브에 저혈청 배지 9 mL를 넣고, 실온에서 400 ×g로 3분 동안 원심분리하여 이 절차를 시작합니다. 모든 상층액을 제거하고 펠릿을 전기천공 용액에 재현탁합니다.

두 개의 새 튜브에 총 10 micrograms의 DNA를 넣습니다. 그다음, 최종 부피가 100 microliters가 되도록 전기천공 용액을 추가하고 세포-DNA 혼합물을 얼음 위에 둡니다. 세포-DNA 혼합물을 전기천공 큐벳으로 옮긴 후, 큐벳을 전기천공기 챔버에 넣습니다.

전기천공기의 적절한 버튼을 눌러 임피던스를 측정하고, 이것이 0.030에서 0.055 ohm 사이인지 확인하십시오. 텍스트 프로토콜에 표시된 설정에 따라 전기천공을 수행하십시오. 전기천공 버퍼와 rock 억제제가 혼합된 용액 400 microliters를 큐벳에 넣은 후, 내용물 전체를 1.5 milliliter 튜브로 옮기십시오.

세포가 회복될 수 있도록 상온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 상온에서 400 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 웰당 20 µL의 basement matrix에 펠릿을 재현탁합니다.

48웰 플레이트의 웰당 약 1 × 10⁴ ~ 1 × 10⁵개의 세포를 분주하고 EGF 및 noggin, GSK3 억제제, rock 억제제와 1.25% dimethyl sulfoxide가 포함된 배지를 첨가합니다. 37 °C에서 배양합니다. 다음 날, 배지를 EGF 및 noggin, GSK3 억제제, rock 억제제가 포함된 배지로 교체하고 GFP 발현을 관찰하여 형질전환 효율을 확인합니다.

오가노이드를 37 °C에서 유지하십시오. 2일 후, 배지를 신선한 배지로 교체하십시오. 전기천공 4일 후, 배지를 nicotinamide와 rock inhibitor가 첨가된 WENR 배지로 변경하고 세포를 37 °C에서 계속 배양하십시오.

EcoR1 및 BglII를 이용한 이중 제한효소 절단을 통해 컨캐트머(concatemer) 벡터 내에 정확한 수의 gRNA 삽입물이 존재하는지 확인합니다. 예상되는 하단 밴드의 크기는 4개 gRNA 컨캐트머 벡터의 경우 약 1.6 kilobase, 3개 gRNA 컨캐트머 벡터의 경우 1.2 kilobase입니다. 또한, Bbs1 절단을 통해 gRNA가 올바른 위치에 클로닝되었으며, 결과적으로 모든 Bbs1 인식 부위가 제거되었음을 확인합니다.

확인된 컨스트럭트는 전기천공법(electroporation)을 통해 마우스 장 오가노이드로 전달되며, GFP 발현을 통해 확인한 결과 최대 70%의 형질전환 효율을 달성하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 여러 유전자를 동시에 녹아웃(knockout)시키기 위해 gRNA 컨카테머(concatemer) 벡터를 생성하는 방법과 전기천공법을 이용하여 3D 오가노이드 배양물에 이를 효율적으로 전달하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.