공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

이 미세유체 바이오프린팅 방법론의 전반적인 목표는 혈관화된 조직 구조체를 생성하는 것입니다. 이 방법은 혈관화된 조직의 바이오 제작에서 핵심적인 문제들을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 2차 세포 시딩 과정을 통해 혈관화된 조직을 엔지니어링하기 위한 3차원 형상 제어 혈관 용기를 생성하는 데 다각적으로 활용 가능하다는 점입니다.

본 프로토콜은 혈관화된 심장 조직 공학에 대한 통찰을 제공하지만, 간, 피부 및 암 조직과 같은 다양한 다른 조직 유형에도 적용될 수 있습니다. 이 방법에 익숙하지 않은 일반 사용자의 경우 바이오프린터 설정 과정이 간단하지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 외피(sheath) 역할을 하는 더 큰 둔needle의 중심에 코어 역할을 하는 더 작은 둔needle을 삽입하여 이중 층 동심 마이크로유체 프린트 헤드를 제작하십시오.

코어 니들이 외피 밖으로 약 1mm 정도 돌출되었는지 확인하십시오. 그 후 중앙 니들의 배럴에 23 gauge 니들을 반대 방향으로 삽입하십시오. 외피 니들의 배럴 측면에 구멍을 뚫고 그에 맞는 크기의 금속 커넥터를 삽입하십시오.

에폭시 접착제로 밀봉합니다. 폴리메틸 메타크릴레이트 또는 PMMA 홀더를 사용하여 익스트루더를 바이오프린터의 헤드에 장착합니다. 다음으로, 두 개의 PVC 튜브를 통해 바이오잉크와 가교 용액을 각각 주입하기 위해 프린트 헤드의 입구를 듀얼 채널 시린지 펌프에 연결합니다.

알지네이트, gelMA 및 광개시제 혼합물을 사용하여 바이오잉크를 제조합니다. 10% 태아 송아지 혈청(FBS)이 포함된 25 millimolar HEPES 완충액에 용해합니다. 그다음, 가교 운반 액체로 사용할 수 있도록 10% FBS가 포함된 HEPES 완충액에 0.3 molar 염화칼슘 용액을 제조합니다.

바이오프린팅 직전에 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 5~10분 동안 트립신 처리합니다. 15 mL 튜브에 담긴 세포를 80 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 5~10회 천천히 피펫팅하여 세포를 바이오잉크에 5~10 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.

다음으로 듀얼 채널 시린지 펌프를 사용하여 한쪽 채널로는 HUVEC이 포함된 바이오잉크를, 다른 쪽 채널로는 가교액을 5 µL/min의 유량으로 주입하기 시작합니다. 흐름이 안정될 때까지 최대 1분 동안 계속해서 흐르도록 둡니다. 그 후, 바이오프린터의 적층 속도를 약 4 mm/s로 유지하며 프린트 헤드를 이동시키기 시작합니다.

이 바이오프린팅을 통해 알지네이트 성분의 빠른 이온 겔화와 마이크로섬유 스캐폴드의 증착이 이루어져야 합니다. 스캐폴드 프린팅이 완료되면, 5~10 mW/cm²의 UV 광원을 사용하여 gelMA 성분을 20~30초 동안 광가교시켜 화학적 겔화를 완료합니다. 그 후, 37 °C의 따뜻한 PBS로 스캐폴드를 부드럽게 헹구어 과잉의 염화칼슘을 제거합니다.

이 스캐폴드를 37°C, 5% CO2 농도의 혈관 내피 세포 성장 배지에서 최대 16일 동안 배양하십시오. 배지는 최소 2일마다 교체하십시오. 배양 기간 동안 현미경으로 HUVEC을 관찰하여, 세포가 스캐폴드 미세섬유의 주변부로 이동하여 내강과 유사한 구조를 형성하는지 확인하십시오.

그런 다음 멸균 여과지를 이용하여 모세관 현상으로 스캐폴드의 간질 공간에서 배지를 조심스럽게 모두 제거합니다. 즉시 심근세포와 같은 제2차 세포 유형의 현탁액 한 방울을 스캐폴드 위에 첨가하여 세포가 전체 간질 공간으로 침투하게 합니다. 그 후 이 스캐폴드를 인큐베이터에서 30분에서 2시간 동안 배양하여 세포가 개별 마이크로섬유에 부착되도록 합니다.

PBS로 스캐폴드를 부드럽게 세척하여 비부착 세포를 제거합니다. 원하는 혈관화 조직이 형성될 때까지 적절한 배지에서 이 스캐폴드를 배양합니다. 여기서 설명하는 미세유체 바이오프린팅은 저점도 바이오잉크를 사용하여 미세섬유 스캐폴드를 직접 바이오프린팅할 수 있게 해줍니다.

30개 이상의 미세섬유를 포함하는 6 x 6 x 6 mm² 크기의 스캐폴드를 10분 이내에 바이오프린팅할 수 있었습니다. 스캐폴드 현미경 사진의 상단 및 측면 뷰는 바이오프린팅 과정 동안의 우수한 구조적 무결성을 보여줍니다. 이는 알긴산 성분과 염화칼슘의 즉각적인 이온 가교 결합을 통해 달성되었습니다.

바이오잉크의 미세유체 압출, 이온 가교 및 광가교 후, HUVEC은 상대적으로 높은 생존율을 유지했습니다. 세포는 0일 차의 초기 무작위 분포에서 16일 차에는 마이크로섬유의 주변부로 증식 및 이동했습니다. 스캐폴드에 파종된 신생 쥐 심근세포는 성숙하여 스캐폴드 전체에 정착했습니다.

이들은 sarcomeric alpha actinin 및 connexin 43과 같은 기능적 심장 바이오마커의 강한 발현을 보였습니다. 심근세포가 채워진 바이오프린팅 미세섬유 지지체의 공초점 현미경 관찰 결과, HUVEC와 심근세포가 모두 공존함이 확인되었습니다.

HUVEC은 주로 마이크로섬유의 경계에 존재하며, 심근세포는 마이크로섬유의 외곽을 둘러싸고 있습니다. 세포들은 세포 소스와 스캐폴드의 구성에 따라 최대 9일에서 28일까지 자발적이고 동기화된 박동을 유지할 수 있었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 마이크로유체 바이오프린팅 기술을 이용하여 혈관화된 조직을 제작하는 방법뿐만 아니라, 프린트 헤드 제작 및 바이오프린터 작동법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 프린트 헤드 제작과 바이오프린터 작동은 이전에 사용해 본 적이 없는 사람에게는 까다로울 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 시도할 때, 프린트 헤드 내의 두 바늘이 동심원이 되도록 맞추고 바이오프린팅을 시작하기 전에 흐름이 안정화될 때까지 기다리는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이 기술의 개발을 통해 조직 공학 및 바이오 패브리케이션 분야의 연구자들은 이제 생체 내(in vivo) 재생 목적이나 생체 외(in vitro) 조직 모델링을 위한 혈관화된 조직 구조체를 생성할 수 있는 또 다른 유용한 도구를 갖게 되었습니다.