공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

이 미세유체 바이오프린팅 방법론의 전반적인 목표는 혈관화된 조직 구조를 생성하는 것입니다. 이 방법은 혈관 조직의 생체 제조에 대한 주요 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 2차 세포 파종 과정을 통해 혈관 조직을 엔지니어링하기 위해 3차원 모양으로 제어되는 혈관 통을 생성하는 데 다재다능하다는 것입니다.

이 프로토콜은 혈관화된 심장 조직 엔지니어링에 대한 통찰력을 제공하지만 간, 피부, 심지어 암과 같은 다른 많은 조직 유형에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 일반 개인은 바이오프린터 설정이 간단하지 않을 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 코어 역할을 하는 더 작은 무딘 바늘을 칼집 역할을 하는 더 큰 무딘 바늘의 중앙에 삽입하여 이중층 동심 미세유체 프린트 헤드를 구성합니다.

코어 바늘이 외부 쉘에서 약 1mm 돌출되어 있는지 확인하십시오. 그 후 중앙 바늘의 배럴에 23 게이지 바늘을 반대 방향으로 삽입합니다. 바깥 쪽 바늘의 배럴 측면에 구멍을 뚫고 일치하는 크기의 금속 커넥터를 삽입합니다.

에폭시 접착제로 밀봉하십시오. 폴리메틸 메타크릴레이트 또는 PMMA 홀더를 사용하여 압출기를 바이오프린터 헤드에 장착합니다. 다음으로 두 개의 PVC 튜브를 통해 바이오잉크와 가교 용액을 개별적으로 주입하기 위해 프린트 헤드의 입구를 이중 채널 주사기 펌프에 연결합니다.

알긴산염, gelMA 및 광개시제의 혼합물을 사용하여 바이오잉크를 만듭니다. 10% 소 태아 혈청 또는 FBS를 함유한 25밀리몰 HEPES 완충액에 용해됩니다. 그런 다음 10 % FBS를 함유 한 HEPES 완충액에 0.3 몰 염화칼슘 용액을 만들어 가교 캐리어 유체로 사용한다.

바이오프린팅 직전에 5분에서 10분 동안 인간 제대 정맥 내피 세포 또는 HUVEC를 트립신화합니다. 15ml 튜브에서 800RPM으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 5-10회 천천히 5-10회 피펫팅하여 밀리리터당 6개의 세포에 5-10배의 농도로 바이오잉크의 세포를 재현탁합니다.

다음으로 이중 채널 주사기 펌프를 사용하여 하나를 통해 HUVECs laiden bioink의 주입을 시작하고 다른 채널을 통해 가교 유체를 분당 5마이크로리터의 유속으로 주입하기 시작합니다. 흐름이 안정화될 때까지 최대 1분 동안 계속 실행되도록 합니다. 그 후, 초당 약 4mm의 바이오프린터 증착 속도를 유지하여 프린트 헤드 움직임을 시작합니다.

이 바이오프린팅은 알긴산염 성분의 빠른 이온 겔화와 극세사 골격의 증착을 초래해야 합니다. 골격을 인쇄한 후 gelMA 구성 요소를 제곱센티미터당 5-10밀리와트의 자외선으로 20-30초 동안 포토 가교하여 화학적 겔화를 달성합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 따뜻한 PBS로 부드럽게 헹궈 골격에서 과도한 염화칼슘을 제거합니다.

이 골격을 섭씨 37도의 내피 세포 성장 배지에서 최대 16일 동안 5부피 퍼센트 CO2로 배양합니다. 적어도 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오. 배양 기간 동안 HUVEC이 골격 극세사의 주변부로 이동하여 구조와 같은 내강을 형성할 때까지 현미경으로 HUVEC을 모니터링합니다.

그런 다음 멸균 여과지 조각을 사용하여 모세관 힘으로 골격의 내부 공간에서 전체 매체를 조심스럽게 제거합니다. 골격 위에 심근세포와 같은 2차 세포 유형의 현탁액을 즉시 한 방울 떨어뜨려 세포가 전체 질내 공간에 침투할 수 있도록 합니다. 그 후, 이 골격을 인큐베이터에서 30분에서 2시간 동안 배양하여 세포가 개별 극세사에 부착되도록 합니다.

PBS로 골격을 부드럽게 세척하여 부착되지 않는 세포를 제거합니다. 원하는 혈관 조직이 형성될 때까지 이 골격을 적절한 배지에서 배양합니다. 여기에 설명된 미세유체 바이오프린팅은 저점도 바이오잉크를 사용하여 미세섬유 스캐폴드의 직접 바이오프린팅을 가능하게 합니다.

크기가 6 x 6 x 6제곱밀리미터<30개 이상의 마이크로파이버를 포함하는 골격은 10분 이내에 바이오프린팅될 수 있습니다. 골격 현미경 사진의 상단 및 측면도는 바이오프린팅 과정에서 우수한 구조적 무결성을 보여줍니다. 알긴산 성분과 염화칼슘의 즉각적인 이온 가교로 달성됩니다.

바이오잉크의 미세유체 압출, 이온 가교 및 광 가교 후 HUVEC은 상대적으로 높은 생존력을 유지했습니다. 세포는 증식하여 0일차에 초기에 무작위 분포에서 16일차에 미세섬유의 주변부로 이동했습니다. 골격에 씨를 뿌린 신생아 쥐 심근세포가 성숙하여 골격에 자리를 잡았습니다.

그들은 기능적 심장 바이오마커의 강력한 발현을 보여주었습니다. 예를 들어 sarcomeric alpha actinin 및 connexin 43. 심근세포로 채워진 바이오프린팅 미세섬유질 골격의 컨포칼 현미경 검사는 HUVEC과 심근세포가 공존하는 것을 보여주었습니다.

HUVEC은 주로 미섬유의 경계에 존재하는 반면, 심근세포는 미세섬유의 외부를 둘러싸고 있습니다. 세포는 최대 9일에서 28일 동안 자발적이고 동기화된 박동을 유지할 수 있었습니다. 세포 소스와 골격의 구성에 따라 다릅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미세유체 바이오프린팅 기술을 사용하여 혈관 조직을 생산하는 방법과 프린트 헤드 제작 및 바이오프린터 작업을 잘 이해하게 될 것입니다. 프린트 헤드의 제작과 바이오프린터의 작동은 이전에 사용해 본 적이 없는 사람들에게는 까다로울 수 있으므로 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 바이오프린팅을 시작하기 전에 프린트 헤드에서 두 개의 바늘을 동심원으로 만들고 흐름이 안정화되도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술의 개발로 조직 공학 및 생체 가공 분야의 연구자들은 이제 생체 내 재생 목적 또는 체외 조직 모델링을 위해 혈관화된 조직 구조를 생성할 수 있는 또 다른 도구를 갖게 되었습니다.