Name: 세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 배우세요 자동화된 로봇 분배 기법을 활용한 세포 표면지도 작성 및 바이오프린팅 방법입니다. 이 기술은 정밀한 세포 전달과 표면 지형 유도를 통해 세포 행동을 제어하며, 생물의학 공학 연구에 효율적인 패턴 인쇄를 제공합니다.

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여기에 제시된 연구는 싱가포르 국립 연구 재단(Singapore National Research Foundation)의 CREATE 프로그램(NRF-Technion): 심장 복원 치료 연구 프로그램의 재생 의학 이니셔티브(Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program)와 과학기술연구청(A*STAR) 산하 과학공학연구위원회(SERC)의 공공 부문 기금(PSF) 2012의 지원을 받았습니다.

주 :이 프로토콜은 표면 에칭 (도 1b) 및 압출 기반 bioprinter (도 1C) 10 배압 이용한 로봇 분배 시스템 (도 1A)의 사용을 설명한다. 폴리스티렌 표면의 1. 수정 <ol><li> 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 에칭 인쇄 모두의 높이 일관성을 망치고, 중앙 위쪽 활 경향 때문에 1mm 폴리스티렌 시트를 사용한다. 주 : 폴리스티렌 시트 세포 부착을 위해 변형되지 않은 때, 플라즈마 처리가 수행된다. </li><li> 산소 플라즈마 처리. <ol><li> 우선, 플라즈마 시스템에 연결된 산소 실린더 레귤레이터 2 바의 압력을 선택한다. 그런 다음 컴퓨터의 제어판에 다음 조건에 입력 플라즈마 시스템을 전환 : 150 W, 산소의 30 sscm, 10 분 (전력, 가스 흐름과 시간을 각각 참조). </li><li> 폴리스티렌 substrat 배치플라즈마 챔버에 전자 문을 밀봉 제어판의 시작 버튼을 누릅니다. 소 태아 혈청에서 산소 플라즈마 처리 폴리스티렌 기판을 담가 3 회 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)를 세척하기 전에 2 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li></ol></li></ol> 2. 프로그램의 인쇄 패턴 <ol><li> 스타일러스 또는 메스로 먼저 에칭에 표면을 프로그램을 사용합니다. <ol><li> 스타일러스를 사용하는 경우가 쐐기 및 고정 될 때까지, 분배 주사기 (중 5 또는 10 ㎖)의 노즐에 (큰 관심과 함께 내부에서) 1.5 mm 직경의 섬유 바늘을 삽입합니다. 이 인쇄 아암의 클램프기구에 고정 될 수 있도록 메스를 사용하는 경우, 라운드 처리 메스를 선택한다. 주 : 스타일러스가 더 메스 블레이드보다 곡선 패턴을 에칭. </li><li> 먼저 bioprinted 배열을 만들려고 할 때, XY 좌표를 생성하기 위해 번호를 축으로 그래프 용지에 원하는 패턴을 스케치합니다. 그럼 내가스프레드 시트 소프트웨어 (그림 2)에 에칭 / bioprinted 패턴의 좌표 nput. 참고 : &quot;원하는 패턴&quot;선형, S 자형, 또는 원형 등의 다양한 모양이 될 수 있습니다. 여기에 설명 된대로 선택은 심근에 중간 엽 줄기 세포의 분화에 대한 평행 직선 라인으로 필요한 실험 모델에 따라 달라집니다. 캐터 그래프 기능이 제안 플롯 패턴의 시각화를 허용한다. </li><li> 인쇄 / 분배 소프트웨어를 엽니 다. &quot;&gt; 프로그램을 프로그램 추가&quot;를 선택하여 프로그램을 설정하는 &quot;포인트를 추가, 편집&gt;&quot;다음을. X를 보냅니다 y는 함수를 사용하여 소프트웨어 분배 / 인쇄에 스프레드 시트에서 얻은 좌표 값을 &quot;복사 및 붙여 넣기&quot;. </li><li> 표면 상으로 스타일러스 / 잉크 노즐을 배치하기 위해 각각 실행하기 전에 로봇의 &quot;Z&quot;의 높이를 보정. <ol><li> 인쇄 / 분배 소프트웨어에서의 &quot;로봇&quot;옵션을 선택 변경 모드 및 &quot;클릭# 34; 그리고 &quot;교육 모드&quot;옵션을 활성화합니다. 일단 선택되면, 소프트웨어는 로봇의 &quot;조그&quot;기능을 가능하게한다. </li><li> 조그하려면 먼저 메뉴 표시 줄에서 다음 명령을 선택하여 기본 위치로 로봇을 초기화; &quot;로봇&gt; 메카 초기화는&quot;다음 &quot;로봇&gt; 조그&quot;를 선택합니다. 입력 패턴의 기원에 정확하게 스타일러스를 배치하는 데 필요한 &quot;X 및 Y 슬롯&quot;의 (mm 단위) 수치. </li><li> 다음으로, &quot;Z 슬롯&quot;의 입력 (mm 단위) 수치는 표면과 접촉 스타일러스 또는 프린팅 노즐을 배치하지만 굴곡하지 않거나 표면 덴트. 이 점은 &quot;Z&quot;시작 값으로 지정됩니다. 주 : 각 홈의 깊이는 시스템의 Z 높이를 이용하여 용이하게 변경 될 수있다. 40, 80 및 170 ㎛ 인 홈은 1 mm 두께의 폴리스티렌 시이트 (도 4 및 표 1)의 표면으로 절단하는 것으로 입증된다. </li></ol></li><li> 상기 p-을 선택좌표 점의 각각에 대한 RINT 명령, 즉, &quot;선 분배의 시작&quot;은을 종료 로봇에 신호를 &quot;선 분배의 끝을&quot;중간 점을 지정하고 &quot;전달 라인&quot;첫 번째 점과 인쇄 개시를 정의 인쇄 실행. </li><li> 상단 메뉴 표시 줄에서 다음과 명령을 선택하여 로봇에 프로그램을 통신 : &quot;로봇&gt; C &amp; T 데이터를 보내기&quot;. </li><li> &quot;실행&quot;모드로 로봇을 변경하여, 에칭 / 인쇄 실행을 시작합니다. 상단 메뉴 표시 줄에서 &quot;&gt; 실행 모드 스위치 모드 변경&gt; 로봇&quot;을 선택하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 로봇 디스펜서 콘솔에서 녹색 &quot;시작 버튼&quot;을 눌러 인쇄 절차를 시작합니다. </li></ol></li></ol> 3. 준비 및 인쇄 세포 함유 젤라틴 Bioink을 <ol><li> 최소 필수 중간 알파 중간 (αMEM)에서 2 % 젤라틴을 용해 (10 % FBS와 2 %의 항생제 / antimycot 보충2 시간 동안 60 ° C에서 IC)는 bioink 용액을 제조 하였다. </li><li> 예비 배양 αMEM / 10 % FBS를 사용하여 10cm의 조직 배양 접시에 70 % 합류하는 중간 엽 줄기 세포를 발현하는 적색 형광 단백질 (RFP-MSC들). 37 ° C에서 5 분 동안 1X 트립신 EDTA 용액으로 중간 피막을 제거하여 서스펜션에 부착 된 세포를 분리. </li><li> 5 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 1X PBS 0.5 ㎖ 중의 세포 펠렛을 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포 밀도를 계산. </li><li> bioink 상온으로 식힌 후, 부드럽게 5 × 6 셀 ML -1의 최종 농도를 달성하기에 bioink RFP-엽 줄기 세포의 현탁액에 충분한 양으로 혼합한다. </li><li> 밀봉 노즐 프린팅 주사기로 세포 베어링 bioink 붓는다. 인쇄 가능한 점도를 달성하기 위해 4 ° C에로드 된 주사기를 진정. </li><li> 자동화 된에로드 된 주사기를 놓습니다로봇 분배 시스템의 공압 라인을 연결하고. 주사기 루어 봉인을 제거하고 인쇄 노즐을 부착합니다. </li><li> 5mm에서 0.05 MPa의 배압을 사용하여 얇은 라인으로 cellularized bioinks 돌출 / 27 G 바늘 / 노즐을 통하여 10 ㎖ 주사기로부터 초 쓰기 속도가 미리 프로그램 증착 다음, 폴리스티렌 필름 표면 상 (원주 위에 추천 테이퍼) 2.1 단계에 설명 된 패턴은 사전 식각 홈 상에 cellularized bioink을 배치합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 배양 후, 도립 형광 현미경을 이용하여 시청하기 전에 24 시간 (세포가 감지 에칭 특성에 반응 할 수 있도록)에 전지 (10 % FBS 및 항생 물질로 보충) 10 ml의 성장 배지를 추가 부화 10 배 배율에서. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 과정의 중요한 단계는 프로세스가 기능에 세포 침전을 허용 출혈 / bioink 확산없이 인쇄 전단 응력 세포 사멸없이 세포를 제공하고 불필요한 리니지쪽으로 분화를 유발하지 않아야 같이 줄기 세포의 실제 bioprinting 전달된다. 예상 된 셀의 정렬이 발생하지 않으면, bioink 점도는 인쇄의 적합성을 평가한다. bioink는 세포 패턴 중합체 표면에 침전 할 수 있다는 것이 중요하다. bioink 중합체의 농도는 감소 될 수 있거나 그것의 온도는 점도를 감소시키고 셀의 침강을 촉진하는 (37 ° C에서 최대까지) 증가 하였다. 그러나 이러한 감소는 / 블리드 후 인쇄를 확산하기 위해 bioink의 원인이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 2 % 젤라틴 1X PBS에 용해 (V / w)을 사용하는 것이 좋습니다. 세포 농도가 인쇄 후 작게 나타나는 경우 인쇄에 의한 전단 응력을 위태롭게 할 수있다인쇄 된 세포 (7)의 생존. 이전과 같은 레사 주린...

셀 배치의 고의적 인 패턴은 생체 내 세포 조직 1 모방 문화의 형성을 가능하게한다. 사실, 여러 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 연구는 공간 배치 2,3를 구성하여 도움을받을 수 있습니다. 대부분 패터닝 시스템은 촉진 또는 후속 수동 셀 증착하여 세포 부착을 방지하기위한 표면 개질 방법에 의존한다. Bioprinting 세포 분포 하나 이상의 공간 및 시간 제어를 제공합니다. 이러한 기능 이외에도 bioprinting 기하학적 복합체 지지체 (4)를 생성하기위한 기술적으로 간단 신속하고 비용 효과적인 방법 인 것으로 설명되었다. 그것은 컴퓨터 디자인 소프트웨어를 이용하고, 제조 공정 4에 셀의 도입을 허용한다. Bioprinting 시스템의 기반이 레이저로 자신의 작업 원칙을 기준으로 분류 된, 잉크젯 기반 또는 4 압출 기반. 그것은 실제 시간 프레임 내에서 임상 적 4-6 크기의 조직 구조의 제작을 허용하기 때문에 압출 bioprinting가 가장 유망한 것으로 설명되었다. 이것은 셀 베어링 하이드로 bioink 기계적 또는 배압 이용한 압출 하나에 의해 수행된다. 여기에서 제시된 방법에서는, 배압을 채용 하였다. 언급 한 바와 같이, 세포를 cytocompatible bioink에 전달된다. 이러한 bioink는 유해한 전단 응력을 생성하지 않고 세포의 전달을 지원하고, 붕괴 또는 7-10 ( &quot;잉크 블리드」라 함)의 확산없이 인쇄 된 트레이스의 무결성을 유지하기에 충분한 점성이어야한다. 그들의 접착면과 세포의 상호 작용은 세포 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 표면 토포 그래피는 셀 형상, 방향 (11), 그리고 심지어 표현형을 제어 할 수있다. 특히, 그루브 및 채널의 제조를 유도하는 것으로 입증되었다여러 세포 유형에 뻗어, 가늘고 긴 형태. 이 형태의 도입이 능성과 능성 세포의 표현형에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 홈에 정렬 될 때, 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 통해 합성 10,14-17 수축 표현형을 채택 심근 12,13 및 혈관 평활근 세포쪽으로 분화의 증거를 보여준다. 채널 또는 홈을 정렬 셀은 예를 깊은 반응성 이온 에칭, 전자빔 리소그래피, 직접 레이저 인쇄, 펨토초 레이저, 포토 리소그래피 및 플라즈마 건식 에칭 (18), 다수의 방법을 통하여 폴리머 표면에 생성 될 수있다. 이러한 접근은 종종 시간 소모 복잡한 장치를 필요로 생성 된 패턴의 형상에 한정 될 수있다. 또한, 그들은 bioprinting와 패턴을 동기화하지 않고 즉시 cellularization을 허용하지 않습니다. 자동화의 배위 제어 이동분배 시스템은 솔루션의 증착을 위해 복잡한 패턴을 따를 수 있습니다. 여기서 우리는 마이크로 제어 이동이 셀 방향에 대한 채널을 만드는 데 이용 될 수있는 방법을 보여줍니다. 날카롭게 스타일러스 또는 메스 압출 주사기 대신에 상기 프린트 헤드에 부착되고, 장치는 묘화 소프트웨어의지도하에 중합체 표면을 에칭 할 수있다. 상기 방법은 패턴 디자인에 융통성을 제공하며 일반적으로 폴리스티렌, PTFE, 폴리 카프로 락톤과 같은 생체 공학에 사용되는 고분자 재료에 적용 가능하다. 에칭에 후속 단계로, 세포를 긁어 홈에 직접 bioprinted 수있다. 여기에 사용 된 젤라틴 bioink는 추적을 유지하고 침착 세포가 에칭 기능을 감지 할 수 있도록 모두 할 수 있었다. 에칭 홈에 bioprinted 중간 엽 줄기 세포는 별개의 라인에서 그들을 따라 연장하는 것으로 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic 디스펜싱 시스템</td><td>Janome</td><td>2300N</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 기계</td><td>Femto Science</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>USB 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프레드시트</td><td>Excel</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>인쇄 좌표 소프트웨어</td><td>Janome</td><td>JR C-Points</td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>NIH(National Institutes of Health)</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stylus (Blade)</td><td>OLFA</td><td>AK-5</td><td></td></tr><tr><td>5ml 인쇄 주사기</td><td>San-ei Tech</td><td>SH10LL-B</td><td></td></tr><tr><td>30G 인쇄 바늘</td><td>San-ei Tech</td><td>SH30-0.25-B</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 폴리스티렌 시트</td><td></td><td>현지</td><td></td>에서 구매</tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10270-098</td><td></td></tr> 돼지 껍질에서 추출한 <tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>인vitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>젤라틴, 겔 강도 300, A형</td><td>시그마 알드리치</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>&알파; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>적색 형광 단백질 중간엽 줄기 세포(RFP-MSC)</td><td>Cyagen Biosciences Incorporation</td><td>RASMX-01201</td><td></td></tr></tbody></table>

세포의 표면지도 및 bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

이 원고는 자동 로봇 분배 시스템을 이용하여 하이드로 겔 bioink 이러한 기능으로 세포의 직접적인 전달 하였다 셀 가이드 기능의 도입을 설명한다. 이 세포는쪽으로 침전 및 기능을 감지 할 수 있습니다로 특정 bioink가 선정되었다. 분배 시스템은 보조 배압의 프린트 헤드를 사용하여 하이드로 겔 bioinks 생세포를 bioprints. 그러나, 날카롭게 스타일러스 또는 메스 프린트 헤드를 교체하여, 분배 시스템은 또한 표면 식각 지형 신호를 생성하기 위해 사용될 수있다. 스타일러스의 이동은 X, Y 10 μm의 단계 및 Z 방향으로 프로그램 될 수있다. 패터닝 홈은 홈 &#39;방향과 정렬 긴 형태를 채택하도록 영향을, 중간 엽 줄기 세포를 배향 할 수 있었다. 패터닝은 직선, 동심원 및 정현파에 플로팅 소프트웨어를 사용하여 설계 될 수있다. 후속 절차, 석면에모세포 및 중간 엽 줄기 세포는 배압 구동 압출 헤드에 bioprinting 들면 2 % 젤라틴 bioink 현탁시켰다. 셀 베어링 bioink이어서, 에칭에 사용 된 것과 같은 프로그램 된 좌표를 사용하여 인쇄 하였다. bioprinted 셀 감지 에칭 홈의 방향을 따라 그 긴 방향으로 입증 된 바와 같이 에칭 된 기능에 대응할 수 있었다.

대표적인 결과는 배압 보조 로봇 디스펜스 시스템은 표면 에칭 bioink 인쇄 (도 1 A) 모두를 행하는 압출 bioprinter 기초로 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 중합체 표면에 에칭 된 홈의 생성에 사용될 수 있으며, 후속하는 기능 (도 1 B 및 C)에 직접 베어링 셀 bioink를 인쇄. 에칭 및 인쇄 모두 곡선 응용 프로그램 (그림 3 AC)에 필요한 방사형 패턴, 프로그래밍 된 좌표로 선형의 인쇄를 가능하게하는 인쇄 / 분배 소프트웨어에 (그림 2) 입력을 결정한다. Z 축 설정 에칭 홈 깊이의 조절 (도 4 및 표 1)을 허용. <p class="jo...

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

이 자동화된 로봇 분주 기술의 전반적인 목표는 지형적 세포 유도를 위한 표면을 생성하고, 프로그램된 패턴에 따라 이러한 구조물에 세포를 전달함으로써 세포의 행동과 분포를 제어하는 것입니다. 이 방법은 단일 배양 및 공동 배양 모두에서 표면 지형이 세포 행동에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 생의학 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 확립된 방법들과 비교하여 세포 유도 패턴을 프로그래밍하고 프린팅하는 데 소요되는 시간이 더 적다는 점입니다.또한 이 방법에는 정밀한 분사를 위한 세포 전달 단계가 포함되어 있습니다. 저희는 하이드로젤 내에 증착된 세포의 2D 패턴이 표면 유도(surface guidance)를 통해 이점을 얻을 수 있다는 점을 깨달았을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 이에 따라 표면 특징에 부합하는 방식으로 하이드로젤을 프린팅하는 기술을 개발하였습니다.본 프로토콜에서는 배압 보조 로봇 분주 시스템을 표면 식각 및 압출 기반 바이오프린터로 사용하는 방법을 설명합니다. 식각 및 프린팅을 위한 폴리스티렌 표면을 준비하려면 두께가 1 mm인 폴리스티렌 시트를 선택하십시오. 시트가 더 두꺼우면 휘어짐 현상이 더 심해집니다.그런 다음, 시트를 산소 플라즈마로 처리합니다. 산소 가스 조절기를 2 bar로 설정하십시오. 이어서 플라즈마 장비를 켜고 진공 펌프를 작동시킵니다.기기를 150 W 및 산소 가스 유량 30 standard cubic centimeters per minute로 설정하고, 시트를 이 조건에 10분 동안 노출시키십시오. 그다음, 챔버 내부를 진공 상태로 만들고 문을 밀폐한 후 사이클을 시작하십시오. 이어서, 처리된 시트를 순수 소태아혈청(fetal bovine serum)에 담근 후 37 °C에서 2시간 동안 교반하며 배양하십시오.혈청 처리 후, 시트를 1X PBS로 3회 세척하고 멸균합니다. 마지막 세척 후, 시트를 37 °C 오븐에 넣고 약 12시간 동안 하룻밤 동안 건조합니다. 먼저 식각을 위한 프린팅 스타일러스를 준비합니다.1.5 millimeter 직경의 직물 바늘을 디스펜싱 시린지 노즐에 바늘이 꽉 끼어 고정될 때까지 조심스럽게 삽입하십시오. 바이오프린팅 배열을 처음으로 생성할 때는, x, y 좌표를 생성하기 위해 숫자가 표시된 축이 있는 모눈종이에 원하는 패턴을 스케치하십시오. 그 다음, 해당 패턴의 좌표를 스프레드시트에 입력하십시오.다음으로, 프린팅 소프트웨어에서 Program, Add Program을 선택한 후 Edit, Add Point를 선택하여 프로그램을 설정합니다. 그런 다음, 스프레드시트의 x 및 y 좌표 값을 프린트 디스펜싱 소프트웨어로 복사합니다. 각 실행 전에는 로봇의 z 높이를 교정하여 스타일러스 접촉 위치를 설정하십시오.먼저 Robot 옵션을 선택하십시오. 그런 다음 Changing Mode를 클릭하고 Teaching Mode 옵션을 활성화하십시오. 이렇게 하면 로봇의 JOG 기능이 활성화됩니다.로봇을 JOG하려면, 먼저 Robot, Meca Initialize를 선택하여 로봇을 기본 위치로 설정하십시오. 그다음 Robot, JOG를 선택하십시오. 이어서 x와 y 슬롯에 스타일러스를 패턴의 원점에 정확히 배치하는 데 필요한 거리를 밀리미터(mm) 단위로 입력하십시오.그다음, 표면을 굽히거나 누르지 않고 스타일러스 또는 노즐이 표면에 접촉하도록 z 슬롯에 밀리미터 단위의 수치를 입력하십시오. 이것이 z의 시작 값으로 지정됩니다. 각 홈의 깊이는 z 높이를 사용하여 조절할 수 있습니다.예를 들어, 절삭 홈의 깊이는 40, 80 또는 170 µm일 수 있습니다. 스타일러스의 휨이나 표면의 눈에 띄는 자국이 없는 접촉점을 찾기 위해서는 집중력과 세심한 관찰이 필요합니다. 성공적인 수행을 위해, 여러 장의 시트를 준비하고 다양한 z 높이에서 프로그램을 실행하여 최적의 시작 위치를 찾을 것을 권장합니다.다음 단계는 각 좌표점에 대한 프린팅 지침을 정의하는 것입니다. 첫 번째 지점과 프린팅 시작을 정의하려면 Start of Line Dispense를 사용하십시오. 중간 지점들을 지정하려면 Line Passing을 사용하고, 마지막으로 로봇에게 프린팅 실행을 종료하도록 신호를 보내려면 End of Line Dispense를 사용하십시오.프로그램을 로봇에 전송하려면 Robot, Send C&T Data를 선택하십시오. 그다음 Robot, Changing Mode, Switch Run Mode를 선택하고 설정을 Run으로 전환하여 실행을 시작하십시오. 마지막으로 프린팅을 시작합니다.바이오잉크를 제조하려면 10% FBS와 2% 항생제-항진균제(antibiotic antimycotic)가 첨가된 Alpha MEM에 2% 젤라틴을 녹입니다. 젤라틴이 배지에 완전히 용해될 수 있도록 배지를 60 °C에서 2시간 동안 유지합니다. 바이오잉크에 사용할 세포를 10 cm 디쉬에서 70% 합류도(confluence)가 될 때까지 배양합니다.표면 유도 특성에 반응하는 모든 세포를 사용할 수 있으며, 임베딩 과정 중에 관찰할 수 있도록 형광 표지가 발현되어야 합니다. 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척한 후, 37 °C에서 5분 동안 1X Trypsin-EDTA 용액으로 세포를 처리하여 부착된 세포를 현탁액으로 분리합니다. 배지를 이용해 Trypsin을 중화시킨 후, 세포를 현탁액으로 수집하고 1,000 g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다.상층액을 제거하고 0.5 milliliters의 배지에서 세포를 재부유시킵니다. 세포 밀도를 측정한 후, 부유액을 냉각된 바이오잉크 용액에 혼합하여 mm³당 500만 개의 세포가 포함된 용액을 만듭니다. 그런 다음, 세포가 포함된 바이오잉크를 루어 캡으로 막아둔 준비된 프린팅 시린지에 붓습니다.출력 가능한 점도를 얻기 위해 충전된 시린지를 4°C에서 냉각하십시오. 그 다음, 냉각된 시린지를 꺼내 캡을 제거하고 프린팅 노즐을 장착하십시오. 이어서 충전된 시린지를 디스펜싱 시스템에 장착하고 공기압 라인에 연결하십시오.사전에 설계된 패턴 위에 바이오잉크를 출력하기 위해서는 가장자리와 선이 뚜렷해야 합니다. 정밀한 출력은 디스펜서의 배압과 출력 노즐의 바늘 게이지를 최적화함으로써 달성할 수 있습니다. 34-gauge 테이퍼형 바늘이 장착된 10 milliliter 시린지의 경우, 디스펜서의 배압을 0.05 megapascals로 설정하십시오.그 다음, 소프트웨어에서 쓰기 속도를 polystyrene 필름 표면에 대해 초당 5mm로 설정합니다. 이제 프로그래밍된 패턴에 따라 세포가 포함된 바이오잉크를 미리 식각된 홈 위에 적층합니다. 세포를 적층한 후, 시트를 실온에서 20분 동안 배양합니다.그 후, 프린팅된 세포 스캐폴딩을 적절한 성장 배지로 덮고 24시간 동안 배양하여 추가 실험 전 세포가 부착되도록 합니다. 바이오잉크 내에 바이오프린팅으로 파종된 줄기세포는 결국 표면으로 침강하여 미세하게 식각된 선의 방향을 감지하고 그 방향을 따라 신장되었습니다. 바이오프린팅 없이 배양액에서 파종된 세포들 또한 구조물의 방향에 맞춰 정렬되었습니다.하지만, 이들은 표면 전체를 덮었으며, 이에 따라 바이오잉크가 세포를 프린팅된 경로 내에 구속시켰습니다. 식각된 패턴이 없는 시트에 세포를 파종했을 때는 세포의 방향성이나 정렬이 나타나지 않았습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 폴리스티렌 시트에 홈을 정밀하게 식각하고 해당 홈에 세포를 정밀하게 바이오프린팅하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술을 숙달하면 약 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이는 세포의 이방성과 배치가 필요한 모델에서 세포 표면 상호작용을 노출시키고자 하는 바이오공학 분야 연구자들에게 매우 유용합니다. 바이오잉크에 살아있는 세포가 포함되어 있으므로, 시트를 프린팅할 때 멸균 기술을 사용하는 것이 매우 중요하다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 3D 미세유체 프린팅 기술은 수중 표면에 세포 배열을 인쇄합니다.  우리는 세포 배열이 3D 플로우 셀에서 수중 표면에 미세유체적으로 전달되는 방법을 설명합니다.  물에 잠긴 표면에 인쇄함으로써, 다양한 분야에서 약물 스크리닝 및 세포 독성 평가를 허용하는 세포 마이크로어레이가 생성되었습니다.

연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

수성 2상 시스템을 사용하여 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 암세포 스페로이드를 로봇 프린팅하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

여기서는 3 축 분배 시스템으로 자동화 직접 기입 순서에 의해 생성 된 자유 - 부유 마이크론 / 서브 마이크론 스케일 고분자 섬유와 "웹 형상"구조를 제조하는 프로토콜을 제시한다.

일시 중단 된 마이크론 / 서브 마이크론 스케일 섬유 구조의 3 차원 직접 쓰기는 로봇 디스펜스 시스템을 통해 처방

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

이 프로토콜은 생체 재료를 사용하지 않고 심장 ​​조직의 3D bioprinting을 설명합니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

이 프로토콜은 표준 형광 현미경 상에서 그들의 산소화 및 세포 사멸에 대한 다중 파라메트릭 분석을 사용하여 바이오프린팅을 위한 고처리량 스페로이드 생성을 기술한다. 이러한 접근법은 구상체 생존력을 제어하고 표준화를 수행하기 위해 적용될 수 있으며, 이는 3D 조직, 종양 미세환경 및 성공적인 (마이크로)조직 생물제작을 모델링하는데 중요하다.

다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조

여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

수용성 기저막 추출물은 암 연구에서 가장 널리 사용되는 생물학적 매트릭스이지만, 복잡한 유변학적 거동으로 인해 상업적으로 이용 가능한 바이오프린팅 시스템으로는 바이오프린팅이 어렵습니다. 이 작업은 단일 및 다중 레이어 모두에서 우수한 형상 충실도를 가진 순수한 매트릭스 구조를 생산하기 위한 맞춤형 바이오프린팅 전략을 제시합니다.

Design and Validation of a Volumetric-extrusion Bioprinter for Bioprinting of Soluble Basement Membrane Extract for Translational Research

배우세요 자동화된 로봇 분배 기법을 활용한 세포 표면지도 작성 및 바이오프린팅 방법입니다. 이 기술은 정밀한 세포 전달과 표면 지형 유도를 통해 세포 행동을 제어하며, 생물의학 공학 연구에 효율적인 패턴 인쇄를 제공합니다.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

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