세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

이 자동화된 로봇 디스펜싱 기술의 전반적인 목표는 지형적 세포 안내를 위한 표면을 만든 다음 프로그래밍된 패턴에 따라 이러한 기능에 셀을 전달하여 세포 거동 및 분포를 제어할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 표면 토폴로지가 단일 배양 및 공동 배양 모두에서 세포 행동에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지와 같은 생물 의학 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 보다 확립된 방법에 비해 셀 안내 패턴을 프로그래밍하고 인쇄하는 데 시간이 덜 소요된다는 것입니다.

또한 제어된 디스펜싱을 위한 세포 전달 단계도 포함되어 있습니다. 우리는 하이드로겔에 증착된 세포의 2D 패턴이 표면 유도의 이점을 얻을 수 있다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 따라서 우리는 표면 특징과 일치하는 방식으로 하이드로겔을 인쇄하기 위해 이 기술을 개발했습니다.

이 프로토콜은 배압 보조 로봇 디스펜싱 시스템을 표면 에칭 및 압출 기반 바이오프린터로 사용하는 것을 설명합니다. 에칭 및 인쇄를 위해 폴리스티렌 표면을 준비하려면 1mm 두께의 폴리스티렌 시트를 선택하십시오. 두꺼운 시트는 더 많이 휘어집니다.

그런 다음 시트를 산소 플라즈마로 처리하십시오. 산소 가스 조절기를 두 개의 막대로 설정합니다. 그런 다음 플라즈마 기계를 켜고 진공 펌프를 켭니다.

분당 150와트 및 분당 30 표준 입방 센티미터의 산소 가스 흐름에 대해 기계를 프로그래밍하고 시트를 10분 동안 이러한 조건에 노출시킵니다. 그런 다음 챔버에서 대피하고 문을 밀봉하고 사이클을 시작하십시오. 다음으로, 처리된 시트를 순수한 소 태아 혈청에 담그고 교반과 함께 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

세럼 트리트먼트 후 1X PBS로 시트를 3회 세척하고 시트를 살균합니다. 최종 세척 후 시트를 섭씨 37도의 오븐에 넣어 약 12시간 동안 밤새 건조시킵니다. 먼저 에칭을 위한 인쇄 스타일러스를 준비합니다.

1.5mm 직경의 섬유 바늘을 디스펜싱 주사기의 노즐에 쐐기로 고정될 때까지 매우 조심스럽게 삽입합니다. 처음 바이오프린팅 배열을 만들려고 할 때 번호가 매겨진 축으로 그래프 용지에 원하는 패턴을 스케치하여 x, y 좌표를 생성합니다. 그런 다음 패턴의 좌표를 스프레드시트에 입력합니다.

그런 다음 인쇄 소프트웨어에서 프로그램, 프로그램 추가, 편집, 포인트 추가를 차례로 선택하여 프로그램을 설정합니다. 그런 다음 스프레드시트의 x 및 y 좌표 값을 인쇄 디스펜싱 소프트웨어로 복사합니다. 각 실행 전에 로봇의 z 높이를 보정하여 스타일러스 접촉 위치를 설정하십시오.

먼저 로봇 옵션을 선택합니다. 그런 다음 모드 변경을 클릭하고 티칭 모드 옵션을 활성화합니다. 이를 통해 로봇의 JOG 기능을 사용할 수 있습니다.

로봇을 JOG하려면 먼저 Robot, Meca Initialize를 선택하여 로봇을 기본 위치에 놓습니다. 그런 다음 로봇, JOG입니다. 다음으로, x 및 y 슬롯에서 스타일러스를 패턴의 원점에 정확히 배치하는 데 필요한 거리(mm)를 입력합니다.

그런 다음 밀리미터 단위로 z 슬롯에 숫자 값을 입력하여 표면을 구부리거나 움푹 들이지 않고 스타일러스 또는 노즐을 표면과 접촉하도록 배치합니다. 이 값은 z의 시작 값으로 지정됩니다. 각 그루브의 깊이는 z 높이를 사용하여 변경할 수 있습니다.

예를 들어, 절단 홈의 깊이는 40, 80 또는 170미크론일 수 있습니다. 스타일러스가 구부러지거나 표면에 눈에 띄는 움푹 들어간 곳이 없도록 접촉 지점을 찾기 위해서는 집중력과 면밀한 관찰이 필요합니다. 성공을 보장하려면 여러 시트를 준비하고 다른 z 높이에서 프로그램을 실행하여 이상적인 시작 위치를 찾는 것이 좋습니다.

다음 단계는 각 좌표 점에 대한 인쇄 명령을 정의하는 것입니다. Start of Line Dispense를 사용하여 첫 번째 점을 정의하고 시작을 인쇄합니다. Line Passing을 사용하여 중간 지점을 지정하고, 마지막으로 End of Line Dispense를 사용하여 로봇에 인쇄 실행을 종료하라는 신호를 보냅니다.

프로그램을 로봇과 통신하려면 로봇, C&T 데이터 보내기를 선택합니다. 그런 다음 로봇, 모드 변경, 실행 모드 전환을 선택하고 설정을 실행으로 전환하여 실행을 시작합니다. 마지막으로 인쇄를 시작합니다.

바이오잉크를 만들려면 10%FBS와 2%의 항생제 항진균제가 보충된 알파 MEM에 2%젤라틴을 용해합니다. 젤라틴이 배지에 용해되도록 배지를 섭씨 60도에서 2시간 동안 놓습니다. 10cm 접시에서 바이오잉크를 70% 합류하도록 세포를 배양합니다.

표면 안내 기능에 반응하는 모든 세포를 사용할 수 있으며 embedding 프로세스 중에 볼 수 있도록 형광 라벨을 발현해야 합니다. 배지를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 1X 트립신-EDTA 용액으로 세포를 코팅하여 부착된 세포를 현탁액으로 방출합니다. 매체를 가진 Trypsin를 중립화하기 후에, 현탁액에 있는 세포를 모으고 1, 5 분 동안 000 g's에 그(것)들을 펠릿으로 만드십시오.

상등액을 설명하고 0.5 밀리리터의 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포 밀도를 측정한 후 현탁액을 냉각된 바이오잉크 용액에 혼합하여 밀리미터당 500만 개의 세포가 있는 용액을 만듭니다. 그런 다음 세포가 함유된 바이오잉크를 루어 캡으로 막힌 준비된 인쇄 주사기에 붓습니다.

인쇄 가능한 점도를 얻기 위해 장전된 주사기를 섭씨 4도로 냉각합니다. 그런 다음 장전되고 냉각된 주사기를 꺼내 주사기 캡을 제거하고 인쇄 노즐을 부착합니다. 그런 다음 장전된 주사기를 디스펜싱 시스템에 부착하고 공기 압력 라인에 연결합니다.

미리 디자인된 패턴에 바이오잉크를 인쇄하려면 가장자리와 선이 뚜렷해야 합니다. 정확한 인쇄는 실제로 디스펜서와 인쇄 노즐의 바늘 게이지의 배압을 최적화하여 얻을 수 있습니다. 34게이지 테이퍼 바늘이 있는 10ml 주사기의 경우 디스펜서의 배압을 0.05메가파스칼로 설정합니다.

그런 다음 소프트웨어에서 폴리스티렌 필름 표면에 쓰기 속도를 초당 5mm로 설정합니다. 이제 프로그래밍된 패턴에 따라 셀룰룰라화된 바이오잉크를 미리 에칭된 홈에 증착합니다. 세포를 증착 한 후 시트를 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.

나중에 인쇄된 세포 스캐폴딩을 적절한 성장 배지에 덮고 추가 실험 전에 세포가 부착되도록 24시간 동안 세포를 배양합니다. 바이오잉크 내에서 바이오프린팅으로 파종된 줄기세포는 결국 표면으로 침전되어 눈에 띄지 않게 에칭된 선의 방향을 따라 감지되고 늘어났습니다. 바이오프린팅 없이 배양 배지에 파종된 세포도 특징 방향으로 정렬되었습니다.

그러나 그들은 또한 전체 표면을 덮었기 때문에 바이오잉크는 세포를 인쇄된 흔적으로 제한했습니다. 에칭된 특징이 없는 시트에 파종했을 때 세포는 방향이나 정렬을 나타내지 않았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 폴리스티렌 시트의 홈을 정밀하게 에칭한 다음 홈에 세포를 정밀하게 바이오프린팅하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 완전히 익히면 약 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 생명공학 분야의 연구자들이 세포 이방성 및 포지셔닝이 필요한 모델에서 세포 표면 상호 작용을 노출하는 것은 매우 유용합니다. 바이오잉크에는 살아있는 세포가 포함되어 있으며 시트를 인쇄할 때 멸균 기술을 사용하는 것이 매우 중요하다는 것을 잊지 마십시오.