Name: 애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 Arabidopsis에서 배아형성 패턴을 특성화하는 현미경 기법을 사용하여 식물 발달 생물학 연구를 수행하는 방법입니다. 이 프로토콜은 유전자 기능과 세포 정체성 규명에 필수적입니다.

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우리는 비판적으로 원고 읽기 위한 박사 제시카 Habashi 감사 합니다. 우리 DR5 GFP 분석 결과의 지역화를 수행 하기 위한 이미징 센터,의 생명 과학, 수도 사범 대학 (베이징, 중국), 대학 박사 Xianyong Sheng을 감사 합니다. 이 작품은 베이징 시 정부 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CIT &#38; TCD20150102) 국가 자연 과학 재단의 중국 (31600248)에서.

참고:이 프로토콜은 세 부분: 1) DIC 현미경;를 사용 하 여 야생-타입 애기 배아에서 패턴 형성 관찰 2) 특성화는 배아 패턴 형성을 통해 마커 단백질 표정 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법;를 사용 하 여 관찰 그리고 3) embryogenesis (예를 들어 naa10 돌연변이 사용)에서 특정 유전자의 역할을 결정.
1. 난 개간
<ol>
	<li>식물 소재 준비 참고: 여기에 설명 된 프로토콜; 건강 한 식물을 성장 하는 방법에 예입니다. 건강 한 식물을 성장 하는 다른 방법 또한 작동 합니다.<ol>
		<li>1.5 mL 튜브에 100 씨앗을 추가 하 고 소독 하 5 분 반전에 대 한 씨앗 튜브 여러 번 씨와 솔루션은 완전히 표면 씨앗 소독을 잘 혼합 되도록 1.5% 염소 (믹스 물 85 mL와 10% 염소의 15 mL)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>30에 대 한 원심 분리 하 여 튜브의 하단에 씨앗을 강제로 s 1200 x g에서 상쾌한, 제거 하 고 잔류 염소를 제거 하는 벤치에서 씨앗 살 균 물으로 4 번 세척.</li>
		<li>1 l의 초순 4.4 g Skoog (MS)와 村 重 기저 소금 혼합물의 고 자당의 10 g를 추가 합니다. 소금 및 자당 분해 혼합물을 저 어. 고 에이전트, Phytagel, 등의 3 세대 MS 자당 솔루션에 추가 1 m 코, pH 5.8에 솔루션을 조정 하 고 MS 매체를 15 분 동안 121 ° C에서 솔루션을 소독.</li>
		<li>MS 중간 접시를 생성 하는 12 cm 문화 요리에 MS 매체의 30 mL를 붓으십시오.</li>
		<li>MS 판에 소독된 씨앗을 놓습니다. 성장 챔버에 접시를 전송 하 고 씨앗 층 리 (어둠 속에서 4 ° C에서 3 일) 후 긴 하루 조건 (22 ° C 16 h는 빛과 어둠 속에서 8 h 동안 18 ° C)에서 접시를 유지.</li>
		<li>8 일 후의 성장, 식물 토양 (혼합 영양이 풍부한 토양 및 1:1 비율로 vermiculite) 쟁반에 전송 하 고 물 손실을 방지 하기 위해 5 일 흰색, 투명 한 뚜껑 트레이 커버 식물의 vitrification를 피하기 위해 간격을 두고.</li>
		<li>용지함에서 뚜껑 하 고 긴 하루 조건 (1.1.5 참조)에서 도보 약 실에 있는 식물을 육성. 오전 6 시 빛을 전환 하 고에서 오후 10 시. 대형 챔버에 성장의 약 20 일 후 식물은 꽃 있고 siliques 생산.</li>
		<li>씨앗의 위치에서 스레드가 있는 꽃 봉 오리는 꽃이 핌에서 오후 8 시 줄기 마크 (세 번째 꽃 봉 오리를 첫 번째 사용 하지 않는, 보통이 꽃 봉 오리에서 생성 된 siliques 몇 중단된 씨앗, 개발과이 비정상적인 ovules 정상의 비율을 변경할 수 있습니다). 표시 된 버드 오전 8 시 다음 날 아침 꽃 열 때로 난의 수 분의 시작을 정의 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoyer의 솔루션의 준비
	<ol>
		<li>50 mL 튜브에 chloral 하이드 레이트의 24 g을 추가 하 고 완전히 알루미늄 호 일 (chloral 하이드 레이트의 솔루션은 빛 아래에서 안정)와 함께 튜브 포장.</li>
		<li>다음, 위의 솔루션을 9 mL 초순 물과 글리세롤의 3 mL를 추가 하 고 해산 chloral 하이드 레이트 튜브를 흔들어. Hoyer의 솔루션으로 만들기 위해 모든 거품을 제거 하기 위해 실내 온도에 밤새 서 튜브를 하자.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>난 분리 및 정리
	<ol>
		<li>양면 접착 테이프의 조각을 현미경 유리 슬라이드에 연결 합니다. 원하는 수 분 (DAP) pseudoseptum; 표면에 수직으로 슬라이드에 후 일 수에 대 한 성장 하는 silique 배치 이것은 carpels (그림 1A 및 1B)를 쉽게 할 것 이다.</li>
		<li>주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 2 개의 해 부 carpels 슬라이드 연결 하는 silique에서 ovules (그림 1C 및 1d) stereoscope 아래 볼 수 있습니다.</li>
		<li>유리 슬라이드에 Hoyer의 솔루션의 70 µ L를 분배 하 고 파 버 Hoyer의 솔루션으로 뾰족한 핀셋의 쌍의 끝을 축. stereoscope를 사용 하 여 이동은 ovules Hoyer의 솔루션으로 슬라이드에 배아를 청소를 핀셋으로. 부드럽게 모든 거품을 생성 하지 않으려면 슬라이드는 coverslip을 적용 됩니다.</li>
		<li>둔다 2-12 h에 대 한 어두운 방에 상자에 완성 된 슬라이드를 (더 성숙 된 난, 더 많은 시간이 필요 하 게 됩니다) 실내 온도에. 2/4-셀 단계 (1-2 DAP)에서 배아 배아 octant 구형 초기 (3 DAP) 사이 4 h 후 관찰 될 수 있다 그러나 2 시간 후 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 더 성숙한 배아 (4-8 DAP) 12 h 후 관찰할 수 있습니다.</li>
		<li>현미경의 DIC 함수를 사용 하 여 지운된 ovules를 검사 합니다. 저전력 필드 (10 배)에서 배아를 찾아서 다음 개발 된 배아에서 세포 패턴을 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈)로 변경 합니다.</li>
		<li>다른 발달 단계에서 배아를 검사 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 배아 패턴화 및 마커 단백질 식의 관찰을 통해 셀 Id의 특성
<ol>
	<li>식물 재료의 준비
	<ol>
		<li>발기인 및 코딩 시퀀스 마커 유전자 또는 호르몬 응답 요소를 복제 하 고 형광 단백질 ( GFP); 같은 퓨즈 다음 구문이 삽입 (예: pCambia1300) 이진 벡터. 여기, auxin 응답 요소 DR5 예제10으로 제공 됩니다.</li>
		<li>Agrobacterium tumefaciens에 의해 야생 형 식물으로 결과 DR5 GFP 플라스 미드를 소개-변환11중재. T1 식물 hygromycin 포함 된 MS 중간 접시를 사용 하 여 선택 (50 mg/mL의 어머니 주류, 희석 1:1, 000). 유전자 변형 식물 긴 뿌리를 전시 하 고 1.1.5에 설명 된 조건 하에서 성장의 8 일 후 두 장미 잎을 생성.</li>
		<li>토양에 유전자 변형 식물을 전송 및 1.1.6 및 1.1.7에 표시 된 대로 그들을 육성.</li>
		<li>독립적인 T1 라인에서 T2 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, DR5 GFP 삽입 (민감한 식물에 저항 하는 식물의 비율이 될 것 이다 대략 3:1)의 복사본 하나를 운반 하는 식물을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.</li>
		<li>1.1.6에 1.1.7 같이 t 2 식물을 육성.</li>
		<li>T2 식물에서 T3 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, homozygous 유전자 변형 식물 (모두 한 줄에서 식물의 전시 hygromycin 저항)을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.</li>
		<li>1.1.8에 표시 된 대로 homozygous T3 식물의 꽃 봉 오리를 표시 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP 신호 관측
	<ol>
		<li>6% 글리세롤 솔루션을 생성 하기 위해 초순의 47 mL와 글리세롤의 3 mL를 혼합.</li>
		<li>양면 접착 테이프의 조각 유리 현미경 슬라이드를 부착 하 고는 silique 1.3.1에 표시 된 대로 수정.</li>
		<li>주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 1.3.2에 표시 된 대로 stereoscope 아래 슬라이드에 두 개의 해 부 carpels를 연결 합니다.</li>
		<li>유리 슬라이드에 6% 글리세롤의 30 µ L를 분배 고 해 부 carpels에서 ovules의 모든 솔루션 뾰족한 핀셋을 사용 하 여 합니다. 부드럽게 슬라이드에는 coverslip을 놓습니다.</li>
		<li>씨 외 투 및 각 난에 endosperm GFP 신호 태아에서의 관찰을 방지할 수 있습니다,으로 난에서 태아를 추출 합니다. 신속 하 고 부드럽게 슬라이드를 누릅니다 (더 성숙한는 난은, 슬라이드에 더 적은 힘을 적용 한다)는 난에서 태아를 돌출 시킬.</li>
		<li>GFP 형광 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여에 대 한 슬라이드를 검사 합니다. 낮은-전력 분야 (10 배)에서 격리 된 배아를 찾을 그들의 위치를 기록 그리고 DR5 GFP 식 배아에 488을 여기 광원을 설정 하 여 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈) 변경 GFP 신호 검출에 대 한 nm.</li>
		<li>추가 분석을 위해 적당 한 T3 라인 선택 배아에 GFP 식 감지.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 특성화의 난 클리어런스 및 마커 단백질 관찰을 통해 배아 치명적인 돌연변이에 배아 패턴 형성: 예를 들어 Naa10
<ol>
	<li>Naa10 돌연변이 식물에 모방 하는 태아
	<ol>
		<li>1.1.1-1.1.7에 표시 된 대로 식물 재료를 준비 합니다.</li>
		<li>Naa10식별+ / − 식물 유전자 특정 뇌관5, 다음 표를 사용 하 여 PCR에 의해 naa10의 꽃 봉 오리+ / − 1.1.8에 표시 된 대로 식물.</li>
		<li>난 정리 및 naa10의 현미경 검사 수행+ / − 배아 1.2와 1.3에 표시 된 대로.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naa10 배아를 사용 하 여 마커 단백질 분석
	<ol>
		<li>2.1-2.2에 명시 된 절차를 사용 하 여 적합 한 DR5-GFP 유전자 변형 라인을 얻을.</li>
		<li>구나10 homozygous DR5-GFP 유전자 변형 라인 크로스+ − naa10를 공장+ / − 식물 homozygous GFP 형광 마커 (유전자 특정 PCR에 의해 식별 된) F2 세대에서 naa10특성을+ −5 GFP 신호 homozygous DR5 GFP 라인을 사용 하 여 현미경으로 관찰 하 고.</li>
		<li>Naa10의 꽃 봉 오리를 표시+ / − DR5-GFP 2.1.7에서 homozygous 식물.</li>
		<li>DR5-GFP 2.2에서 homozygous naa10 배아에서 GFP 신호에 대 한 검색.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

난 클리어런스는 세포 분열을 감지 하 고 애기;에서 embryogenesis 동안 형태를 평가 하는 유용한 방법 이 기술을 사용 하 여, 배아 DIC 현미경5,12에서 직접 관찰할 수 있습니다. 난 정리를 위한 중요 한 단계는 단계 1.3.4. 1.3.4 단계에서 난 허가에 필요한 시간은 변수입니다. 2/4-셀 단계에서 배아 Hoyer의 솔루션에서 2 시간 후 그들은 불명료 한 후 12 h 보이는 반면 명확 하 게 관찰할 수 있습니다. 따라서, 더 성숙한 한 난, 더 이상 시간 이다 허가에 필요한.
2.2.5 단계는 난에서 배아를 분리 하는 슬라이드에 적용 되는 힘의 양을 중요 합니다. 태아 수 있습니다 짓 눌린 경우 너무 많은 힘이 적용 됩니다. 그러나, 너무 작은 힘을 사용 하는 경우 태아는 난에서 돌출 될 수 없습니다. 우리의 경험에서는, 더 성숙한는 난...

Embryogenesis 높은 공장 개발에서 초기 이벤트입니다. 세포 분열 및 엄격한 유전자 제어1,2차별화 통해 zygote에서 성숙한 배아 형태. 애기 배아는 embryogenesis 동안 세포 분열의 순서 예상된 패턴3,4를 따르기 때문에 morphogenesis의 제어를 공부 하는 유용한 모델입니다. 그러나, 여러 셀에 하나를 포함 하는 애기 배아 관찰 하 고 분석에 너무 작습니다. 또한, 특정 유전자의 돌연변이 배아 치 사 율5, embryogenesis에서 그 유전자의 중요 한 역할을 나타내는 발생할 수 있습니다. 배아-치명적인 돌연변이에 패턴 형성의 특성 필수 유전자 배아 개발을 규제 하는 의하여 분자 메커니즘을 이해 하기 위한 기초를 제공 한다.
자세한 방법은 직접 현미경 관찰에 의해 모델 공장 애기 배아 패턴 형성 특성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. 방법은 난 클리어런스를 배아의 현미경 관찰에 의해 다음을 포함 한다. 배아-치명적인 돌연변이의 특성 또한 설명 되어 있습니다.
다른 발달 단계에서 배아의 형태 Hoyer의 솔루션6,7지운 ovules를 사용 하 여 현미경으로 직접 확인할 수 있습니다. 이러한 ovules 전시 높은 굴절률; 따라서, 메서드를 비운이 난 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경으로 관찰 한다 견본을 위해 특히 유리 하다.
또한, embryogenesis 동안 특정 셀 또는 셀 제한 된 수에 표현 되는 유전자 배아에서 세포를 식별 하기 위해 마커로 사용할 수 있습니다. 따라서, embryogenesis 동안 셀 id 사양 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 GFP 태그 마커 단백질의 식이 모니터링 하 여 주석 첨부 될 수 있습니다. 반대로, 그것이 embryogenesis 중 한 알 수 없는 기능 유전자-GFP 융해의 식 패턴을 관찰 배아 패턴화와 그 유전자의 표현 사이의 링크를 제공를 애기에 embryogenesis에 필요한 새로운 유전자의 식별을 용이 하 게 됩니다.
여기 설명 하는 방법을 사용할 수 있습니다 또한 배아 치명적인 돌연변이의 표현 형을 특성화 하 고 세포 수준에서 embryogenesis에 영향을 받는 유전자의 영향을 확인 하. 또한, 함께 비교 마커 유전자의 표현 패턴의 야생 형 및 돌연변이 식물 사이 embryogenesis 동안, 방법은 분자 메커니즘 및 신호 경로 embryogenesis8,9에 참여에 대 한 단서를 얻을 수 있습니다. 실제로, 메서드 naa10 식물에 적용 된 그리고 그것은 돌연변이에 hypophysis의 비정상적인 부문 변화 embryogenesis5동안 auxin 배포에 의해 발생할 수 있습니다 발견 했다.

<table><tbody><tr><td>클로랄 하이드레이트</td><td>시그마</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog 기초 매체</td><td>시그마</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>피타젤</td><td>시그마</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>하이그로마이신</td><td>로슈</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>카메라: AxioCam 506 컬러</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 Zeiss</td><td>Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>필터: BP 495 - 555nm</td></tr><tr><td>입체경</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>카메라: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>영양이 풍부한 토양</td><td>KLASMANN, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mL 튜브</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 튜브</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 차아염소산나트륨 용액</td><td></td><td></td><td>국내 분석 시약</td></tr><tr><td>자당</td><td></td><td></td><td>국내 분석 시약</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>국내 분석 시약</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td></td><td></td><td>국내 분석 시약</td></tr><tr><td>배양 접시</td><td></td><td></td><td>국내 공급</td></tr><tr><td>질석</td><td></td><td></td><td>국내 용품</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td></td><td></td><td>국내 용품</td></tr><tr><td>주사기 바늘</td><td></td><td></td><td>국내 용품</td></tr><tr><td>팁 파인 핀셋</td><td></td><td></td><td>국내 용품</td></tr><tr><td>슈퍼 클린 벤치</td><td></td><td></td><td>국내 장비</td></tr></tbody></table>

애기 에서 embryogenesis를 특성화 하는 방법

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

그들의 개발의 높은 예측 가능한 특성을 감안할 때, 애기 배아 사용 되었습니다 모델로 morphogenesis 식물에서의 연구에 대 한. 그러나, 초기 단계 공장 배아 작은 그리고 그들을 관찰 하 고 분석 어렵게 만드는 몇 가지 셀을 포함. 메서드는 특성화 모델 유기 체 애기를 사용 하 여 현미경으로 식물 배아에서 패턴 형성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. Hoyer의 솔루션을 사용 하 여 신선한 ovules의 정리, 다음에 휴대폰 번호와 배아의 형태 관찰 될 수 있었다, 그리고 그들의 발달 단계는 기름 침수 렌즈 X 100을 사용 하 여 미분 간섭 명암 현미경에 의해 결정 될 수 있었다. 또한, 특정 마커 단백질 녹색 형광 단백질 (GFP)와 태그의 표현 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 셀 id 사양 배아 패턴화 하는 동안 주석을 모니터링 했다. 따라서, 세포 및 분자 수준에서 야생-타입 식물 배아에서 패턴 형성을 관찰 하 고 야생-타입 식물 및 배아 치명적인 돌연변이 배아에서 패턴 형성을 비교 하 여 모방 하는 태아에서에서 특정 유전자의 역할을 특성화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 따라서 메서드는 애기에 embryogenesis 특성을 사용할 수 있습니다.

이 문서에서 설명 하는 방법은 embryogenesis 직접 현미경으로 관찰 하 고, 특정 마커, embryogenesis 동안 셀 id 사양 주석을 추가 하 고 embryogenesis 동안 특정 유전자의 역할의 특성을 사용할 수 있습니다.
배아 (성숙한 스틱 산책 단계로 길쭉한 접합 자 단계)에서 야생-타입 애기 에 패턴의 분석에서 대표적인 결과 그림 2에 표시 됩니다. 난 정리 후 다른 발달 단계에서 배아 DIC 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 구별 될 수 있는. DR5-GFP 의 표현 패턴 embryogenesis에서 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (그림 3</s...

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

이 방법의 전반적인 목표는 모델 생물물을 사용하여 식물 배아 형성 과정 중 배아의 패턴 형성을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 Arabidopsis의 배아 형성과 같이 식물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 권장되는 조작법을 통해 모델 식물인 Arabidopsis의 배아 패턴 형성을 특성화할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시연할 사람은 저희 실험실의 대학원생 Jinlin Feng입니다. 이 절차를 시작하려면, 1.5 milliliter 튜브에 씨앗 100개를 넣으십시오. 씨앗을 멸균하기 위해 sodium hypochlorite 1 milliliter를 추가하십시오.튜브를 여러 번 뒤집어 씨앗과 용액이 잘 섞이도록 합니다. 5분 후, 튜브를 1200 Gs에서 30초 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 멸균수로 씨앗을 4회 세척하여 잔류 차아염소산나트륨을 제거합니다.다음으로, 초순수 1L에 MS 기초 염 혼합물 4.4g과 sucrose 10g을 첨가합니다. 염과 sucrose가 녹을 때까지 교반합니다. 1M potassium hydroxide를 사용하여 용액의 pH를 5.8로 조정합니다.그 다음, 3 g의 겔화제를 첨가하고 용액을 121 °C에서 15분 동안 멸균합니다. 제조된 MS 배지 30 mL를 12 cm 배양 접시에 붓습니다. 멸균된 종자를 MS 플레이트 위에 놓습니다.플레이트를 냉장고로 옮겨 4 °C 암조건에서 3일 동안 보관하여 종자를 층상처리합니다. 다음으로, 플레이트를 생장 챔버의 장일 조건에서 8일 동안 유지합니다. 그 후, 식물을 트레이의 토양으로 옮겨 심습니다.수분 손실을 방지하기 위해 트레이를 투명한 흰색 덮개로 덮습니다. 이때 식물의 유리화를 방지하기 위해 약간의 틈을 둡니다. 5일 후, 덮개를 제거하고 장일 조건의 워크인 챔버(walk-in chamber)에서 식물을 배양합니다.약 20일간 성장시킨 후, 오후 8시에 실을 사용하여 종자 줄기와 화서 위치의 꽃봉오리 10~15개를 표시합니다. 표시된 봉오리가 꽃으로 피어나는 다음 날 오전 8시를 밑씨 수분의 시작 시점으로 정의합니다. Hoyer 용액 준비를 시작하려면, 50 milliliter 튜브에 chlorhydrate 24 grams를 넣습니다. 튜브 전체를 알루미늄 호일로 감싸 빛이 완전히 차단되도록 합니다.초순수 9 mL와 글리세롤 3 mL를 첨가합니다. 튜브를 흔들어 염산염을 용해시킵니다. 그런 다음, 준비된 Hoyer 용액을 실온에서 하룻밤 동안 방치하여 기포를 제거합니다.먼저, 현미경 유리 슬라이드에 양면테이프 조각을 부착합니다. 수분 후 원하는 일수 동안 성장시킨 장각(silique)을 가상격막(pseudoseptum)이 표면에 수직이 되도록 놓습니다. 주사바늘을 사용하여 가상격막 양측의 심피(carpals)를 갈라줍니다.다음으로, 실체현미경으로 밑씨와 장각과가 보이도록 해부한 두 개의 심피를 슬라이드에 부착합니다. Hoyer's solution 70 µL를 유리 슬라이드 위에 분주합니다. 그다음, 끝이 뾰족한 핀셋을 용액에 담가 팁을 적십니다.실체현미경과 핀셋을 사용하여 배를 세척하기 위해 밑씨를 Hoyer's solution으로 옮깁니다. 그 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 슬라이드 글라스 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮습니다. 완성된 슬라이드는 암실 내 상자 속에 넣고 상온에서 2~12시간 동안 보관합니다.필요한 시간이 경과한 후, 현미경의 DIC 기능을 사용하여 투명화된 밑씨를 검사합니다. 저배율 시야에서 배를 찾은 다음, 고배율 시야로 변경하여 발달된 배의 세포 패턴을 관찰합니다. 이어서 서로 다른 발달 단계에 있는 배들을 검사합니다.먼저, DR5 GFP 플라스미드를 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 야생형 식물에 도입합니다. 하이드롤리신이 포함된 MS 배지 플레이트를 사용하여 T1 식물을 선별합니다. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 식물을 옮겨 배양하여 T3 식물을 얻습니다.실을 사용하여 오후 8시에 꽃차례의 종자 줄기 위치에 있는 동형접합 T3 식물의 꽃봉오리를 표시합니다. 그 후, 3 mL의 글리세롤을 47 mL의 초순수와 혼합하여 6% 글리세롤 용액을 제조합니다. 그런 다음 현미경 슬라이드 글라스에 양면테이프 조각을 부착합니다. T3 식물의 장각을 가막(pseudoseptum)이 표면에 수직이 되도록 슬라이드 위에 놓습니다.주사기 바늘을 사용하여 가성격벽(pseudoseptum) 양측의 심피를 분리합니다. 실체 현미경으로 배주와 장각과가 보일 수 있도록 분리된 두 심피를 슬라이드에 고정합니다. 다음으로, 6% glycerol 30 µL를 슬라이드 위에 분주합니다.미세 팁 핀셋을 용액에 담가 팁을 적십니다. 실체 현미경과 핀셋을 사용하여 밑씨를 글리세롤 용액으로 옮깁니다. 슬라이드 글라스 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮습니다.그 다음, 슬라이드를 빠르고 가볍게 쳐서 배를 배주에서 밀어냅니다. 이후 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 슬라이드에서 녹색 형광 단백질 형광을 검사합니다. 저배율 시야에서 분리된 배를 찾아 그 위치를 기록합니다.고배율 시야로 변경하고 여기 광원을 488 nanometers로 설정하여 배아의 GR5 GFP 발현을 관찰합니다. 그런 다음, GFP 발현을 검출하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배아의 패턴 형성을 특성화합니다. 본 연구에서는 보는 바와 같이 배주 투명화를 통해 Arabidopsis의 배아 발생을 관찰합니다.ovule 제거 후, 서로 다른 발달 단계에 있는 배들은 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 구분할 수 있습니다. 이후 배아 발생 과정 동안의 GR5 GFP 발현 패턴을 공초점 레이저 주사 현미경으로 기록합니다. DR5는 야생형의 구형 및 심장형 배의 뿌리 극에서 발현되는 것이 관찰됩니다.DR5는 배아 자엽 끝부분과 성숙한 야생형 배아의 관다발계에서 발현되는 것이 확인됩니다. 이후, 아라비돕시스의 배아 발생 과정 중 naa10의 역할을 조사하였습니다. 야생형 식물의 가로 방향 비대칭 분열과 비교했을 때, naa10에서는 비정상적으로 분열하며 빗겨나거나 수직으로 분열하는 양상이 관찰되었다는 가설을 세웠습니다.여기에서 볼 수 있듯이, 구상 단계의 대부분의 naa10 배아에서 oxen은 거의 균일하게 분포하며, 야생형 배아와 비교했을 때 돌연변이체에서 더 넓은 신호를 유지합니다. 이러한 결과는 naa10이 배아 발생에 필요하며, Arabidopsis의 oxen 신호 전달 경로를 통해 관여할 수 있음을 나타냅니다. 이 절차를 시도할 때는 식물 재료로서 Arabidopsis를 재배하는 방법을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차 이후에, 세포 특이적 유전자의 발현과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 인시튜 하이브리다이제이션(in-situ hybridization)과 같은 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 배아 발생 분야의 연구자들이 Arabidopsis에서 특정 유전자가 배아 발생을 매개하는 분자적 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 Arabidopsis의 배아 발생을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한...

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

우리는 애기 장대 씨앗에서 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA)를 조립하는 절차를 제시한다. SCBA는 유전자와 체외에서 탐색 할 수있는 강력한 도구가 될 수 있도록 표시 방식 휴면 종자의 빛 신호에 대한 응답으로 배유 컨트롤 종자 발아. SCBA는 배유가 배아의 성장에 영향을 미칠 것으로 의심되는 모든 상황에서 적용 할 수있는 원리입니다.

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전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

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