애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

이 방법의 전반적인 목표는 모델 유기체를 사용하여 식물 배아 발생 중 배아의 패턴 형성을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 애기장대(Arabidopsis)의 배발생(embryogenesis)과 같은 식물 물질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모델 식물 애기장대에서의 배아 패턴 형성이 권장 작업으로 특성화될 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Jinlin Feng입니다. 이 절차를 시작하려면 1.5ml 튜브에 100개의 씨앗을 추가합니다. 씨앗을 살균하기 위해 차아염소산나트륨 1ml를 첨가하십시오.

튜브를 여러 번 뒤집어 씨앗과 용액이 잘 섞이는지 확인합니다. 5분 후 1200Gs에서 30초 동안 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 멸균수로 씨앗을 4번 씻어 잔류 차아염소산나트륨을 제거합니다.

다음으로, 초순수 1리터에 MS 기초염 혼합물 4.4g과 자당 10g을 첨가합니다. 소금과 자당이 녹도록 저어줍니다. 수산화칼륨을 1mol로 사용하여 용액의 pH를 5.8로 조정합니다.

그런 다음 겔화제 3g을 넣고 용액을 섭씨 121도에서 15분 동안 살균합니다. 생성된 MS 배지 30ml를 12cm 배양 접시에 붓습니다. 멸균된 씨앗을 MS 플레이트에 놓습니다.

접시를 냉장고로 옮기고 씨앗을 층화하기 위해 3일 동안 어둠 속에서 섭씨 4도를 유지합니다. 다음으로, 플레이트를 장시간 조건의 성장 챔버에 8일 동안 보관합니다. 그런 다음 식물을 쟁반의 흙으로 옮깁니다.

수분 손실을 방지하기 위해 트레이를 투명한 흰색 뚜껑으로 덮으십시오. 식물의 유리화를 피하기 위해 작은 간격을 남겨 둡니다. 5일 후, 뚜껑을 열고 장시간 조건의 대형 챔버에서 식물을 재배합니다.

약 20 일 동안 자란 후 실을 사용하여 씨앗 줄기와 꽃차례 위치에 10-15 개의 꽃봉오리를 표시합니다 : 8 : 00 PM. 표시된 새싹이 꽃을 피우기 위해 열릴 때 배주의 수분 시작을 다음날 아침 8:00 AM으로 정의합니다. Hoyer's 용액 준비를 시작하려면 50ml 튜브에 24g의 염소수화물을 추가합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 완전히 감싸고 호일이 모든 빛을 차단하도록 합니다.

초순수 9ml와 글리세롤 3ml를 넣으십시오. 튜브를 흔들어 염소수화물을 녹입니다. 그런 다음 준비된 Hoyer's 용액을 실온에서 밤새 두어 거품을 제거합니다.

시작하려면 양면 접착 테이프를 현미경 유리 슬라이드에 부착합니다. 수분 후 원하는 일수 동안 자란 실리크를 표면에 수직인 pseudoseptum이 있는 쪽에 놓습니다. 주사기 바늘을 사용하여 가성 중격 양쪽의 수근을 분할합니다.

다음으로, 절개된 두 개의 손목을 슬라이드에 부착하여 난소와 실리크가 입체경으로 보이도록 합니다. 70마이크로리터의 Hoyer's solution을 유리 슬라이드에 분배합니다. 그런 다음 끝이 가는 핀셋 한 쌍을 용액에 담그어 팁을 적십니다.

입체경과 핀셋을 사용하여 배주를 Hoyer's solution으로 이동하여 배아를 청소합니다. 그런 다음 슬라이드 커버 슬립을 부드럽게 적용하여 거품이 발생하지 않도록 합니다. 완성 된 슬라이드를 실온에서 2 시간에서 12 시간 동안 어두운 방의 상자에 넣었습니다.

필요한 시간이 지나면 현미경의 DIC 기능을 사용하여 세척된 배자를 검사합니다. 저전력장(low-power field) 아래에서 배아를 배치한 다음, 고출력장(high-power field)으로 변경하여 발달된 배아의 세포 패턴을 관찰합니다. 그런 다음 다양한 발달 단계에 있는 배아를 검사합니다.

먼저 DR5 GFP 플라스미드를 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 아그로박테리움(agrobacterium)에 의해 메타시안 매개 형질전환(metahassians mediated transformation)에 의해 야생형 식물에 도입합니다. 가수분해진을 함유한 MS 배지 플레이트를 사용하여 T1 플랜트를 선택합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 식물을 옮기고 재배하여 T3 식물을 얻습니다.

실을 사용하여 동형 접합 T3 식물의 꽃봉오리를 8:00 PM에 꽃차례의 종자 줄기 위치에 표시합니다. 그런 다음 3 밀리리터의 글리세롤과 47 밀리리터의 초순수를 혼합하여 6 % 글리세롤 용액을 생성하십시오. 그런 다음 양면 접착 테이프 조각을 현미경 유리 슬라이드에 부착합니다. T3 식물의 실리크를 가성 격막이 표면에 수직이 되도록 슬라이드에 놓습니다.

주사기 바늘을 사용하여 가성 중격 양쪽의 수근을 분할합니다. 절개된 두 개의 손목을 슬라이드에 부착하여 배주와 실리크가 입체경 아래에서 보이도록 합니다. 다음으로, 30마이크로리터의 6%글리세롤을 슬라이드에 분배합니다.

끝이 가는 핀셋을 용액에 담그어 팁을 적십니다. 입체경과 핀셋을 사용하여 배주를 글리세롤 용액으로 이동합니다. 덮개 슬립을 슬라이드에 부드럽게 놓습니다.

그런 다음 슬라이드를 빠르고 부드럽게 두드려 배주에서 배아를 밀어냅니다. 그런 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 슬라이드에서 녹색 형광 단백질 형광을 검사합니다. 저전력 자기장 아래에서 분리된 배아를 찾고 위치를 기록합니다.

고출력 자기장으로 변경하고 여기 광원을 488나노미터로 설정하여 배아에서 GR5 GFP 발현을 관찰합니다. 그런 다음 GFP 발현을 검출하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배아 패턴 형성을 특성화합니다. 이 연구에서는 알 수 있듯이 애기장대(Arabidopsis)의 배발생(embryogenesis)이 배주 제거(ovule clearance)를 통해 관찰됩니다.

배주 제거 후, 서로 다른 발달 단계의 배아는 미분 간섭 대조 현미경을 사용하여 구별할 수 있습니다. 그런 다음 배발생 중 GR5 GFP의 발현 패턴을 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 기록합니다. DR5는 야생형 구상배아와 심장형 배아의 뿌리극(root pole)에서 발현되는 것으로 보인다.

DR5는 배아 자엽 끝과 성숙한 야생형 배아의 혈관 구조에서 발현되는 것으로 보입니다. 그 후, 배발생 중 애기장대에서 naa10의 역할을 조사하고 있습니다. 이 가설은 비정상적으로 분열된 것으로 관찰되었으며, naa10의 비뚤어진 분열과 수직 분열은 야생형 식물의 가로 비대칭 분열과 비교되었습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 황소는 구형 단계에서 대부분의 naa10 배아에서 거의 균일한 분포를 가지고 있으며, 야생형 배아에 비해 가설에서 더 넓은 신호를 유지하고 있다. 이러한 결과는 naa10이 배발생에 필요하며 애기장대에서 황소 신호 경로를 통해 유도될 수 있음을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 애기장대를 식물 재료로 재배하는 방법을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 세포 특이적 유전자의 발현과 같은 추가 질문에 답하기 위해 현장 교잡과 같은 다른 측정을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 배발생 분야의 연구자들이 특정 유전자가 애기장대에서 배발생을 매개하는 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 애기장대에서 배발생을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.