Name: 전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법 애기 장대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana 난자 전체 마운트 면역염색 및 FISH 프로토콜로 염색질 수정과 핵 구조를 단일 세포 수준에서 정량 분석하는 효율적인 방법을 연구에 활용하세요.

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기술적, 재정적 지원을 해주신 Ueli Grossniklaus(취리히 대학교)에게 감사드립니다. 일반적인 실험실 지원을 제공해 주신 Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos 및 Peter Kopf에게 감사드립니다. 이 연구는 취리히 대학교(University of Zürich)의 자금 지원을 받았으며, 스위스 국립재단(Swiss National Foundation)의 CB(31003A_130722) 및 Ueli Grossniklaus(31003A_141245 및 31003AB-126006)의 보조금, Agence Nationale de la Recherche to DG(프로그램 ANR-BLANC-2012)의 지원을 받았습니다.

절차는 그림 1에서 워크 플로에 ​​설명하고, 해부 및 조직의 매립에 대한 설정은 그림 2에 나타내었다. 1. 조직 고정 <ol><li> 얼음에 갓 만든 BVO 정착액 버퍼를 포함하는 미세 원심 분리 튜브에 20 ~ 30 심피를 수집합니다. </li><li> 부드러운 실온에서 진탕 조직 30 분 수정. </li><li> 400 X g에서 벤치 탑 마이크로 원심 1 분에 정착의 심피가 들어있는 튜브를 스핀. </li><li> 주의 깊게 정착 버퍼를 제거하고 PBT 1 ㎖​​를 추가, 얼음에 튜브를 배치합니다. </li></ol> 2. 해부 및 포함 <ol><li> 갓 만든, 5 %의 아크릴 아미드의 혼합 각각 200 ㎕ 씩 다섯 에펜 도르프 튜브를 준비합니다. </li><li> 다섯 Superfrost 슬라이드를 70 % 에탄올로 미리 청소하고 연필로 표시를 준비합니다. </li><li> 한 20 % APS의 나누어지는 얼음에 20 % 낮잠 각을 해동. </li><li> 컷 엔드 팁, 장소 4-5 심피을깨끗한 슬라이드에 그들, 액체의 초과를 제거합니다. </li><li> 미세 바늘 길이 상처를 확인하고 그림과 그림 2와 난자의 행을 해제 할 심피 벽을 분리, PBS (이하 10 μL)로 덮어서 건조하지. </li><li> 빨리 12 ㎕의 낮잠, 200 ㎕의 아크릴 아미드 믹스의 나누어지는 12 μL APS를 추가하고 혼합한다. </li><li> 해부 난자에 활성화 된 아크릴 아미드의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 20 X 20mm의 커버 슬립 커버, 실내 온도, 45 ~ 60 분에서 중합 할 수 있습니다. </li><li> 면도날을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 이 단계에서, 샘플은 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에서 4 ° C에서 하룻밤 동안 유지 될 수있다. </li></ol> 3. 조직 처리 참고 : 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2과 3.4.3를 제외한 모든 단계는 상온에서 화학 후드 아래에 80 ㎖의 용액으로 코 플린 단지에서 실시된다. 슬라이드에는 평면 팁 집게로 전송됩니다. <ol><li> 조직의 설명과고정 : <ol><li> 메탄올에서 5 분 알을 품다. </li><li> 에탄올에 5 분을 품어. </li><li> 크실렌 (1:1) : 에탄올에 30 분 알을 품다. </li><li> 에탄올에 5 분을 품어. </li><li> 메탄올에서 5 분 알을 품다. </li><li> 2.5 %의 포름 알데히드와 보완, 메탄올, PBT (1:1)에 15 분 알을 품다. </li><li> PBT에서 2 × 10 분을 씻어. 이 단계에서, 슬라이드는 4 ℃에서 하룻밤 동안 유지 될 수있다 </li></ol></li><li> 세포벽 분해 : <ol><li> 얼음 세포벽 분해 믹스의 분취 량을 해동. </li><li> 종이 타월에 수직으로 배치하여 액체의 과잉 배출, 코 플린 항아리에서 슬라이드를 타고. </li><li> 아크릴 아미드 패드에 세포벽 분해 혼합 100 μl를 추가하고 23 X 46mm의 coverslip을 커버. 다른 슬라이드에 대해 반복합니다. (자료 참조) 습기 챔버에서 37 ° C에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> PBT에서 슬라이드 2 × 5 분을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 치료의 RNase : <ol><li> 코 플린 항아리에서 슬라이드를 타고, 일 드레인이전과 액체의 전자 과잉. </li><li> 1 % 트윈 20 1 시간 동안 37 ° C에서 습기 챔버와 PBS에서 100 ㎍ / ml로 RNAseA 100 ㎕ 씩 각 슬라이드를 품어. </li><li> PBT에서 2 × 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 후 고정 및 permeabilization : <ol><li> 갓 만든 PBT-F에서 20 분 동안 후 고정합니다. </li><li> PBT에서 10 분 동안 슬라이드를 씻어. </li><li> 4 ℃에서 2 % 트윈 (20)와 PBS에서 2 시간 동안 투과 </li><li> PBT에서 2 × 5 분 동안 슬라이드를 씻어. </li></ol></li></ol> 4. 면역 염색 NOTE :이 단계에서, 일차 항체의 최적 농도는 서로 다른 희석 항체 (1:200, 1:500, 1:1000)를 사용하여 시험해야한다. <ol><li> 4 ℃에서 12 ~ 24 시간 동안 0.2 % 트윈 (20)와 PBS에 희석 차 항체 100 ㎕ 씩 각 슬라이드를 품어 </li><li> 부드러운 흔들림에 따라 실온에서 2-4 시간 동안 PBT에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 적용이차 항체 1:200 PBS + 0.2 % 트윈 20 ~ 24 시간 동안 4 ℃에서 </li><li> 부드러운 흔들림에 따라 실온에서 1 시간 동안 PBT에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 PBS에서 10 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오드화물로 Counterstain 후 실온에서 부드럽게 진탕 PBS에서 15 분간 린스. </li><li> 반대로 퇴색 액체의 mountant 마운트는 10 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오드 보충. 설치 매체가 CLSM으로 이미지를 획득하기 전에 1 시간 동안 강화하자. </li></ol> 5. 정량 이미징 <ol><li> 이미지 수집 : <ol><li> 이상적으로 더 장시간 촬상 23 이상의 형광 신호의 보존 및 63X 글리세롤 침지 렌즈를 허용 공진 스캐닝 모드를 이용하여, CLSM을 이용한 고해상도 이미지를 획득. </li><li> 엄격히 걸쳐 따르도록 표준 획득 절차를 정의하기 위해 이러한 실험의 시작에서 레이저 강도, 게인, 핀홀, 복셀의 크기 및 줌 배율 등 획득 파라미터를 테스트일관성있는 정량적 측정을위한 모든 슬라이드. </li><li> 형광 색소 사이의 크로스 토크 (cross-talk)이 없음을 확인합니다. 존재하는 경우, 순차적 스캔을 설정합니다. 따로 따로가 아니라 동시에 전송 이미지를 획득. </li><li> x 및 y 차원에서 가능한 가장 높은 해상도와 Z 치수 (나이 퀴 스트의 규칙)의 2 배 오버 샘플링과 시리얼, 입체 영상 획득을 수행합니다. </li></ol></li><li> 이미지 처리 : <ol><li> 상업용 또는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 세 가지 차원에서 일련의 이미지를 재구성. </li><li> 3D에 대한 관심의 각 핵 (또는 셀)의 주위에 윤곽 표면을 정의합니다. </li><li> 각 개체의 픽셀 강도의 합으로 각 채널에 형광의 양을. </li><li> 통계 분석을위한 데이터를 Excel로 내 보냅니다. 예를 들면 DNA 염색 신호에 대한 항체 신호를 정상화. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

꽃 피는 식물에서 여성의 생식 계통 따라서 기술적으로 도전적인 전체 마운트의 세포 학적 염색법을 렌더링, nucellus와 난자 teguments를 포함한 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 여기에서 우리는 전체 마운트의 현장 하이브리드의 면역 염색, DNA 염색 및 형광으로 세포 학적 염색에 적합한 난자의 많은 수의 준비 및 처리를 가능하게하는 효율적인 프로토콜을 제시한다. 우리는 성공적 아라비돕시스 21,22있는 여성 생식 생식선의 분석을 위해 사용 하였다. 여러 슬라이드를 다른 염색에 대한 병렬로 처리 할 수​​있는이 방법은 매우 효율적입니다. 또한 강력하고 균일 한 신호 분배를 제공하고 재현성있는 정량 분석​​ 할 수 있습니다. 이러한 크로 마틴 구조의 변성을 포함 Feulgen 염색 등의 고전적인 방법과는 대조적으로, 우리의 프로토콜은 염색질 조직과 핵 항원을 유지합니다. 추가의ition, 티슈 해명은 단일 세포 수준에서 높은 해상도로 신호를 촬상 가능하게한다....

꽃 식물의 생식 계통의 설립은 SMCS의 차별화, 여성 MMC 및 남성 microspore 어머니 세포로 시작합니다. MMC는 난자 primordium의 원심 끝에서 하위 표피 nucellar 세포에서 개발하고 microspore 어머니 세포 깊은 꽃 기관 (1)의 내부에 위치하는 꽃밥 locule에 sporogenous 조직에서 개발하고 있습니다. SMCS는 유사 분열시 배우체로 야기 반수체 포자를 생산하는 세포의 감수 분열을 받다. 여성 배우체, 또는 배아 골목, 하나의 난자, 하나의 중앙 세포, 두 synergids 세 antipodals으로 구성되어 있습니다. 남성 배우체, 또는 꽃가루는, 하나의 식물 세포와 두 개의 정자 세포로 구성되어 있습니다. 남성 배우체가 상대적으로 접근 객체의 학습 남아있는 동안, 여성 배우체는 자체가 꽃 심피 묶인 난자 내부에 포함하고, 따라서 분자 및 세포 학적 분석에 대한 특정 문제를 제기한다. 그러나 최근에는 레이저를 이용한미세 절제는 transcriptomic는 MMC와 여성 gametophytic 세포 2-4의 분석을 허용하는 훌륭한 솔루션을 제공했다. 후보 유전자 발현뿐만 아니라 세포 학적 분석은 특정 직접 세포의 염색 또는 간접적으로 면역 염색을 사용하여 내인성 세포 구성 요소의 역학을 조사, 현장 하이브리드 또는 리포터 유전자 분석의 예 RNA를 허용하여, 분석한다. 특히, 함께 염색질 수정이나 염색질 구성 요소의 면역 염색으로, 생선, DNA 염색을 이용하여 세포 유전 학적 염색은 애기 장대 5 염색질 역학과 핵 조직을 명료하게 중심 접근 방식이다. 일반적으로 세포의 감수 분열이 아니라 6,7 meiocytes 식물 남성에서 조사 된 특정 염색체의 역 동성을 수반한다; 가능성이 동적 성적인 프로그래밍을 반영하는 더 큰 규모의 셀 특정 염색질 재구성, 꽃가루 개발 8 ~ 10시에 설명되어 있습니다. 대조적으로 인해여성 meiocyte와 배우체의 상대적 어려움에,이 조사는 적용 할 기술적으로 어려운 남아 있고, 자주 (아래 참조) 단면 또는 수동 해부 및 소화 효소를 필요로한다. 또, 전체의 실장 광학 명확성 널리 부족 그대로 난자의 생식 세포의 고해상도 영상에 장애물이다. 전체 마운트 난자의 염색체 조직의 세포 학적 분석을위한 고전적인 방법은 Feulgen의 염색 11 ~ 13을 사용합니다. 이는 단백질 변성을 초래하고, 따라서 염색질 구조의 파괴를 일으키는 DNA의 (차아 염소산을 이용하여) 산 가수 분해를 수반한다. 또한, 여성 meiocytes 및 gametophytic 세포의 염색체 조직 (예를 들어 14 ~ 18 참조) 세미 얇은 부분 또는 해부 배아 주머니와 MMC에 DAPI 염색과 면역 염색을 이용하여 관찰 할 수있다. 분명히, 그러나, 수동 해부 및 절편은 노동 집약적이 될 수 있습니다염색질 에피토프의 다수의 정성 및 정량 분석​​을 방해한다. 여기에서 우리는 전체 마운트 하류 세포 학적 염색의 다양한 적합한 애기 난자의 큰 숫자를 준비하는 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 간단히, 꽃 봉오리가 정착 용액에 배양, 난자의 행은 심피에서 해부하고 꽃가루 meiocytes (19, 20)에 대해 수행으로 슬라이드에 아크릴 아미드에 포함. 내장 된 난자는 더 메탄올, 에탄올, 세포 벽 소화 permeabilization 전에 자일 렌에서 지워 고정되어 있습니다. 이 단계의 가능한 변화는 설명합니다. 샘플은 DNA 염색, 면역 염색, 물고기를 사용할 수 있습니다. 준비 모드는 효율적이며 (최대 16 슬라이드를 다른 다운 스트림 분석을 위해 하루에 제조 할 수있다) 병렬 실험 장치 할 수 있습니다. 설명 치료, 전체 마운트에 균일 한 신호를 활성화하고 잘 조직 학적, 세포의 보존세포 유형 간의 질적 및 양적 비교에 도움이 생식 세포와 주변 nucellar 세포에서 핵 조직. 보정, 3 차원 재구성 다음 CLSM 기반의 고해상도 영상은 형광 신호의 의미있는 정량적 인 측정이 가능합니다. 우리는 성공적으로 차별화 된 MMC (21)과 여성 배우체 22 개발에 염색질의 역학을 분석하기 위해이 절차를 사용; 우리는 여기에서 전체 마운트 난자의 이질 염색질 분석, 크로 마틴 면역 염색, GFP의 면역 염색과 물고기의 대표적인 결과를 제시한다. 우리는 또한 우리의 프로토콜이 다른 식물 조직 및 종에 적합 할 것이라고 믿는다.

<table><tbody><tr><td>용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BVO 고정 완충액(기준32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7.5, 1%(v/v) 포름알데히드, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0.1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td>, <td>1x PBT, 2.5%(v/v) 포름알데히드</td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드:비스아크릴아미드</td><td></td><td></td><td>3 g 아크릴아미드, 0.33 g 비스아크릴아미드, 1x PBS (10 ml를 준비하고 4 &deg에서 보관하십시오. C)</td></tr> <tr>PBS<td></td><td></td><td>에 200 ml 5% 아크릴아미드 혼합</td><td>34 ml 30% 아크릴아미드:비스아크릴아미드, 166 ml 1x PBS (30% 재고에서 신선하게 만들기)</td></tr><tr><td>20% 암모늄퍼설프트</td><td></td><td></td><td>0.2 g 암모늄퍼설프테, 1 ml 멸균수 (1 ml로 분취액을 준비하고 -20°C에서 보관하십시오. C)</td></tr> <tr><td>20 % 아황산</td><td></td><td></td>나트륨 <td>0.2g, 1ml 멸균 물 (1ml로 부분 표본을 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오. C)</td></tr> <tr><td>세포벽 효소 믹스</td><td></td><td></td><td>0.5 % (w / v) 셀룰라아제, 1 % (w / v) 드리 셀라제, 0.5 % (w / v) pectolyase</td></tr><tr><td>시약 및 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>아마레스코</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Schaurlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제</td><td>시그마</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>시그마</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pectolyase</td><td>시그마</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>비사아크릴아미드</td><td>시그마</td><td>M2022</td><td>독성</td></tr><tr><td>과황산</td>암모늄 <td>시그마</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>아황산나트륨</td><td>플루카</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>안티 트리메틸 히스톤 H3 (Lys4)</td> <td>업스테이트</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>안티 모노메틸 히스톤 H3 (Lys27)</td> <td>업스테이트</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ~ 염소 ~ 안티 ~ 토끼 (H + L)</td> <td>분자 프로브</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>시그마</td><td>P4170</td><td>독성</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td>독성</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셰이커</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>촉촉한 챔버</td><td></td><td></td><td>내부에 축축한 종이 타월이 있는 플라스틱 상자, 플라스틱 지지대를 상자에 넣어 슬라이드를 지지하고 슬라이드를 물로부터 보호합니다.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 슬라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td></tr><tr><td>FISH 태그 DNA 키트</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP 부스터</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

꽃 피는 식물에서 체세포 - 투 - 생식 세포의 운명 전환은 성인 식물의 꽃 장기에 포자 어머니 세포의 사양 (SMCS)로 표시됩니다. 여성 SMC (megaspore 어머니 세포, MMC)는 난자 primordium의 차별화 및 감수 분열을 겪는다. 선택된 반수체 megaspore는 함께 액세서리 세포, 생식 세포에 상승을 줄 것이다 다세포 여성 배우체, 난자와 중앙 셀을 형성하기 위해 유사 분열을 겪는다. 난자 내부의 MMC, meiocyte과 여성 배우체의 제한된 접근성은 세포학에 대한 기술적 도전과 세포 유전은 단일 세포 수준에서 분석한다. 특히, 세포 핵 항원의 직접 또는 간접 면역이 식물 세포 및 단일 세포 이미징 내부의 시약의 가난한 침투에 의해 손상은 전체 마운트 조직에 광학 선명도의 부족에 의해 demised된다. 따라서, 우리는 nucl을 분석 할 수있는 효율적인 방법을 개발전체 마운트 포함 된 애기 장대의 난자에 하나의 셀의 높은 해상도에서 귀 조직과 염색질 수정. 이것은 현미경 슬라이드에 아크릴 아마이드 겔의 박층의 박리 및 고정 난자의 매립에 기초한다. 내장 된 난자는 면역 염색 시약으로 조직의 명확성과 침투성을 향상을 목표로 화학 및 효소 처리를 실시하고 있습니다. 그 치료는 세포 및 염색질 조직, DNA와 단백질 항원을 유지합니다. 샘플은 염색질 면역 염색, 원위치 혼성화 (FISH) 형광 및 이질 분석을위한 DNA 염색 등 다른 하류 세포 학적 분석을 위해 사용될 수있다. 3D 재구성 다음에 높은 해상도를 가진 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 영상은, 단일 셀 해상도에서 정량 측정 할 수 있습니다.

우리는 전체 마운트의 세포 학적 염색에 적합한 애기 난자의 대규모 준비 및 처리를위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. 매립 덕분에, 난자는 3 차원 구조 (그림 3)를 유지한다. 또한, 광학 설명을 포함하여 조직 처리는 높은 해상도로 영상 세포 내 구조를 가능하게한다. 4 이질 염색질이 (더 디컨 볼 루션이 그림에 사용되지 않았다)도 눈에 초점을 정의, 밝은 표시 전체 마운트 난자 원기의 DNA 염색을 보여줍니다. 이러한 이미지는 MMC와 nucellus (그림 4) 21의 이질 염색질의 내용을 분석 하였다. 또한, 우리는 성공적으로 정량적 megaspore 어머니 세포 기능 megaspore 개발, 여성 배우체와 초기 배아 21, 22 ~ 24의 면역 염색에 의해 염색질의 역학을 분석하는이 프로토콜을 ...

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

이 절차의 전체적인 목적은 전체 마운트 하이브리다이제이션 및 면역 염색을 위해 Arabidopsis Vues를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 고정액으로 신선한 꽃봉오리를 고정함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 Vues를 조심스럽게 해부하여 현미경 슬라이드 위에 직접 소형 아크릴아마이드 패드로 매립하는 것입니다.다음 조직 처리 단계에서는 조직 투명화 및 투과가 이루어집니다. 마지막 단계는 처리된 시료를 면역 염색을 위한 항체 용액 또는 형광 in situ hybridization을 위한 표지 프로브와 함께 배양하는 것입니다. 최종적으로, 고해상도 공초점 이미징과 이어지는 3차원 재구성을 통해 단일 세포 수준에서 전체 마운트(whole mount) 정량 분석이 가능해집니다.이 방법은 처음에 시각 영역의 CT 조직 구성을 파악하기 위해 사용되었으나, plunge의 다른 조직이나 다른 모델 생물체의 다른 세포 구획을 분석하는 데에도 적용될 수 있습니다. 얼음 위에서 냉각시킨 갓 제조한 BBO 완충액을 채운 마이크로 튜브에 튜브당 20~30개의 carpals를 넣고, 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 다음으로, 400 Gs에서 1분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, carpals에 PBT 1 mL를 추가합니다. 마운트할 carpals 튜브들을 얼음 위에 둡니다.얼음 위에서 준비하십시오. 200 µL의 갓 제조한 5% 아크릴아마이드 혼합액이 담긴 튜브 5개를 준비합니다.연필로 표시한 깨끗한 super frost 슬라이드 5개, 20% APS 용액, 그리고 한 튜브의 carpals에서 유래한 20% NAPS 용액을 준비합니다. 절단된 끝부분이 있는 샘플을 4~5개 취해 각 슬라이드 위에 하나씩 올립니다. 미세 바늘을 사용하여 조심스럽게 피펫팅하여 과잉 액체를 제거합니다.수근골에 세로 절개를 넣고 수근골 벽을 제거하여 뷰(vues) 열을 분리합니다. 이 단계는 숙련도가 필요합니다. 최대 10 µL의 PBS를 추가하여 뷰가 마르는 것을 방지한 다음, 아크릴아마이드 혼합물이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.NAPS 12 µL와 PS.Mix 12 µL를 빠르게 첨가합니다. 피펫팅을 통해 용액을 잘 섞은 다음, 활성화된 아크릴아미드 30 µL를 빠르게 첨가합니다. 해부된 vues가 놓인 슬라이드 위에서 혼합합니다. 준비물 위에 작은 커버 슬립을 살며시 덮고, 실온에서 약 1시간 동안 용액을 중합시킵니다.나중에 각 슬라이드를 이와 같은 방식으로 준비하십시오. 면도날을 사용하여 커버슬립을 떼어냅니다. 샘플은 PBS가 담긴 코플란 자(coplan jar)에 넣어 4°C에서 하룻밤 동안 보관하거나 즉시 처리를 진행할 수 있습니다.일반적으로 모든 처리는 80 mL의 용액이 담긴 coplan jar 내에서 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다. 먼저 메탄올, 에탄올, 1:1 에탄올-자일렌 용액, 다시 에탄올, 그리고 메탄올 순의 용액 시리즈로 배양하여 조직을 투명화합니다.각 세척 단계는 5분 또는 30분 동안 진행합니다. 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 2.5% formaldehyde가 포함된 1:1 methanol PBT 용액을 사용하여 15분 동안 처리합니다.그 다음 조직을 PBT로 10분씩 두 번 헹굽니다. 이후 필요에 따라 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. 다음으로, 용기에서 최대 6장의 슬라이드를 꺼내어 과잉 액체를 제거합니다.이들을 조직지에 올리고 차갑게 식힌 세포벽 소화 효소 100 µL를 빠르게 가합니다. 패드 위에서 혼합합니다. 그다음 슬라이드 위에 큰 커버슬립을 덮습니다.슬라이드를 습윤 챔버에서 37 °C로 2시간 동안 배양합니다. 이후 균일한 염색을 위해서는 이 단계가 매우 중요하므로, 새로운 효소 용액을 사용할 때마다 CO 소화 온도를 최적화하는 것이 중요합니다. PBT로 슬라이드를 2회 세척하며, 회당 5분씩 세척합니다.그 다음 각 슬라이드의 액체를 제거합니다. 1% tween이 포함된 PBS에 희석한 RNAs A 100 µL를 첨가하고, 습윤 챔버 내 37 °C에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양 후, 이전과 마찬가지로 PBT로 슬라이드를 두 번 세척한 다음, 갓 제조한 PBTF 용액에 슬라이드를 20분 동안 담가 조직을 다시 고정합니다. PBT로 10분간 한 번 세척하여 PBTF를 헹구어 냅니다.그런 다음 4°C에서 2% tween이 포함된 PBS에 슬라이드를 2시간 동안 배양하여 조직 투과화를 진행합니다. PBT로 각각 5분씩 두 번 세척하여 투과액을 제거합니다. 그 후 면역 염색을 진행합니다.먼저 슬라이드를 원하는 1차 항체에 배양하는 것으로 시작합니다. PBS에 희석하고 0.2%between이 포함된 항체를 각 슬라이드에 100 µL씩 분주합니다. 슬라이드를 습윤 챔버로 옮겨 4 °C에서 12~24시간 동안 배양합니다.슬라이드를 PBT 용액에 담가 실온에서 부드럽게 흔들어주며 2~4시간 동안 세척합니다. 다음으로, 0.2% PBS에 1:200으로 희석한 2차 항체 100 µL를 첨가하고 4 °C에서 24시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 결합되지 않은 2차 항체를 제거하기 위해 PBT 용액에서 부드럽게 흔들어주며 1시간 동안 세척하는 것으로 충분합니다.그 다음 PBS에 10 µg/mL의 propidium iodide가 포함된 용액으로 DNA를 대조 염색합니다. 15분 동안 염색이 진행되도록 둔 후, 실온에서 15분간 부드럽게 흔들어주며 PBT로 슬라이드를 세척합니다. 이제 10 µg/mL의 propidium iodide가 첨가된 anti fade medium을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다.한 시간 동안 굳힌 후, 63x 글리세롤 침수 렌즈를 사용하여 공초점 현미경으로 슬라이드를 촬영합니다. 이때, 비교 정량화를 가능하게 하려면 이미지 획득 과정에서 샘플 간 스캐닝 설정을 동일하게 유지하고 선형 검출 모드를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 이후 연속 이미지를 3차원 구조로 재구성하고, 관심 있는 각 핵을 분할한 뒤 3D 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 신호를 정량화합니다.이 정밀한 대규모 준비 프로토콜을 사용하면, whole Mount Vues의 3차원 구조를 유지할 수 있습니다. 염색질에서 볼 수 있듯이 세포 내 구조가 매우 상세하게 관찰됩니다. DNA 염색 시, 디콘볼루션(deconvolution)을 적용하지 않고도 헤테로크로마틴이 밝고 뚜렷한 초점으로 나타납니다.본 프로토콜을 통해 한 번의 과정으로 여러 항체를 이용한 병렬 면역 염색이 가능합니다. 예를 들어, 크로마틴 역동성을 분석하기 위해 서로 다른 반복 슬라이드 상의 한 실험에서 유크로마틴 관련 허용 마커인 H3K4me3(H three trimm methylated lysine four)와 헤테로크로마틴 관련 마커인 H3K27me1(H three monomethyl lysine 27)을 모두 검출하였습니다. 또 다른 호환 가능한 기술로는 45s rRna를 대상으로 하는 형광 인시튜 하이브리다이제이션(FISH)이 있습니다.핵 조직 영역을 정의하기 위해 DNA 반복 서열이 사용되었습니다. 프로브는 Alexa 488로 직접 표지하였으며, DNA는 대조 염색하였습니다. 형광 분석을 위해서는 가장 낮은 항체 농도에서 가장 강력하고 균일한 신호를 주는 조건을 확인하기 위해 다양한 항체 희석 배수와 배양 시간을 테스트하는 것이 매우 중요합니다.본 방법은 조직의 우수한 보존과 염색질 구조의 단일 세포 분석을 위한 최적의 투과성을 달성하므로, 식물 세포 생물학 또는 식물 후성유전학 분야의 연구자들이 단일 세포 수준 및 전체 식물 맥락에서 핵 또는 세포 내 하위 구조를 조사할 수 있는 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한...

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 애기장대 이중 수정에 있는 정액 핵 형태에 근거하여 성공또는 실패한 수정을 결정하는 방법을 보여줍니다.

애기장의 정자 핵 형태를 추적하여 수정 상태의 평가 이중 수정

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.

Preparation of intact tissue for microscopic analysis of the endosperm cell layer in Developing and mature Arabidopsis seeds(개발 및 성숙한 애기장대 종자에서 배유 세포층의 현미경 분석을 위한 온전한 조직의 준비)

감수 분열 전기 동안의 염색체 이동은 포자 형성의 기본이 되는 잘 이해되지 않는 현상입니다. 이 프로토콜은 애기장대 탈리아나 수컷 감수 모수세포에서 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임을 획득, 분석 및 정량화하는 방법을 설명합니다.

애기장대 의 수컷 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임의 라이브 이미징 특성화

이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜

이 수컷 옥수수 감수세포의 면역 국소화 프로토콜은 감수분열 동안 세포의 3차원적 완전성을 유지합니다. 이 방법은 보존된 파라포름알데히드 고정 물질 내에서 최대 세 개의 독립 항체의 세포 내 위치를 동적으로 추적할 수 있게 하며, DNA를 염색하는 DAPI도 포함됩니다.

옥수수 감수세포에서의 3차원 면역 위치

이 과정은 공초점 현미경과 형광 표지된 핵 및 염색질 마커 라인을 결합하여 애 기장대 뿌리의 핵과 염색질 역학을 동시에 기록하고, 발달 및 환경 신호에 반응하여 이러한 역학 변화를 조사  합니다.

애기장대 뿌리의 핵 형태와 염색질 역학의 정량적 생세포 영상화 및 발달 및 환경 스트레스 중

배우세요 Arabidopsis thaliana 난자 전체 마운트 면역염색 및 FISH 프로토콜로 염색질 수정과 핵 구조를 단일 세포 수준에서 정량 분석하는 효율적인 방법을 연구에 활용하세요.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법

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