전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법 애기 장대

이 절차의 전반적인 목표는 전체 산 교잡 및 면역 염색을 위해 Arabidopsis Vues를 준비하는 것입니다. 이것은 먼저 고정액에 신선한 꽃봉오리를 고정함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 현미경 슬라이드에 직접 소형 아크릴아마이드 패드의 vue를 조심스럽게 해부하고 삽입하는 것입니다.

다음으로 조직 가공은 조직 정화 및 투과를 가능하게 합니다. 마지막 단계는 처리된 시료를 면역 염색을 위한 항체 용액 또는 C 2 혼성화에서 형광을 위한 표지된 프로브로 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 고해상도 컨포칼 이미징 후 3차원 재구성을 통해 단일 세포 수준에서 전체 마운트에서 정량적 분석이 가능합니다.

이 방법은 초기에는보기에서 CT 조직에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용되었지만, 플런지의 다른 조직 및 다른 모델 유기체의 다른 세포 구획을 분석하는 데에도 적용 할 수 있습니다 갓 만든 BBO 완충액으로 채워진 마이크로 퍼지 튜브에 튜브 당 20-30 개의 손목으로 얼음에서 냉각하고 튜브를 실온에서 30 분 동안 부드럽게 흔들리도록 설정합니다. 다음으로, 400 Gs.Then에서 1 분 동안 튜브를 스핀 다운 한 다음 조심스럽게 상등액을 흡인하고 버리고 손목에 PBT 밀리리터를 첨가하십시오. 장착할 손목의 각 튜브에 대해 얼음 위에 튜브를 놓습니다.

얼음 위에서 준비했습니다. 200마이크로리터를 포함하는 5개의 튜브. 갓 만든 5%아크릴아마이드 믹스.

연필로 표시된 5개의 깨끗한 슈퍼 프로스트 슬라이드, 손목 튜브 하나에서 20%a PS의 생각 Eloqua 및 20% NAPS의 생각 Eloqua. 절단 끝 끝으로 4개 또는 5개를 가져와서 각각 하나의 슬라이드에 놓습니다. 가는 바늘을 사용하여 조심스럽게 피펫팅하여 과도한 액체를 제거하십시오.

수근을 세로로 자르고 수근벽을 제거하여 수근 줄을 해제합니다. 이 단계에서는 연습이 필요합니다. 최대 10마이크로리터의 PBS를 첨가한 다음 아크릴아마이드 혼합물이 포함된 마이크로 fuge 튜브에 추가하여 vues가 건조되는 것을 방지합니다.

12마이크로리터의 NAPS와 12마이크로리터의 PS를 빠르게 추가할 수 있습니다. 용액을 피펫팅과 잘 혼합하고 이 활성 아크릴아미드 30마이크로리터를 빠르게 첨가합니다. 절개된 vue가 있는 슬라이드에 혼합합니다. 준비물에 작은 커버 슬립을 부드럽게 놓고 용액이 실온에서 약 한 시간 동안 중합되도록 합니다.

나중에 이런 방식으로 각 슬라이드를 준비합니다. 면도날을 사용하여 커버 슬립을 벗겨냅니다. 샘플은 PBS가 있는 coplan 용기에 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관하거나 직접 처리를 진행할 수 있습니다.

일반적으로 처리는 80 밀리리터의 용액이있는 coplan jar에서 수행해야합니다. 그리고 흄 후드 아래. 먼저 메탄올 에탄올, 일대일 에탄올 크실렌 용액의 용액 시리즈에서 배양을 통해 조직을 정화하고 다시 에탄올과 메탄올로 배양합니다.

각 목욕은 5분 또는 30분 동안 진행됩니다. 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 2.5% 포름알데히드가 포함된 일대일 메탄올 PBT 용액을 15분 동안 사용합니다.

그런 다음 PBT로 조직을 두 번 헹굽니다. 그 후, 슬라이드는 필요한 경우 섭씨 4도에서 밤새 보관할 수 있습니다. 다음으로, 병에서 최대 6개의 슬라이드를 꺼내 여분의 액체를 배출합니다.

티슈 페이퍼에 놓고 100마이크로리터의 차가운 세포벽 소화 효소를 빠르게 첨가합니다. 패드에 섞습니다. 그런 다음 큰 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다.

슬라이드를 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 모든 새로운 효소 용액에 대해 CO 분해 온도를 최적화하는 것이 중요한데, 이 단계는 나중에 균일한 염색에 중요하기 때문입니다. PBT로 슬라이드를 두 번 세척할 때마다 5분 동안

그런 다음 이제 슬라이드를 각 슬라이드로 배수합니다. 1%트윈으로 완성한 PBS에 RNA A 100마이크로리터를 첨가하고 배양 후 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 슬라이드를 배양하고 이전과 같이 PBT로 슬라이드를 두 번 세척한 다음 갓 만든 PBTF 욕조에서 20분 동안 슬라이드를 배양하여 조직을 다시 고정합니다. PBT에서 10분 동안 한 번 세척하여 PBTF를 헹굽니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 2시간 동안 2% 트윈으로 PBS의 슬라이드를 배양하여 조직 투과를 진행합니다. PBT를 5분씩 2회 세척하여 투과액을 제거합니다. 그런 다음 면역 염색을 진행합니다.

관심 있는 1차 항체에서 슬라이드를 배양하는 것으로 시작합니다. PBS에 희석된 항체 100마이크로리터 분취액을 각 슬라이드에 0.2%씩 적용합니다. 슬라이드를 습한 챔버로 옮기고 섭씨 4도에서 12-24시간 동안 배양합니다.

PBT 욕조에서 2-4시간 동안 실온에서 부드럽게 흔들면서 슬라이드를 씻으십시오. 다음으로, PBS에 1-200으로 희석된 2차 항체 100마이크로리터를 0.2% 20 사이로 첨가하고 슬라이드를 섭씨 4도에서 24시간 동안 배양합니다. PBT에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 넣으면 결합되지 않은 2차 항체의 슬라이드를 세척하기에 충분합니다.

그런 다음 PBS에서 요오드화 프로피듐 밀리리터당 10마이크로그램의 용액으로 DNA를 대조염색합니다. 염색이 15분 동안 계속되도록 한 다음 실온에서 15분 동안 부드러운 흔들기를 사용하여 PBT로 슬라이드를 세척합니다. 이제 프로피듐 요오드화물 밀리리터당 10마이크로그램이 보충된 페이드 방지 매체로 슬라이드를 장착합니다.

한 시간 동안 설정한 후 63 x 글리세롤 이멀젼 렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경에서 슬라이드를 이미지화합니다. 따라서 이미지 획득 중에는 비교 정량화를 가능하게 하고 선형 검출 모드를 사용하기 위해 샘플 간에 스캔 설정을 동일하게 유지하는 것이 중요합니다. 나중에 직렬 이미지를 3차원 구조로 재구성하고, 관심 있는 각 핵을 분할하고, 3D 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 신호를 정량화합니다.

이 강력한 대규모 준비 프로토콜을 사용하여 전체 Mount Vues는 3차원 구조를 유지합니다. 세포 내 구조는 염색질에서 볼 수 있는 것처럼 매우 자세하게 볼 수 있습니다. DNA를 염색할 때 헤테로 염색질은 디콘볼루션을 적용할 필요 없이 밝고 잘 정의된 초점으로 나타납니다.

이 프로토콜은 한 라운드에서 여러 항체를 사용하여 병렬 면역 염색을 허용합니다. 예를 들어, U 염색질 관련 허용 마커 H 3 trimmm methylated lysine four 및 hetero chromatin 관련 마커 H 3 monomethyl lysine 27은 모두 염색질 역학을 분석하기 위해 별개의 복제 슬라이드에서 한 번의 실험에서 검출되었습니다. 또 다른 호환 가능한 기술은 형광 C 2 교잡 또는 물고기 물고기에서 45 s.Ribosomal입니다.

DNA 반복은 핵 조직 영역을 정의하는 데 사용되었습니다. 프로브는 Alexa 4 88로 직접 라벨링되었으며 DNA는 카운터 염색 분석의 경우 다양한 신체 희석 및 배양 시간을 테스트하여 가능한 가장 낮은 수준으로 견고하고 hogene 신호를 제공하는 조건을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 그리고 몸의 뉘우침.

이 방법은 염색질 조직의 단일 세포 분석을 위한 조직의 탁월한 보존과 최적의 투과를 달성하기 때문에 식물 세포 생물학 또는 식물 후성 유전학 분야의 과학자들이 단일 세포 수준 및 전체 인간 맥락에서 핵 또는 세포 내 조직을 조사할 수 있는 길을 열었습니다.