보체 수용체 1 길이 다형성 유전자 타이핑을위한 고해상도 Melting PCR : 알츠하이머 병 유전자 감수성 평가를위한 혁신적인 도구

이 방법의 전반적인 목표는 보체 수용체 1(complement receptor 1) 길이 다형성의 유전자형을 분석하여 알츠하이머병과 같은 질병에 대한 감수성을 평가하고, 질병 발병 기전에서 CR1 이소형(isoform)의 역할을 더 잘 이해하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병의 발병 기전과 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신선한 혈액 샘플이 필요하지 않으며, 더 쉽고 저렴하고 빠르기 때문에 더 많은 인구 집단에 적용 가능하다는 점입니다.

우리는 Western blot 수행 시 소요되는 시간과 신선한 혈액 샘플의 필요성으로 인한 어려움을 인식했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 1.5-milliliter 튜브 바닥에 proteinase K 20 µL를 피펫으로 넣으십시오. 그 다음, 튜브에 샘플 200 µL를 추가하십시오.

샘플에 200 µL의 용해 완충액(lysis buffer)을 추가합니다. 15초 동안 펄스 볼텍싱(pulse vortexing)하여 혼합합니다. 혼합 후, 항온수조에서 56 °C로 10분 동안 배양합니다.

1.5-milliliter 튜브를 짧게 원심분리하여 뚜껑 안쪽의 액적을 제거합니다. 그다음, 샘플에 100 microliters의 에탄올을 첨가합니다. 15초 동안 펄스 보텍싱으로 다시 혼합한 후, 이전과 같이 튜브를 짧게 원심분리합니다.

다음으로, 혼합물을 2 mL 수집 튜브에 장착된 멤브레인 컬럼에 조심스럽게 분주합니다. 테두리가 젖지 않도록 주의하며 캡을 닫고 6,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 멤브레인 컬럼을 깨끗한 2 mL 수집 튜브로 옮기고, 여과액이 담긴 튜브는 폐기합니다.

멤브레인 컬럼을 조심스럽게 열고 테두리가 젖지 않도록 wash buffer one 500 µL를 첨가합니다. 캡을 닫고 6,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 멤브레인 컬럼을 깨끗한 2 mL 수집 튜브에 넣고 여과액이 담긴 튜브는 폐기합니다.

멤브레인 컬럼을 조심스럽게 연 후, 테두리가 젖지 않도록 세척 버퍼 2 500 µL를 첨가합니다. 캡을 닫고 20,000 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 멤브레인 컬럼을 새로운 2 mL 수집 튜브에 넣고 다시 원심분리합니다.

원심분리 후, 멤브레인 컬럼을 깨끗한 1.5 milliliter 튜브에 넣고 여과액이 담긴 수집 튜브는 폐기하십시오. 멤브레인 컬럼을 조심스럽게 열고 증류수 200 microliters를 첨가합니다. 컬럼을 상온에서 5분 동안 배양한 후, 6,000 ×g에서 1분 동안 원심분리하십시오.

HRM-PCR 프로토콜을 수행하려면, 먼저 1.5-milliliter 튜브에 담긴 DNA 샘플을 물로 희석하여 10 nanograms per microliter 농도로 맞춥니다. 다음으로, 해동된 프라이머 용액을 1.5-milliliter 튜브에서 물로 희석하여 6 micromolar의 동일한 농도로 맞춥니다. HRM-PCR 키트 용액을 해동하고 보텍싱하여 모든 성분이 충분히 회복되도록 주의해서 혼합합니다.

DNA 결합 염료가 포함된 효소 혼합물, 염화마그네슘 및 물이 들어 있는 세 개의 바이알을 열기 전 마이크로원심분리기로 짧게 원심분리합니다. 실온에서 1.5 mL 튜브를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 120 µL 반응을 위한 PCR 믹스를 준비합니다. 볼텍싱으로 조심스럽게 혼합합니다.

분자생물학의 표준 실험 지침(good practice)에 따라 주의 깊고 정확하게 수행하는 것이 중요합니다. 흰색 멀티웰 플레이트의 각 웰에 PCR 믹스 19 µL를 피펫팅합니다. 농도가 조절된 DNA 템플릿 1 µL를 추가한 다음, 실링 호일로 흰색 멀티웰 플레이트를 밀봉합니다.

적절한 어댑터가 포함된 멀티웰 플레이트용 로터가 장착된 표준 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 흰색 멀티웰 플레이트를 1,500 ×g에서 1분간 원심분리합니다. 흰색 멀티웰 플레이트를 HRM-PCR 기기에 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 기재된 PCR 조건으로 HRM-PCR 프로그램을 시작합니다.

HRM-PCR 반응 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HRM 분석을 수행하여 CR1 길이 다형성을 결정합니다. 서로 다른 CR1 동형단백질(isoform)을 가진 피험자의 게놈 DNA로부터 PCR로 증폭된 앰플리콘의 고해상도 용융(high-resolution melting) 후 소프트웨어를 사용하여 융합 곡선을 분석했습니다. 결과는 피험자의 동종형(allotypic) CR1 발현 표현형에 따라 피험자를 구별하는 곡선으로 나타납니다.

정규화 및 이동된 멜팅 곡선(normalized and shifted melting curves)과 정규화 및 온도 이동된 차이 플롯(normalized and temp-shifted difference plot)의 두 가지 표시 방식에서 알 수 있듯이, 곡선 프로파일은 CR1 star three, CR1 star one 그룹, CR1 star one, CR1 star two 그룹, CR1 star one 그룹, CR1 star two 그룹, 그리고 CR1 star two, CR1 star four 그룹에 따라 분포합니다. 이 곡선들은 CR1 길이 다형성 대립유전자에 해당합니다. 이 영상을 시청한 후에는 HRM-PCR을 통해 얻은 정밀한 곡선을 이용하여 CR1 길이 다형성의 유전자형을 어떻게 쉽게 분석하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 이미 CR1 길이가 알려진 유전자형의 참조 샘플이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기술은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 각 DNA 샘플에 대해 동일한 농도를 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이 절차 이후, 새로운 알려진 개인별 SNP(single nucleotide polymorphism)의 발견과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 원추형 DNA 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 집단 유전학 분야의 연구자들이 CR1 길이 다형성에서 병원체의 선택압을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 방법은 알츠하이머병의 발병 기전에서의 감수성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 전신성 홍반성 루푸스와 말라리아와 같은 다른 질병 연구에도 적용될 수 있습니다.