보체 수용체 1 길이 다형성 유전자 타이핑을위한 고해상도 Melting PCR : 알츠하이머 병 유전자 감수성 평가를위한 혁신적인 도구

이 방법의 전반적인 목표는 알츠하이머병과 같은 질병에 대한 감수성 평가에 사용하기 위해 유전자형 보체 수용체 1 길이 다형성을 유전자형화하여 질병 발병에서 CR1 동형의 역할을 더 잘 이해하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병의 발병기전과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신선한 혈액 샘플이 필요하지 않고 더 쉽고, 저렴하고, 빠르기 때문에 더 많은 인구 집단에 적용할 수 있다는 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 신선한 혈액 샘플에 필요한 시간과 필요성과 관련하여 서양 블롯을 수행하는 데 있어 어려움을 인식했을 때 처음 떠올랐습니다. 20마이크로리터의 proteinase K를 1.5ml 튜브 바닥에 피펫팅합니다. 그런 다음 튜브에 200마이크로리터의 샘플을 추가합니다.

샘플에 200마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 15초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 혼합 후 섭씨 56도의 수조에서 10분 동안 배양합니다.

1.5ml 튜브를 짧게 원심분리하여 뚜껑 안쪽의 방울을 제거합니다. 그런 다음 샘플에 100마이크로리터의 에탄올을 추가합니다. 이전과 같이 튜브를 잠시 원심분리하기 전에 15초 동안 펄스 볼텍싱으로 다시 혼합합니다.

다음으로, 혼합물을 2밀리리터 수집 튜브의 멤브레인 컬럼에 조심스럽게 적용합니다. 가장자리를 적시지 않고 캡을 닫고 1 분 동안 6, 000 번 G로 원심 분리기를 닫습니다. 멤브레인 컬럼을 깨끗한 2ml 수집 튜브에 넣고 여과액이 들어 있는 튜브를 버립니다.

멤브레인 컬럼을 조심스럽게 열고 테두리를 적시지 않도록 500마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 캡을 닫고 1분 동안 6, 000회 G에서 원심분리기를 닫습니다. 그런 다음 멤브레인 컬럼을 깨끗한 2ml 수집 튜브에 넣고 여과액이 들어 있는 튜브를 버립니다.

멤브레인 컬럼을 조심스럽게 연 후 테두리를 적시지 않고 500마이크로리터의 세척 버퍼 2를 추가합니다. 모자를 닫고 20, 000 시간 G에 3 분 동안 분리기를 두십시오. 그런 다음 멤브레인 컬럼을 새 2ml 수집 튜브에 넣고 다시 원심분리합니다.

원심분리 후 멤브레인 컬럼을 깨끗한 1.5ml 튜브에 넣고 여과액이 들어 있는 수집 튜브를 버립니다. 멤브레인 컬럼을 조심스럽게 열고 증류수 200마이크로리터를 추가합니다. 컬럼을 실온에서 5분 동안 배양한 후 6, 000회 G에서 1분 동안 원심분리합니다.

HRM-PCR 프로토콜을 수행하려면 먼저 1.5ml 튜브의 DNA 샘플을 물과 함께 마이크로리터당 10나노그램의 농도로 희석합니다. 다음으로, 1.5ml 튜브에 담은 해동된 프라이머 용액을 6마이크로몰과 같은 농도로 물로 희석합니다. HRM-PCR 키트 용액을 해동하고 모든 내용물의 회수를 보장하기 위해 와류로 조심스럽게 혼합합니다.

DNA 결합 염료, 염화마그네슘 및 물과 효소 혼합물이 들어 있는 세 개의 바이알을 미세 원심분리기에서 열기 전에 간단히 돌립니다. 실온의 1.5ml 튜브에서 구성 요소를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 120마이크로리터 반응을 위한 PCR 혼합물을 준비합니다. 볼텍싱으로 조심스럽게 섞습니다.

분자 생물학의 모범 사례에 따라 주의와 적용을 가지고 작업하는 것이 중요합니다. 피펫 19 마이크로 리터의 PCR은 흰색 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 혼합됩니다. 농도 조정 DNA 템플릿 1마이크로리터를 추가한 다음 흰색 멀티웰 플레이트를 밀봉 호일로 밀봉합니다.

적당한 접합기를 가진 다 좋은 판을 위한 회전자 를 포함하는 표준 그네 물통 분리기에 있는 500배 G에 1 분 동안 백색 다 우물 판을 원심분리기. 흰색 멀티웰 플레이트를 HRM-PCR 기기에 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 있는 PCR 조건으로 HRM-PCR 프로그램을 시작합니다.

HRM-PCR 반응 후 HRM 분석을 수행하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CR1 길이 다형성을 측정합니다. 융합 곡선은 서로 다른 CR1 동형을 가진 피험자의 게놈 DNA에서 PCR 유래 앰플리콘을 고분해능으로 용융한 후 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 그 결과 피험자를 동형형 CR1 발현 표현형에 따라 구별하는 곡선

정규화 및 이동된 용융 곡선과 정규화 및 온도 이동 차이 플롯의 두 가지 표시 모드에서 알 수 있듯이 곡선 프로파일은 CR1 별 3, CR1 별 1 그룹, CR1 별 1, CR1 별 2 그룹, CR1 별 1 그룹, CR1 별 2 그룹 및 CR1 별 2, CR1 스타 4 그룹. 이러한 곡선은 CR1 길이 다형성 대립유전자에 해당합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 HRM-PCR로 얻은 완벽한 곡선에 따라 CR1 길이 다형성을 쉽게 유전형화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이미 알려진 CR1 길이 유전자형의 참조 샘플이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 DNA 샘플에 대해 동일한 농도를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 새로 알려진 사설 SNP의 발견과 같은 추가 질문에 답하기 위해 원뿔형 DNA 염기서열 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 개발 이후, 이 기술은 집단 유전학 분야의 연구가 CR1 길이 다형성에서 병원체의 선택적 압력을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법은 알츠하이머병의 발병 기전에 대한 감수성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 전신 홍반성 루푸스 및 말라리아와 같은 질병의 다른 연구에도 적용할 수 있습니다.