방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

다음 고분해능 용융 실험의 전반적인 목표는 개별 샘플에서 저농도로 존재하는 돌연변이 대립유전자의 검출 감도를 높이는 것입니다. 이는 먼저 주형을 필요한 부피와 농도로 희석하여 추출된 DNA를 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 템플릿 프로브 제품을 증가시키기 위해 정방향 및 역방향 프라이머의 비대칭 비율로 분석을 준비하는 것입니다.

반응을 준비한 후, 어닐링 온도는 야생형 또는 돌연변이 주형에 결합할 때 프로브의 용융 온도 사이에서 설정됩니다. 마지막 단계는 적절한 HRM 플랫폼에서 증폭된 산물을 분석하는 것입니다. 궁극적으로 돌연변이 대립유전자 증폭 바이어스와 프로브 기반 비대칭 PCR을 통해 샘플에 존재하는 저농도에서 까다로운 SNP 돌연변이를 보다 민감하게 검출할 수 있습니다.

이렇게 증가된 민감도는 집단의 돌연변이 감시에 유용합니다. 표준 고해상도 용융 또는 tac man 유전형 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 낮은 농도로 존재하는 대립유전자에 대한 감도를 높일 수 있고 게놈에서 서로 근접한 SNP의 유전형 분석을 가능하게 한다는 것입니다. 이 방법은 말라리아 기생충의 약물 내성 확산에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 HIV와 같은 다른 감염성 질환 유형의 감시 또는 세포 집단에서 희귀한 암 변이체 감지와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 사람은 Caitlin Durphy입니다. 우리 연구실의 기술자입니다.

고분해능 용융 또는 HRM을 위한 템플릿은 현장 현장 연구에 참여하는 환자의 혈액에서 직접 얻은 plasmodium falciparum 샘플로 준비됩니다. 샘플은 여과지, 신속한 검출 테스트 또는 펠릿 적혈구 샘플로 저장할 수 있으며 시험관 내에서 성장하도록 배양할 수도 있습니다. 분석을 위한 일부 표준 실험실 균주는 말라리아 연구 및 참조 시약 리소스 센터에서 주문할 수 있으며, 샘플은 전혈, 적혈구 또는 여과지에서 추출하거나 펠릿화된 적혈구에서 직접 사용하거나 펠릿화된 적혈구에서 직접 증폭하기 위해 배양할 수 있습니다.

먼저 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)의 절차에 따라 얇은 도말 현미경을 사용하여 적혈구의 파라를 결정합니다. 파라가 0.5% 이상인 적혈구를 1개씩 희석하여 400으로 만듭니다. TE에서는 1개의 변동성으로 인해 양성 및 음성 대조군이 항상 HRM 분석에 포함되어야 하기 때문에 각 5-10마이크로리터 반응에 대해 3마이크로리터의 희석된 적혈구를 사용합니다.

플라스미드 1마이크로리터 희석액당 10 피코그램에서 10 나노그램 또는 염기서열이 검증된 싹둑 유전자형을 양성 트롤로 준비합니다. 증폭 반응을 위한 템플릿 없음 음성 대조군으로 PCR 등급의 물을 사용하십시오. 프라이머 및 프로브의 작업 재고 10개를 준비하여 이 절차를 시작합니다.

96개의 웰 플레이트, 384개의 웰 플레이트, 8개의 튜브 스트립 또는 유리 모세관을 사용하는 분석에도 동일한 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 그러나 이 시연의 목적을 위해 96개의 웰 플레이트와 유리 모세관만 사용됩니다. 이 표는 차단된 프로브 기반 HRM 유전형 분석에 대한 권장 10 x 작업 재고 농도와 최종 농도를 보여줍니다.

각각에 대한 반응 혼합물을 준비합니다. 글쎄, 10 x 작업 스톡 정방향 및 역방향 프라이머와 프로브 각각을 1 마이크로 리터씩 추가합니다. 4-5마이크로리터의 HRM 마스터는 1마이크로리터의 템플릿과 PCR 등급의 물을 혼합하여 총 반응 부피가 10마이크로리터입니다.

각 유리 모세관에 대해 동일한 작업을 수행합니다. 플레이트와 유리 모세관을 덮습니다. 플레이트 기반 증폭에는 광학 플레이트 씰을 사용하고 모세관 기반 시스템에는 플라스틱 캡을 사용하십시오.

적용 범위가 완전하고 플레이트와 캡이 증발을 방지하기 위해 완전히 밀봉되고 고정되어 있는지 확인하십시오. 증폭 중. 샘플을 회전시켜 기포를 제거합니다.

탁상용 원심 분리기에서 1, 800 회 3 분 동안 플레이트를 돌립니다.G. 피코 퍼지에서 유리 모세관을 10-15 초 동안 돌립니다. 반응 플레이트와 유리 모세관을 열 순환기에 넣고 표준 차단 프로브 또는 MAAB 증폭 프로토콜을 실행합니다. PCR 증폭 후 시스템 소프트웨어 인터페이스에서 용융 분석을 진행합니다.

플레이트를 섭씨 40도에서 80도까지 용융하여 프로브와 앰플리콘 용융 피크를 모두 생성합니다. 광 순환기 four 80의 첫 번째 단계: 용융 분석은 온도 보기에 대한 정규화된 형광의 음의 도함수에서 정규화하는 것입니다. 정규화 막대를 이동하여 프로브 용융 영역을 둘러쌉니다.

프로브 용융 영역은 두 용융 영역 중 더 낮은 온도입니다. 정규화 막대는 용융 피크의 베이스에 있어야 합니다. 정규화 후 그룹 계산을 선택하여 필요한 경우 샘플을 그룹에 자동으로 할당하고 샘플을 특정 그룹에 수동으로 재할당합니다.

증폭되지 않았거나 용융 피크가 들쭉날쭉한 샘플을 선택합니다. 그런 다음 새 통화로 이동하여 부정을 선택합니다. 잘못 분류된 나머지 샘플을 선택한 후 새 호출로 이동하여 적절한 그룹을 선택하고 표준에 따라 각 그룹에 대한 유전자형 할당 변경을 클릭합니다.

계산된 그룹이 올바른지 확인한 후 그룹화 탭에서 그룹 이름 편집을 선택합니다.표준의 유전자형을 해당 색상 상자에 입력합니다. 예를 들어, 표준 3D 7이 알려진 C 유전자형을 가지고 있고 그룹 1에 속하는 경우 그룹 1의 모든 샘플은 유전자형 C 프레스 결과를 가지며 유전자형은 샘플 옆에 표시됩니다.

마지막으로, 추가 표본 모집단 분석을 위해 결과를 TXT 파일로 내보냅니다. light cycler 2.0에서 실행이 완료된 후 샘플 데이터 아래에 샘플 이름과 위치를 기록하고 분석을 시작하기 전에 용융 표준물질의 negative control 및 유전자형에 레이블을 지정합니다. 분석을 선택하고 용융 곡선 분석에서 유전형 분석을 선택하고 눌러 용융 분석을 시작합니다. 그래.

자동 그룹화의 민감도를 높이려면 용융 곡선 플롯의 표시가 표시되도록 모든 샘플을 선택합니다. 정규화 막대를 프로브 용융 피크의 상한 경계로 밉니다. 그룹 이름 아래의 각 그룹을 개별적으로 선택하여 샘플이 올바르게 그룹화되었는지 확인합니다.

모든 샘플을 선택하고 데이터를 복사한 다음 워크시트에 붙여넣어 각 샘플의 유전자형을 내보냅니다. 온도에 대한 정규화된 형광의 음의 도함수 플롯은 일반적으로 용융 피크를 시각화하고 유전자형을 결정하는 가장 간단한 방법입니다. 분석 창을 프로브 영역으로만 설정하면 특정 SNP에 해당하는 피크를 명확하게 구분할 수 있습니다.

완벽한 일치는 빨간색으로 표시된 더 높은 용융 피크를 생성합니다. SNP 불일치는 더 낮은 용융 온도를 갖는 반면, 두 대립유전자가 모두 샘플에 존재할 때 회색으로 표시됩니다. Prob 기반 HRM 분석은 두 대립유전자를 주황색으로 표시된 두 개의 피크 곡선으로 나타내며 단일 대립유전자 샘플과 일치하는 피크는 빨간색과 회색으로 표시되며, 증폭 중에 ealing 온도를 점진적으로 낮추면 poly genomic 또는 poly allelic 샘플에서 왼쪽 피크로 표시되는 돌연변이 대립유전자로 편향됩니다.

이 돌연변이 대립유전자 증폭 편향은 HRM 민감도를 초래하여 poly genomic 또는 poly allelic 샘플에서 1% 미만으로 존재하는 작은 대립유전자를 검출합니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 품질이 핵심이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 완충액 농도의 사소한 차이만으로도 HRM 곡선이 바뀔 수 있습니다.

컨트롤을 사용하는 것은 결과를 표준화하는 데 유용한 방법입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 prob 기반 비대칭 PCR 및 돌연변이 대립유전자 증폭 바이어스를 사용하여 다양한 샘플 유형에서 말라리아 SNP를 정확하고 민감하게 유전형 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.