Name: 방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 학습하세요 고해상도 녹는 분석법을 활용하여 말라리아의 단일 염기 다형성 유전자형을 민감하게 검출하는 방법을. 비대칭 PCR과 돌연변이 대립유전자 증폭 편향을 적용하여 저농도 돌연변이를 정확히 식별할 수 있습니다.

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저자는 기술 개발과 훈련의 지원을 위해 빌 &amp; 멜린다 게이츠 재단 감사합니다.

주 :이 프로토콜은 96 웰 플레이트, 8 튜브 스트립, 모세관 기반 시스템 (10 μL의 반응 부피)에 대한 양 및 농도를 포함한다; 그러나, HRM은 대응하는 모든 볼륨을 스케일링하여 5 μL의 반응 부피로 384 웰 플레이트 기반 시스템에서 수행 될 수있다. 대부분의 시스템에 대한 검색의 범위는 10 NG의 주형 DNA에 10 페이지입니다. 1. 템플릿을 준비 <ol><li> 혈액 필드 사이트 연구에 참여하는 환자에서 얻은 전체 혈액 저장, 펠렛 적혈구, 또는 필터 종이에 직접 말라리아 원충 샘플을 얻습니다. 참고 : 시료는 문화 적응 체외에서 성장을 할 수있다; 분석에 대한 몇 가지 표준 실험실 균주가 말라리아 연구 및 참조 시약 리소스 센터 (MR4에서 주문할 수 있습니다, 샘플 펠렛 적혈구 나 문화에서 직접 사용할 또는 전혈, 적혈구, 또는 여과지에서 추출 할 수있다. </li><li> DNA 추출여과지 또는 문화 적응 균주 참고 : HRM 소금 농도에 민감하다; 인해 가변 추출 방법에 농도 차이가 유의 용융 온도에 영향을 줄 수있다. 특정 최종 버퍼가 성공을위한 중요한 요소는 없지만, 표준 공통의 용출 또는 부유 버퍼 (즉, 물, 1X 테 [ &#39;낮은 테&#39;또는 &#39;DNA 서스펜션 버퍼&#39;: 10 mM 트리스 - CL, 0.10 mM의 EDTA]를 사용하거나 1X TE [10 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA]) 모든 샘플이 변칙 또는 일치하지 않는 용융 곡선을 방지하기 위해. <ol><li> 의 템플릿 희석을 준비 10 페이지 -10 NG 당 μL 표준 테, TE, 또는 물을 각각 10 μL 반응. </li></ol></li><li> 펠렛 적혈구에서 직접 증폭 <ol><li> 얇은 스미어 현미경을 사용하여 적혈구를 결정 기생충 참고 : 감염된 적혈구의 기생충을 결정하는 방법은 질병 통제 예방 센터 (CDC)에서 사용할 수 있습니다 : HTTP :<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> 0.5 % 1 위 parasitemias을 희석 : (400) PCR 등급 물, TE, 또는 테에서. 각 5 10 μL 반응에 3 μl를 사용합니다. </li></ol></li><li> 통제 수단 주 : HRM은 시퀀스 인구 (12)에 변형 검출 유전자 검사에 이용 될 수있다; 그러나, 정확한 유전자형은 표준 순서 검증 된 SNP를 포함하는이 심문이 필요합니다. 알려진 유전자형이 사용할 수있는 플라스미드 구조 또는 말라리아 분리합니다. 대부분의 애플리케이션의 경우, 3D7 (MRA MR4-151) 야생형 대조군으로 사용된다. 때문에 간 실행 변동성에 항상 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함한다. <ol><li> 긍정적 인 컨트롤 : - 시퀀스 확인 SNP 유전자형과 1 μL 플라스미드의 희석 또는 표준 당 10 ng의 10 페이지를 준비합니다. </li><li> 증폭 반응에 대한 노 템플릿 컨트롤 (NTC)으로 사용 된 PCR 등급 물 : 음성 제어 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR 증폭 <ol><li> 반응 혼합물을 준비 <ol><li> (선택 사항) 미네랄 오일 오버레이. 참고 : 일부 HRM 시스템은 플랫폼 독립 용융하고 증폭 동안 축합 생성물 및 증발을 방지하기 위해 가열 된 뚜껑이 없다. <ol><li> 반응 혼합물을로드하기 전에, 각 웰 플레이트에 20 μL 광 광유를 추가한다. </li></ol></li><li> 모든 분석의 10 배 작업 주식을 준비 <ol><li> 추천 10 배 근무하는 농도뿐만 아니라 차단 프로브 기반 HRM의 유전자형에 대한 최종 농도는 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 반응 혼합물을 준비 <ol><li> 웰 플레이트 또는 튜브의 각에, 앞으로 주식을 작업 1 μL 10 배 추가하고 프라이머 및 프로브, 4.0 역 - 10 μL 총 반응 부피 5.0 μL의 2.5 배 또는 2.0 배의 인사 마스터 믹스, 1 μL 템플릿 및 PCR 등급 물 . </li></ol></li><li> 커버 플레이트 또는 튜브 <ol><li> 광학 플레이트의 사용모세관 기반 시스템 용 플레이트 기반 증폭을위한 평가 보증 등급 (EAL), 스트립 튜브 기반 시스템 용 광학 캡, 플라스틱 캡. 수 있는지 범위는 완료되고 접시와 뚜껑을 완전히 밀봉 증폭 동안 증발을 방지하기 위해 고정된다. </li></ol></li><li> 스핀 샘플 <ol><li> 스핀 플레이트 1,800 XG에서 3 분, 기포를 제거하기 위해 미네랄 오일이 사용된다면 오일 및 수성 상을 분리. </li></ol></li></ol></li><li> 증폭 프로토콜 <ol><li> 열 자전거 타는 사람에 반응 플레이트 또는 튜브를 놓습니다. 실행 표준 차단 프로브 또는 MAAB 증폭 프로토콜 (표 각각 2, 3). 이들 방법 간의 어닐링 온도에서 차이가 있음에 유의해야한다. </li></ol></li></ol> 3. HRM 분석 <ol><li> 용해 <ol><li> PCR 증폭 한 후, 분석 녹는를 진행합니다. 내장이없는 증폭 독립 용융 시스템 (예., BioFire 국방 LightScanner 시스템)의 경우, 재HRM 상품에 열 자전거 타는 사람과 장소에서 증폭 판을 이동합니다. 두 프로브 및 앰플 리콘 용융 피크를 생성하기 위해 80 °의 C - 시스템 소프트웨어 인터페이스에서, 플레이트 (40)로부터 용융. 주 : 용융 및 분석 시간을 절약하기 위해, 용융 창이 단지 프로브 또는 앰플 리콘 용융 영역을위한 온도 범위를 커버하도록 단축 될 수있다. 필요하고 -20 ° C 또는 4 ℃에서 보관하는 경우 용해 후, 플레이트 및 튜브 재 용융 될 수있다. 만 4 ℃에서 보관 유리 튜브는 균열에서 튜브를 방지합니다. </li></ol></li><li> 용융 분석 <ol><li> 음의 샘플을 제거 <ol><li> 분석 소프트웨어 내에서 증폭 또는 그 들쭉날쭉 용융 피크를하지 않았다 추가 분석 샘플에서 제거합니다. 참고 : 각각의 실행 파일에 대한 분석의 모드를 선택한 후, 기기가 자동으로 그룹 양극과 음극 샘플을. 각각의 서브 세트를 유전형 전에 사용자가 수동으로 호출을 변경할 수있다. <ol><li> 하나 녹는에서곡선 또는 용융 피크 뷰, 곡선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 선택을 제거합니다. 잘못 분류 샘플을 선택한 후, &quot;새 통화&quot;해당 그룹을 선택하고 클릭으로 이동 &quot;변경을 적용합니다.&quot; </li></ol></li></ol></li><li> 정규화 <ol><li> 온도 (-df / DT) ( &#39;차이 곡선&#39;)보기에 대한 정규화 된 형광의 부정적인 유도체에서 지역 용융 프로브를 둘러싸 정상화 막대를 이동합니다. 주 : 프로브 영역이 두 영역의 융점보다 낮은 온도, 용융. 정규화 바는 용융 피크의베이스에 있어야합니다. </li></ol></li><li> 그룹을 계산 <ol><li> 정상화 후 선택 &#39;계산 그룹&#39;가 자동으로 그룹에 샘플을 할당합니다. 필요한 경우, 수동으로 특정 그룹에 샘플을 다시 할당. 참고 : 일부 분석 소프트웨어가 변경 될 수없는 고감도 임계 값을 가지고; 이러한 경우에, Software 시각적으로 다른에 속하는 다른 그룹에 샘플을 할당 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 유전자형 지정 <ol><li> 표준 (양성 대조군)에 따라 각 그룹에 대한 유전자형을 할당합니다. <ol><li> (그 정확한 변경 사항이 잘못 분류 샘플을 선택하고 &quot;새 통화&quot;옆에있는 드롭 박스에서 오른쪽 그룹을 선택하여 그룹화 탭에서 만든되지 않은 경우) 사용자가 계산 된 그룹이 올바른지 확인 후, &quot;편집 그룹 이름을 선택 그룹화 &quot;탭&quot;에서 &quot;. </li><li> 컬러 박스에 대응하는 표준의 유전자형을 시작 (3d7 표준은 공지 된 유전자형을 갖고 적색 그룹에있는 경우, 예를 들면, 붉은 기 유전자형을 갖는다). 를 눌러 &quot;OK&quot;를하고 결과를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 수출 결과 <ol><li> 수출 유전자형 추가 샘플 인구 분석을 위해 스프레드 시트로 호출합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

지속적인 HRM은 post-PCR 분석 단계; 따라서, 샘플 분석 셋업에서 전환을 추적하는 데 사용되는 형광 삽입 성 염료의 추가 도입으로, 표준 PCR 프로토콜과 유사한 이중 가닥 고해상도 용융 단계에서 단일 - 가닥 DNA에 관한 것이다. 성공적인 HRM 분석을위한 가장 중요한 인자는 강력한 PCR 생성물이다. 분석 설계 핵심이며, HRM 분석 설계에 최적화 된 여러 가지 도구는 상업적으로 온라인 13 사용할 수 있습니다. ~ 20 염기쌍을 동반 80-150 염기쌍의 증폭 길이는 프로브의 영역 내에서의 SNP뿐만 아니라 여러 개의 SNP의 일배 체형을 구분하기 위해 SNP 또는이자 작업 최선의 SNP를 위에 중심 프로브를 차단했습니다. 프로브는 3 &#39;C3의 스페이서 또는 3에서 2 염기쌍 미스 매치&#39;증폭을 방지하는 동안 연장 단부를 사용하여 차단 될 수있다. 프로브 또는 왓슨 크릭 주형 가닥과 일치하도록 설계 될 수있다; 선택허용되는 용융 피크를 생산하는 프로브 디자인을 결정하는 실제 테스트에 따라 달라집니다. 순방향 또는 역방향 프라이머 과량은 차단 프로브 어닐링 본쇄 증폭 산물을 생성하기 위하여 사용된다. 프로브는 순방향 가닥 서열을 포함한다면, 그 후, 프라이머는 과량으로 사용되는 역방향 통상 1 : 5 비율 및 역방향 가닥 일치 프로브 반대로. 마찬가지로, HRM은 충분하고 강력한 PCR 제품과 가장 잘 작동합니다. PCR 반응 최적화는 최적의 어닐링 온도를 결정하기 위해 구배 PCR 및 아가 로스 겔 또는 Bioanalyzer 분석을 요구한다. 주형 농도는 이러한 사전 증폭, 주형 (13)의 농도를 증가시키기 위해 낮은 프라이머 농도와 순환 수를 사용하는 모든 대상 바이어스 다중화 증폭 등의 방법을 사용하여 증가 될 수있다. 악기의 소수에 불과 MAAB와 호환됩니다. 유리 모세관 튜브의 열 특성 내가 사용N이 시스템은이 방법을 용이하게한다. 모세관의 작은 내부 직경뿐만 아니라 유리를 통해 신속한 열전달 플라스틱의 단열 특성에 기인 어닐링 변성 사이클 사이의 느린 변화 속도를 갖는 표준 PCR의 plasticware,보다 엄격한 온도 제어를 제공한다. 이 방법의 검출 감도는 야생형 및 돌연변이 체 대립 유전자 (10)의 혼합물에 돌연변이 대립 유전자의 1 % 미만 2-5% 감소 될 수있다. 인사는 암 유전자 변이에 대한 검사에 전염병 감시의 설정과 수많은 다양한 애플리케이션에서의 SNP 유전자형을위한, 손쉬운 효율적이며 경제적 인 도구입니다. 이러한 나노 로슈의 LightCycler 및 시스템 (480, 96)뿐만 아니라, 표준 증폭, 실시간, 및 복사 횟수 기능에 더하여 에코 실시간 PCR 시스템 제공 HRM 여러 다른 악기. 높은 처리량 기계를 사용하여, HRM의 바코드는 비용 레모든 시약 및 소모품을 포함하여 우리의 손에 분석 당 $ 0.50,보다의. 여기에 기술 된 상황에서, 필드 기반 애플리케이션 저감 인구 다이버 수입 기​​생충 종류의 검출, 감소 된 약물 감수성과 관련된 된 SNP 외관 및 확산을 포함하여 말라리아 관리 노력과 관련된 변화를 실시간 인구 감시를 허용한다. 방법에 대한 상세 검색은 말라리아 제거 및 근절을 향한 진행 상황을 알리기위한 유용한 추가 감도를 제공합니다.

말라리아 제어 및 근절에 대한 새로운 관심에도 불구하고, 말라리아는 거의 감염의 위험에 세계 인구의 절반 매년 550,000 명 이상의 사망자, 사하라 사막 이남의 아프리카 (1) 특히 아이들과 함께, 전 세계적으로 부담이 남아있다. 이러한 새로운 제어 및 박멸 프로그램은 감소 된 약물 감수성과 관련된 돌연변이 염기 서열 분석 말라리아 기생충 다수 증가 병독성과, 게놈 르네상스 지원 및 인구 특성 2,3- 용되었다. 단일 염기 다형성 (SNP가)는 가장 일반적으로 확인 된 유전자 변형 4-7 중입니다. 휴대용 SNP 지노 타이핑 방법은 현장에서 실시간 감시 및 인구 8 추적 제공. 개별 기생충 지문 이외에, &#39;분자 바코드&#39;또한 대립 유전자 빈도에서 극적인 시간적 변화를 검출하기 위해 사용되는뿐만 아니라 분산 효과적인 인구의 크기와 감염 9의 복잡성. 정보의 SNP의이 세트는 쉽게 많은 유전자형 플랫폼에 적응하는 동안, 높은 해상도 (HRM)를 분석에 특히 민감하고 간단한 조작과 낮은 비용으로 새로운 돌연변이 검출 시퀀싱 및 다른 비교 연구를 기반 분야에 매우 적합하다 용융 접근 방식은 자원이 부족한 설정에서 매력적이다. HRM는 형광 염료를 포함하고 표준 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)으로 시작한다. 이후의 PCR 분석은 용융 피크의 amplicon 용융 온도를 결정한다; 짧은 앰플 리콘의 단일 SNP 차이는 실질적인 융해 피크 온도 (Tm)의 차이가 발생할 수있다. 이 방법에 대한 몇 가지 개선은 (현재의 여러 대립 유전자와 샘플 polyg을 작은 돌연변이 대립 유전자를 클래스 IV (AT)의 SNP를 포함하여 SNP를 차별화하고, 감지하는 더 나은 유전자형 해상도를 제공enomic 감염). 먼저, 분석은 전달 및 상이한 농도로 존재 역방향 프라이머 외에 SNP 영역 위에 중심 짧은 프로브를 포함. 이 차단 된 프로브로 인해 프로브 템플릿 제품의 생산을 증가 비대칭 프라이머 농도에 PCR 증폭하는 동안, 그러나 과잉 생산 가닥에 결합되지 않습니다. 초과 템플릿 가닥에 결합 된 프로브로 구성이 분리 된 이중 가닥 증폭은 ~ 20-30 BP 있습니다; 자신은 크게 10 불일치 하나 또는 여러 개의 기본 프로브 템플릿과 관련된 훨씬 더 큰 Tm은 차이에 전체의 증폭 (80-150 BP) 납에 비해 길이를 감소. 둘째, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 (MAAB)는 바이어스에 polygenomic 감염 낮은 비율에 존재하는 돌연변이 대립 유전자를 향해 반응을 반응 어닐링 온도를 낮춘다. 어닐링 온도는 완벽 매치 (야생형)의 TMS 및 부정합 (돌연변이) 탐침간에 설정된에스. 이 온도에서, 야생형 대립 유전자의 바인딩은 증폭 따라서 모두 단일 샘플 (10)에 존재하는 돌연변이 대립 유전자 증폭을 향해 편향 그 불일치 당량에 비해 방해 충분히 안정적이다. 이러한 인사 관리 개선으로,이 기술은 현재보다 1에서 유행 남미 (11)의 감염과 새로운 돌연변이 검출 순서에서 서로 바로 옆에있는 여러 개의 SNP의 분화, 돌연변이와 관련된 기생충의 기원 추적 및 신원을 허용했다 polygenomic 샘플 (10)의 대립 유전자의 %. 증가 된 감도는 사전 제거 상태 및 약물 내성 신흥 위험이있는 사람들을 접근 지역에서 특히 중요하다. 빠르고 쉽게 구내 감도 저하와 관련된 수입 기​​생충의 SNP를 식별하는 능력이 감시 활동 및 제어 프로그램에 관한 알린다자신의 구현 증가 말라리아 퇴치 및 제거 노력을 식별 핫스팟의 효과. 이 프로토콜은의 방법에 대해 설명 차단 프로브를 기반 MAAB에 대한 증가 인사의 유전자형 감도.

<table><tbody><tr><td>LightScanner 마스터 믹스</td><td>BioFire Defense</td><td>HRLS-ASY-0003</td><td></td></tr><tr><td>경광 오일</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td>for BioFire Defense 플레이트 기반 HRM 시스템</td></tr><tr><td>TE</td><td>Teknova</td><td>T0226</td><td></td></tr><tr><td>Te</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td>TE 버퍼 with reduced EDTA</td></tr><tr><td>PCR grade water</td><td>Teknova</td><td>W3330</td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum 표준</td><td>MR4</td><td>MRA-151, 156, 205, 330</td><td>MR4.org 무료 게놈 DNA</td></tr><tr><td>광 스캐너 프라이머 설계 소프트웨어</td><td>HRM 분석 설계를위한</td><td>BioFire Defense</td><td></td> 상업용 소프트웨어</tr><tr><td>LightCycler 480 고해상도 용융 마스터 믹스</td><td>Roche</td><td>4909631001</td><td>LightCycler-480, -96 및 nano에 사용. 2x 농도</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2938A</td><td>Agilent 2100 바이오분석기</td></tr><tr><td>LightCycler 2.0</td><td>Roche</td><td>3531414001</td><td>MAAB 용 모세관 기반 시스템</td></tr><tr><td>LightCycler Nano</td><td>Roche</td><td>6407773001</td><td>Strip 튜브 기반 HRM 및 증폭</td></tr><tr><td>LightCycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>스트립 튜브 및 플레이트 기반 HRM 및 증폭</td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>플레이트 기반 HRM (96 및 384- 웰 플레이트) 및 증폭</td></tr><tr><td>LightScanner-96</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0011</td><td>플레이트 기반 HRM(96-well)&nbsp;</td></tr><tr><td>LightScanner-384</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0001</td><td>플레이트 기반 HRM (96-well)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>HRM용 96-웰 플레이트 (LightCycler</td></tr><tr><td>384-웰 플레이트</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td>HRM용 384-웰 플레이트 (LightCycler)</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-9665&nbsp;</td><td>HRM용 96웰 플레이트(LightScanner)</td></tr><tr><td>384웰 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-3865&nbsp;</td><td>HRM용 384웰 플레이트(LightScanner)</td></tr><tr><td>LightCycler 8-튜브 스트립 (투명)</td><td>Roche</td><td>6327672001</td><td>스트립 튜브 HRM (Light Cycler 96 및 Light Cycler Nano)</td></tr><tr><td>용 LightCycler 모세 필러리 (20 &mu; l)</td> <td>HRM</td>광학 플레이트 씰 용 <td>Roche</td><td>4929292001</td> 모세관</tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td>다른 브랜드도 작동합니다</td></tr></tbody></table>.

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

박멸의 수십에도 불구하고, 말라리아는 글로벌 부담이 남아있다. 지역 제거 및 글로벌 박멸에 최근 새롭게 관심은 항 말라리아 약물로 감소 감수성과 관련된 지리적 인구의 특성뿐만 아니라 변화를 포함하여 말라리아에 대한 책임 말라리아 기생충 종에 대한 증가 게놈 정보를 수반하고있다. 하나의 일반적인 유전 적 변이, 단일 염기 다형성 (SNP가)는 기생충 유전자형을위한 매력적인 목표를 제공합니다. 이 마커는 약물 내성 마커를 추적뿐만 아니라하지 약물 또는 다른 선택적 압력에서 마커를 사용하여 기생충 인구를 추적뿐만 아니라 유용하다. SNP 지노 타이핑 방법은 약제 내성을 추적 할뿐만 아니라, 특히 eliminat 가까워 영역에서 말라리아 관리 노력에 응답하여, 인구 감시 개별 기생충 지문 할 수있는 능력을 제공한다이온 상태. 정보의 SNP 특정 유전자형 기술에 얽매이다가 발견되었지만, 고해상도 용융 (HRM) 분석에 필드 기반의 연구에 특히 적합하다. 하나의 표지 된 프로브의 개별의 SNP를 필요 복수 게놈 (polygenomic)가 포함되어 샘플의 SNP를 검출하기 위해 기껏​​해야 10 %의 민감도를 제공하는 표준 형광 프로브 기반 방법에 비해, HRM 2-5 %의 감도를 제공한다. 이러한 차단 프로브 및 비대칭 프라이머 농도뿐만 아니라 사소한 대립 유전자의 증폭으로 바이어스 PCR로 증폭 어닐링 온도의 최적화 등의 인사에 대한 수정은 더 HRM의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 감도 향상 특정 분석에 의존하지만, 우리는 마이너 대립 유전자의 1 % 미만으로 검출 감도를 증가했다. 말라리아 박멸에 접근 지역에서 신흥 또는 수입 약제 내성의 조기 발견 홍보에 필수적이다ompt 응답. 마찬가지로 polygenomic 감염을 감지하고 애매한 로컬 저장소에서 가져온 기생충 유형을 구별하는 능력은 제어 프로그램을 알릴 수있다. 이 원고는 또한 환자 샘플에서 polygenomic 감염을 확인하기 위해 감도를 증가 고해상도 용융 기술에 대한 수정 사항을 설명합니다.

데이터 분석 소프트웨어 및 장비에 따라 여러 가지 방법으로 시각화 될 수있다. 전형적으로, 온도 결과에 대해 온도 (-df / DT)에 대해 정규화 된 형광 마이너스 유도체의 플롯은 용융 피크를 가시화하고 유전자형을 결정하는 가장 간단하다. 전체 용융 창 (40 ° C-80 ° C). 양쪽 앰플 리콘과 용융 프로브 영역 초래 한 두 영역에 대한 정규화 용융 피크의 일 예를 나타낸다 것이다. 특정 SNP에 대응 피크의 명확한 분화 단지 프로브 영역 결과 분석 윈도우를 설정 (도 2). 프로브 기반의 분석은 명확하게 동형 접합 SNP 피크 (그림 3)과 일치 용융 온도와 각 피크로 두 대립 유전자의 존재를 보여줍니다. 그림 4는 progressi를 보여줍니다vely 혼합 대립 유전자 (도 4b)의 집단에서 돌연변이 대립 유전자에 대한 감도 증가의 결과로, 돌연변이 체 대립 유전자 (좌측 피크) (도 4a)을 향해 바이어스 증폭 (MAAB) 결과 중 어닐링 온도를 감소시킨다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> 분석 될 수있는 두 프로브 (저온)에서 넓은 용융 결과 창을 통해 온도에 대해 정규화 된 형광의 음 도함수 플롯도 1 프로브 및 앰플 리콘 용융 영역. 앰플 리콘과 용융 피크. (. 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> SNP 불일치 (회색) 낮은 용융 온도를하면서 그림 2. 프로브 용융 피크. 완벽한 일치 (일반적으로 야생 형 대립 유전자가), 높은 용융 피크 (적색) 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> 두 대립 유전자는 샘플에 존재하는 경우, 피크 녹는 그림 3. Polygenomic은., 프로브 기반 HRM 분석은 단일 대립 유전자 샘플 (빨간색과 회색)과 일치 봉우리와 두 개의 피크 곡선 (오렌지)와 같은 두 대립 유전자를 나타냅니다. (. 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">큰 V를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 ersion. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> 그림 4. 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 (MAAB). A. 점진적으로 피크 polygenomic 또는 polyallelic 샘플에서 돌연변이 (저온) 대립 유전자에 대응하는 방향으로 융해 피크 반응이 증폭 어닐링 온도를 낮추는 편향. B. MAAB는 polygenomic 또는 polyallelic 시료에서 1 % 미만으로 존재 마이너 대립 유전자를 검출하기 위해 HRM 민감성을 초래한다. (. 파트 B는 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 프로브 기반의 고해상도 녹는 증폭 반응의 표 1 세트입니다. <table><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 다시 당 볼륨행동 (96 웰 플레이트 및 모세관) </td><td> 반응 당 볼륨 (384 웰 플레이트) </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> HRM 마스터 믹스 </td><td> 4-5 μL </td><td> 2-2.5 μL </td><td> 1 개 </td></tr><tr><td> 10 × 초과 프라이머 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.50 μM </td></tr><tr><td> 10 × 다른 프라이머 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5μl </td><td> 0.1 μM </td></tr><tr><td> 10 배 프로브 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.40 μM </td></tr><tr><td> PCR 등급 물 </td><td> 1-2 μL </td><td> 0.5 μL </td><td></td></tr><tr><td> 템플릿 DNA </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.01 NG / μL </td></tr><tr><td></td><td> 10 μL </td><td> 5 μL </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. STANDARD 고해상도 녹는 증폭 조건. <table><tbody><tr><td> 온도 </td><td> 시간 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 95 ° C </td><td> 120 초 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 68 ° C를 * </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 초 </td></tr></tbody></table> *이 온도의 증폭에 의존 표 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 3. 증폭 조건. <table><tbody><tr><td> 온도 </td><td> 시간 </td><td> 사이클 </td><td> 램프 속도 </td><td> 획득 모드 </td><td> 분석 모드 </td></tr><tr><td> 변성하다 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td><td> 1 </td><td> (20) </td><td> 없음 </TD&gt; <td> 없음 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 2 초 </td><td rowspan="2"> (55) </td><td> (20) </td><td> 없음 </td><td rowspan="2"> 부량 </td></tr><tr><td> 56 ° C를 * </td><td> 15 초 </td><td> (20) </td><td> 단일 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 용해 </td><td> 40 ° C </td><td> 0 초 </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> 45 °의 C * </td><td> 0 초 </td><td rowspan="2"> 지속적인 </td><td rowspan="2"> 용해 </td></tr><tr><td> 90 °의 C * </td><td> 0 초 </td></tr></tbody></table> *이 온도의 증폭에 의존하고 MAAB을 수행 할 때 감소 될 것이다

고해상도 융점 분석은 이종 집단에서 단일 염기 다형성을 구별 할 수있는 능력을 제공하지만, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 샘플 내의 비교적 낮은 비율로 존재 대립 유전자를 검출하는 능력을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜은 고해상도 융점 분석의 감도를 향상 개선을 설명한다.

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

다음의 고해상도 멜트(high resolution melt) 실험의 전반적인 목표는 개별 시료 내에 낮은 농도로 존재하는 돌연변이 대립유전자의 검출 민감도를 높이는 것입니다. 이는 우선 템플릿을 필요한 부피와 농도로 희석하여 추출된 DNA를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 템플릿 프로브 생성물을 증가시키기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 비대칭 비율로 혼합하여 분석 시약을 준비하는 것입니다.반응액 준비 후, 어닐링 온도를 프로브가 야생형 또는 돌연변이 템플릿에 결합했을 때의 각 녹는 온도(melting temperature) 사이로 설정합니다. 마지막 단계는 적절한 HRM 플랫폼에서 증폭 산물을 분석하는 것입니다. 결과적으로 돌연변이 대립유전자 증폭 편향과 프로브 기반 비대칭 PCR을 통해 시료 내에 저농도로 존재하는 까다로운 SNP 돌연변이를 더욱 민감하게 검출할 수 있습니다.이러한 민감도의 향상은 집단 내 변이 감시에 유용합니다. 표준 고해상도 융해(high resolution melting) 분석이나 tac man 유전자형 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 저농도로 존재하는 대립유전자에 대해 향상된 민감도를 제공하며, 게놈상에서 서로 인접하게 위치한 SNP의 유전자형 분석이 가능하다는 점입니다. 또한, 이 방법은 말라리아 기생충의 약제 내성 확산에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.또한 이는 HIV와 같은 다른 유형의 감염성 질환 감시나 세포 집단 내의 희귀 암 변이 검출과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 시연은 저희 연구실의 기술자인 Caitlin Durphy가 진행하겠습니다.고해상도 용해(high resolution melting, HRM) 분석을 위한 템플릿은 현장 연구 참여 환자의 혈액에서 직접 얻은 Plasmodium falciparum 시료로 준비합니다. 시료는 여과지, 신속 진단 테스트기 또는 적혈구 펠렛 형태로 보관할 수 있으며, 일부 시료는 체외(in vitro) 성장을 위해 배양 적응 과정을 거칠 수 있습니다. 분석용 표준 실험실 균주는 말라리아 연구 및 참조 시약 자원 센터(malaria research and reference reagent resource center)에서 주문할 수 있습니다. 시료는 전혈, 적혈구 또는 여과지에서 추출하거나, 적혈구 펠렛 또는 배양액으로부터 직접 증폭하기 위해 적혈구 펠렛에서 직접 사용할 수 있습니다.먼저 질병관리청(Centers for Disease Control and Prevention)의 절차에 따라 박층 도말 현미경 검사로 적혈구의 기생충률(para)을 결정하십시오. 기생충률이 0.5% 이상인 적혈구는 1:400으로 희석합니다. 5~10 µL의 각 반응당 희석된 적혈구 3 µL를 TE 버퍼에 사용하며, 양성과 음성 대조군 간의 변동성으로 인해 HRM 분석에는 반드시 대조군을 포함해야 합니다.플라스미드 또는 서열이 검증된 snip 유전자형 표준물을 사용하여 1 µL당 10 pg에서 10 ng 농도의 희석액을 양성 대조군으로 준비합니다. 증폭 반응의 템플릿 결핍 음성 대조군으로는 PCR 등급의 물을 사용하십시오. 먼저 프라이머와 프로브의 10배 농도 작동 용액(working stock)을 준비하여 이 절차를 시작합니다.동일한 프로토콜을 96-well 플레이트, 384-well 플레이트, 8-튜브 스트립 또는 유리 모세관을 사용하는 분석에도 적용할 수 있습니다. 하지만 본 시연에서는 96-well 플레이트와 유리 모세관만 사용합니다. 이 표는 차단 프로브(blocked probe) 기반 HRM 유전형 분석을 위한 권장 10x 작업 표준액 농도와 최종 농도를 보여줍니다.각 웰에 반응 혼합물을 준비합니다. 10 x working stock 정방향 및 역방향 프라이머와 프로브를 각각 1 µL씩 첨가합니다. HRM 마스터 믹스 4~5 µL, 템플릿 1 µL, 그리고 PCR grade water를 추가하여 총 반응 부피를 10 µL로 맞춥니다.각 유리 모세관에 대해 동일하게 수행합니다. 플레이트와 유리 모세관을 덮습니다. 플레이트 기반 증폭에는 광학 플레이트 씰을 사용하고, 모세관 기반 시스템에는 플라스틱 캡을 사용하십시오.증발을 방지하기 위해 커버가 완전히 덮였는지, 플레이트와 캡이 완전히 밀봉되고 고정되었는지 확인하십시오. 증폭 과정 중에 샘플을 원심 분리하여 기포를 제거하십시오.벤치탑 원심분리기에서 플레이트를 1,800 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 유리 모세관은 피코 퓨지(pico fuge)에서 10~15초 동안 원심분리합니다. 반응 플레이트와 유리 모세관을 서멀 사이클러에 넣고 표준 블록 프로브 또는 MAAB 증폭 프로토콜을 실행합니다. PCR 증폭 후, 시스템 소프트웨어 인터페이스에서 융해 분석(melting analysis)을 진행합니다.플레이트를 40 °C에서 80 °C까지 가열하여 프로브와 앰플리콘의 용융 피크를 모두 생성합니다. LightCycler 480에서의 첫 번째 단계 용융 분석은 온도에 따른 정규화된 형광의 음의 미분값에 대한 정규화 과정입니다. 정규화 바를 이동시켜 프로브 용융 영역을 포함하도록 설정하십시오.프로브 융해 영역은 두 개의 융해 영역 중 온도가 낮은 영역입니다. 정규화 바는 융해 피크의 기저부에 위치해야 합니다. 정규화 후, 필요한 경우 'calculate groups'를 선택하여 샘플을 그룹에 자동으로 할당하거나, 특정 그룹에 샘플을 수동으로 재할당하십시오.증폭되지 않았거나 멜팅 피크가 불규칙한 샘플을 선택하십시오. 그런 다음 'new call'으로 이동하여 'negative'를 선택하십시오. 잘못 분류된 나머지 샘플들을 모두 선택한 후, 'new call'로 이동하여 적절한 그룹화를 선택하고 'apply change'를 클릭하십시오. 표준물을 바탕으로 각 그룹의 유전자형을 할당하십시오.계산된 그룹이 정확한지 확인한 후, grouping 탭에서 edit group names를 선택하십시오. 해당 색상 상자에 표준물질의 유전형을 입력하십시오. 예를 들어, 표준물질 3D seven의 유전형이 C로 알려져 있고 그룹 1에 속한다면, 그룹 1의 모든 샘플은 유전형 C가 됩니다. results를 누르면 샘플 옆에 유전형이 표시됩니다.마지막으로, 추가적인 시료 모집단 분석을 위해 결과를 TXT 파일로 내보냅니다. light cycler 2.0에서 분석이 완료되면, sample data 항목에 시료 이름과 위치를 기록합니다. 분석을 시작하기 전, 음성 대조군과 멜팅 표준물질의 유전형을 표시하십시오. Analysis를 선택하고 melting curve analysis에서 genotyping을 선택한 후 Okay를 눌러 멜트 분석을 시작합니다.자동 그룹화의 민감도를 높이려면, 모든 샘플을 선택하여 멜팅 커브 플롯에 표시되도록 합니다. 정규화 바를 프로브 멜팅 피크의 상단 경계로 드래그합니다. 그룹 이름 아래의 각 그룹을 개별적으로 선택하여 샘플들이 올바르게 그룹화되었는지 확인합니다.모든 샘플을 선택하고 데이터를 복사하여 워크시트에 붙여넣어 각 샘플의 유전자형을 내보내십시오. 온도에 따른 정규화된 형광의 음의 미분 도표는 일반적으로 멜팅 피크를 시각화하고 유전자형을 결정하는 가장 간단한 방법입니다. 분석 창을 프로브 영역으로만 설정하면 특정 SNP에 해당하는 피크를 명확하게 구분할 수 있습니다.완전 일치(Perfect match)의 경우 빨간색으로 표시된 더 높은 용해 피크가 나타납니다. 반면, 샘플에 두 대립유전자가 모두 존재하는 경우 SNP 불일치(mismatch)는 회색으로 표시된 더 낮은 용해 온도를 갖습니다. 확률 기반 HRM 분석은 두 대립유전자를 주황색의 두 피크 곡선으로 나타내며, 단일 대립유전자 샘플과 일치하는 피크는 각각 빨간색과 회색으로 표시됩니다. 증폭 과정에서 용해 온도가 점진적으로 낮아지면, 폴리 게놈(poly genomic) 또는 다중 대립유전자(poly allelic) 샘플에서 변이 대립유전자에 편향되어 왼쪽 피크로 나타나게 됩니다.이러한 돌연변이 대립유전자 증폭 편향은 폴리 게놈 또는 다중 대립유전자 샘플 내에 1% 미만으로 존재하는 소수 대립유전자를 검출하는 HRM 민감도로 이어집니다. 이 절차를 수행할 때 샘플의 품질이 핵심이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 완충액 농도의 미세한 차이로 인해 HRM 곡선이 이동할 수 있습니다.대조군을 사용하는 것은 결과를 표준화하는 유용한 방법입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 프로브 기반 비대칭 PCR과 돌연변이 대립유전자 증폭 편향을 이용하여 다양한 샘플 유형에서 말라리아 SNP의 유전자형을 정확하고 민감하게 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

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