Name: 고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 배우세요 고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 제브라피쉬의 유전자형을 신속하게 선별하는 방법을. 이 기술은 단일 염기 변이와 작은 삽입·결실을 감지하는 데 뛰어난 민감도를 제공합니다.

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우리는 조언과 기술 지원에 대한 Blaschke, Grunwald가, 그리고 비트 버 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 JLB에 PCMC 재단, NIH R01 MH092256와 DP2 MH100008, 그리고 천 재단 연구 보조금 # 1 - 2013 년 - 425 년 3 월에 의해 지원된다.

1. DNA 준비 <ol><li> 50 mM의 KCl을 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8.3, 0.3 % 트윈 20, 0.3 % NP40 : DNA의 용해 버퍼를 준비한다. 사용 12 일에 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 신선한 테 K 추가. </li><li> 조직 컬렉션 : <ol><li> 성인 물고기 지느러미 클립 : <ol><li> 물고기를 마취 : 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션의 물고기를 놓습니다. 아가미의 움직임이 둔화 될 때까지 기다립니다. </li><li> 5-10 킴 와이프의 스택에 물고기를 넣고 멸균 면도날와 꼬리 지느러미, 2 ~ 3 mm의 작은 조각을 잘라. </li><li> 신속하게 복구를 위해 신선한 물을 표시 탱크에 물고기를 배치, 조심스럽게 핀 클립을 포함 할 탱크와 해당 관을 모두 레이블을 붙입니다. 물을 변경하고 매일 물고기를 먹이. </li><li> 멸균 피펫 팁과 핀 클립을 선택하고 100 ㎕의 DNA 용해 버퍼로 채워진 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 피펫 팁을 폐기하고, 날카로운 물건 용기에 면도날을 버린다. </li></ol></li><li> 배아의 꼬리 클립 : <ol><li> 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션으로 배아를 놓습니다. 2 분을 기다립니다. </li><li> 해부 현미경 집게로 꼬리의 조각을 잘라. </li><li> 30 μL의 DNA 용해 버퍼 가득 레이블 튜브에 꼬리를 넣습니다. </li><li> 신속하게 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 튜브에 배아를 넣어. </li><li> 배아 및 해당 꼬리 튜브 라벨 튜브. </li><li> 고정 용 4 ° C에서 하룻밤에 배아와 튜브를 저장합니다. </li><li> 오염을 최소화하기 위해 각 배아 사이에 밀리 Q 물과 킴 와이프를 사용하여 집게를 청소합니다. </li></ol></li><li> 전체 배아의 경우 : <ol><li> 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션으로 배아를 놓습니다. 2 분을 기다립니다. </li><li> 100 ㎕의 DNA 용해 버퍼로 채워진 튜브에 1-5 배아를 넣어. Dechorionation 필요가 없습니다. </li></ol></li></ol></li><li> DNA 소화 55 ° C에서 조직 (지느러미 또는 꼬리 클립 또는 태아)와 튜브를 품어밤새 12 4 시간 최대를위한. </li><li> 테 K에게 비활성화 15 분 12 ~ 95 ° C의 열 관. DNA는 바로 PCR에 사용, 또는 최대 3 개월 동안 -20 ° C에서 보관해야합니다. </li></ol> 2. PCR <ol><li> 디자인 프라이머 수동 또는 프라이머 설계 소프트웨어 (예 : Lightscanner 뇌관 디자인 소프트웨어 Biofire)에 의해. 르마위한 PCR 제품은 일반적으로 50-200 염기쌍이며 SNP 검출을위한 PCR 제품은 작고, 50-80 염기쌍이어야한다. </li><li> PCR <ol><li> 96도 또는 384 - 웰 플레이트에서 PCR 반응을 수행합니다. </li><li> 10 ㎕의 전체 볼륨을 사용하여 4 μL의 LightScanner 마스터 믹스 (0.1 U 핫 시작의 Taq-AB 중합 효소, 버퍼, 0.2 밀리미터의 dNTPs, 2 mM의 염화 마그네슘 및 1X 형광 이중 가닥 DNA 결합 염료), 5 pmol의 각 프라이머, 성인 꼬리 지느러미 또는 배아의 꼬리 (13)로부터 3 ㎕의 게놈 DNA 추출 1 ㎕의 게놈 DNA 템플릿. </li><li> 30 ㎕의 미네랄 오일을 커버 샘플. </lI&gt; <li> 광학적으로 투명 접착 씰 플레이트를 커버. </li><li> PCR 순환 상태 전형적인 조건은 95 ° C에서 5 분 10 초 30주기를 95 ° C이다 최적화, 60 ° C에서 25 초, 72 ° C에서 30 초, 30 초 동안 95 ° C로 끝나는로 냉각 15 ° C. </li><li> 스토어 PCR의 4 ° C에서 접시 또는 르마로 직접 진행합니다. </li><li> PCR의 초기 최적화 동안 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 크기를 분석하여 우리의 PCR 생성물을 확인하고, 상기 PCR 생성물의 서열 분석에 의해, 표시하는 경우. </li></ol></li></ol> 3. 르마 <ol><li> 열 플레이트 <ol><li> 용융 분석 시스템에서 접시를 놓습니다. </li><li> (LightScanner 소프트웨어는 전화-IT 2.0) 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 60 ~ 95 ° C.의 열 플레이트 </li><li> 새 데이터 저장소 파일을 만듭니다. </li></ol></li><li> 르마 데이터를 분석 (그림 2). 분석의 여러 단계가 가능합니다. 우리는 데이터 m의 가장 일반적으로 사용되는 세트를 보여anipulations. <ol><li> 부분적인 설정 부분의 탭을 클릭합니다. 샘플 우물을 선택합니다. </li><li> 표준화 <ol><li> 왼쪽 패널의 표준화 탭을 선택합니다. 형광 분산을 제거하려면 수동으로 사전 (초기)의 병렬 더블 라인을 배치하고 후 (최종) - 용융 영역 (그림 2C, 화살촉) 그림과 같이 1과 0으로 모든 샘플의 premelt 및 사후 용융 형광 신호를 정상화 각각 14. </li><li> 용융 영역 전후 멜트 라인 사이의 영역에 있지만, 선택되지 않도록 라인의 위치를​​ 조정한다. 일반적으로, 낮은 최소 및 낮은 최대 (어퍼 최소 어퍼 최대) 온도 선이 떨어져 약 1 ° C를 배치해야합니다. </li><li> 정상화 온도 위치를 선택 모든 샘플 (premelt 지역 및 최소 또는 후 용융 지역 없음 (0 %) 형광의 최대 또는 전체 (100 %)의 형광을 갖도록 POS 최선으로sible). 정규화는 융점과 0의 최소 형광의 융점부터 다음 수평에 가까운 라인까지 연장되어 하나의 형광 극대에서 거의 수평 라인 초래한다 상기 1 또는 0 아래 형광 수준이 없어야 . 예를 들어,도 2c에, 79-80 ° C.의 온도 범위를 사용 premelting 곡선을 정상화 </li></ol></li><li> 그룹화 / 클러스터링 녹는 온도 (그림 2C, 녹색 상자)을 기반으로 유전자형을 구분합니다. 그룹화를 선택합니다. <ol><li> 그룹화 섹션의 표준 선택 목록에서 Autogroup을 선택합니다. </li><li> 그룹화 섹션에서 감도 선택 목록에서 각각 하나의 전환 또는 다수의 전환과 프로필을 용융 보통 또는 높음을 선택합니다. </li><li> 선택 계산그룹화 섹션에서 그룹. </li><li> 파일 메뉴로 이동하고 결과를 저장하려면 저장을 클릭합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

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르마와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형을위한 강력한 기술입니다. 이 방법의 장점은 그것의 속도, 신뢰성, 및 심지어 점 돌연변이를 검출 감도이다. 전체 프로토콜은, 지느러미 클립에 용융 곡선 분석에서, 한 개인에 의해 8 시간 이내에서 수행 할 수 있습니다. 또한, 기술은 높은 처리량 스크리닝 의무이다 티듐 브로마이드의 사용을 필요로하지 않으며, 오염 문제를 최소화 할 수있는 모든 PCR 및 분석 단계는 밀봉된다. 이 기술에 대한 중요한 단계 PCR 증폭 물과 프라이머 디자인입니다. 르마의 PCR 제품의 일반적인 길이는 50 ~ 200 BP입니다. 짧은 증폭 산물은 감도를 증가 및 단일 염기 변화를 감지에 이상적입니다. 프로브; 밀접한 관련 PCR 생성물 종의 용융 곡선이 쉽게 구별 될 수없는 경우에, SNP 상보 및 3 &#39;말단에서 차단 작은 올리고 뉴클레오티드는 PCR 반응 (Lunaprobes에 포함될 수있다들). 프로브는 전방의 상이한 농도를 사용하여 비대칭...

제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 널리 개발 및 질병 모델링 연구에 사용되는 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 다수의 형질 전환 및 돌연변이 기술은 제브라 피쉬 위해 개발되었습니다. 일반적 Tol2 트랜스포존 시스템 (1)에 기초하여 피드 형질 전환 기술은, 다 DNA 단편 조립체이 향상된 복제 옵션과 결합되었다. 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)는 제브라 피쉬 3,4 모두 체세포와 생식 세포의 유전자 좌를 대상으로 사용되어왔다. 이 기술은 효율적으로 고주파 돌연변이 생성 및 세균 선 전송 3,4로, 유전자 변형 동물을 생성 할 수 있습니다. 이러한 발전에도 불구하고, 제브라 피쉬의 전통 유전자형 기술은 돌연변이 유발 및 형질 전환 도구의 모든 기능을 제한합니다. PCR은 때때로 restrictio 결합, 전기 영동 한 다음N 효소 소화가 널리 유전체 변형을 검출하기 위해 사용되지만, 시간 소모 및 작은 삽입 또는 삭제를 식별에 덜 민감하다. 의 TaqMan 프로브 분석은 높은 초기 비용을 가지고주의 최적화를 필요로합니다. PCR 제품의 시퀀싱은 며칠이 걸릴 대규모 검열을위한 실용적되지 않습니다 수 있습니다. 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석에만 제한 효소 인식 부위의 제한된 범위에 영향을주지의 SNP를 구별 할 수있다. 고해상도 녹는 분석 (르마), 폐 튜브 후 PCR 분석 방법은, 빠른 민감한, 저렴하고, 다수의 샘플을 심사하는 의무가 최근에 개발 된 방법이다. 르마는 SNP를, 돌연변이, 및 5-7 전이 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 르마는 이중 가닥의 DNA의 열 변성을 기준으로, 각각의 PCR 증폭 물이 특징 독특한 해리 (용융) 5을 가지고 있습니다. 샘플로 인해 T를 구별 할 수 있습니다O 서로 다른 염기 조성, GC 함량, 또는 길이는 일반적으로 형광 염료와 함께 만 이중 가닥 DNA (8)를 결합하는. 따라서, 르마는 다른 용융 곡선의 특성에 따라 서로 다른 유전자형을 구별 할 수 있습니다. 르마 저가의 시약을 사용하여 단일 단계 후 PCR 과정이므로, 높은 처리 전략을 위해 사용될 수있다. 르마 그래서 분석 다음 PCR 증폭 산물이 다른 애플리케이션에 사용될 수 있고, 비파괴이다. 르마 세포주, 마우스 및 인간 9-11 포함하여 많은 유기체 및 시스템에 적용되어왔다. 그것의 사용은 최근 징크 핑거 클레아 (ZFNs) 및 TALENs 6,12,13 의해 유도 돌연변이를 검출하기 위해 제브라 피쉬 설명되었다. 이 논문에서, 우리는 (그림 1) 배아와 성인 제브라 피쉬의 PCR 기반 르마을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은시를 포함하여, SNP를, 도입 유전자, 돌연변이를 검출하기에 적합하다ngle 기본 쌍 변경, 삽입, 또는 삭제.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>하드 쉘 PCR 96-웰 BLK/WHT 플레이트</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>HSP9665</td></tr><tr><td>www.bio-rad.com Microseal 'B' 접착 씰</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>www.bio-rad.com 96-well LightScanner 기기</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Call-IT 2.0이 있는 LightScanner 소프트웨어</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>고해상도 용융 분석 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner 프라이머 설계 소프트웨어</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI 소프트웨어</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

고해상도 용융 분석과 pcr을 이용하여 신속하고 효율적인 zebrafish의 유전자형

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

제브라 피쉬는, 개발을 공부하는 질병을 모델링하고, 약물 검사를 수행하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 유전 도구의 다양한 돌연변이를 유도하고 유전자 변형 라인을 생성하기위한 여러 전략을 포함하여, 도입되었습니다. 그러나, 대규모 스크리닝은 시간 소모적이고 노동 집약적이다 전통적인 유전자형 방법에 의해 제한된다. 여기에서 우리는 고해상도 융점 분석 (르마)와 결합 PCR 기준 지브라 피쉬 유전자형을 분석하는 기술을 설명한다. 이 방법은 오염 유물의 낮은 위험과 함께, 빠른 민감하고 저렴합니다. 르마와 PCR에 의한 유전자형 높은 처리량 검사 프로토콜에 포함, 배아 또는 성인 물고기에 사용할 수 있습니다.

프로토콜 (작업의 흐름도는도 1에 도시 됨) 며칠 동안 하루 동안 수행 또는 단계로 분리 될 수있다. DNA 추출은 PCR 증폭 산물의 용해 및 분석을 따른다. 앰플 리콘의 용융의 온도는 크기와 GC-내용에 따라 다르지만 일반적으로 시작하고 50 ˚ C ~ 95 ˚ C의 최종 온도 (그림 2A와 2B)에 적합합니다. 용융물이 수행되면, 형광 용융 곡선의 분석은 일반적으로 사용 전후의 용융 영역을 기준 (도 2C)로, 다양한 샘플 커브의 변화의 정상화를 필요로한다. 이 형광의 변화가 작은 실험의 변화와 관련이있는 다른 샘플 결과의 비교를 향상시킵니다. 정상화 온도 라인의 각 쌍 (그림 2C, 화살촉) 약 1 ˚ C 떨어져 배치해야합니다.용융 곡선의 프로파일을 도시 상부 그래프와 기준 샘플 (도 2D)에 비해 트랙 티브 차이를 보여주는 도면 하부의 그래프 :; 데이터 결과의 그룹핑...

고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시의 다양한 유전자형, 돌연변이 또는 형질전환 유전자를 신속하게 스크리닝하는 것입니다. 이는 먼저 얇게 잘라낸 조직 조각에서 DNA를 추출한 다음, PCR을 통해 DNA를 증폭함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 용해 곡선을 기록하면서 PCR 증폭 산물을 변성시키는 것이며, 이 곡선은 소프트웨어를 통해 분석됩니다.결과적으로, 서로 다른 유전자형에 대해 구별 가능한 용해 곡선이 나타납니다. 겔 전기영동 정량 PCR과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 단일 뉴클레오티드 변화, 작은 삽입 및 결손에 민감하며, 분석 속도가 빠르고 신뢰할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 제브라피쉬의 유전자형을 신속하고 효율적으로 분석하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 세포주, 생쥐 및 기타 동물물을 포함한 다른 시스템과 모델 생물에도 적용 가능합니다.DNA 준비 당일에 proteinase K를 용해 버퍼(lysis buffer)에 1 mg/mL 농도로 첨가하십시오. 조직은 얇은 클립을 사용하여 성어에서 채취하거나 배아 상태의 물고기에서 채취할 수 있습니다. 먼저 Trica 용액으로 물고기를 마취하십시오.아가미 움직임이 느려질 때까지 기다립니다. 그 다음 물고기를 티슈 더미 위에 올리고, 멸균 면도날을 사용하여 꼬리지느러미의 끝부분을 약 2~3 mm 길이로 소량 절단합니다. 회복을 위해 물고기를 신선한 물이 담긴 라벨이 부착된 수조에 빠르게 옮깁니다.멸균된 피펫 팁으로 지느러미 절편을 집어 100 µL의 DNA lysis buffer가 채워진 튜브로 옮깁니다. 동물의 수조와 튜브 모두에 라벨을 부착하고, 수집한 모든 조직을 55 °C에서 최소 4시간에서 최대 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 튜브를 95 °C에서 15분 동안 가열하여 ACE K 단백질을 불활성화합니다.이 샘플들은 즉시 PCR에 사용해야 하며, 최대 3개월 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 각 반응에 대해 96-well 또는 384-well 플레이트에서 PCR을 수행하십시오. 1µL 이하의 성체 DNA를 4µL의 light scanner와 혼합하십시오.최종 농도가 각각 5 pM인 형광 프로브와 프라이머를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. DNA가 배아에서 추출된 경우, 최대 3 µL까지 사용하십시오. 반응물에 30 µL의 미네랄 오일을 덮은 후 캡을 닫습니다.다음으로, 시료가 담긴 PCR 플레이트를 광학 투명 접착 씰로 덮습니다. 이제 PCR 사이클링 조건을 최적화합니다. 일반적인 조건 설정은 5분간의 변성(melt) 시간으로 시작합니다.이어서 10초의 변성(melt), 25초의 어닐링(kneeling) 시간 및 30초의 신장(elongation) 과정으로 구성된 PCR 사이클을 30회 반복합니다. 반응은 32번째 변성 단계를 추가하여 종료한 후 15 °C까지 냉각해야 합니다. 소프트웨어 내의 멜팅 분석 시스템에 PCR 플레이트를 배치하여 분석하십시오.온도를 설정하고 새로운 데이터 저장 파일을 생성하십시오. 서브셋을 설정하십시오. 화면 왼쪽 하단에서 샘플이 포함된 웰을 선택하십시오.형광 변이를 제거하기 위해 normalized 탭을 선택하십시오. prem, melt 및 post melt 영역에 평행한 이중선을 수동으로 배치하고, 모든 샘플의 premel 형광 신호는 1로, post melt 형광 신호는 0으로 정규화하십시오. 그다음, grouping을 먼저 선택하여 융해 온도에 따라 유전자형을 구분하십시오.그런 다음 표준 선택 목록에서 auto group을 선택하십시오. 그룹화 섹션에서 단일 전이 또는 다중 전이 멜팅 프로파일에 따라 각각 normal 또는 high를 선택하십시오. 이 항목들은 그룹화 섹션 아래의 민감도 선택 목록에 있습니다.이제 그룹화 섹션에서 계산 그룹을 선택한 다음, 파일 메뉴로 이동하여 저장 버튼을 클릭해 결과를 저장하십시오. 이 프로토콜은 하루 만에 수행하거나 여러 날에 걸쳐 단계별로 나누어 수행할 수 있습니다. PCR을 수행할 때 증폭 산물의 해리 온도는 크기와 GC 함량에 따라 달라지지만, 일반적으로 해리가 수행되면 시작 온도 60 °C와 종료 온도 95 °C가 적절합니다.형광 융해 곡선의 분석을 위해서는 일반적으로 융해 전후 영역을 표준으로 사용하여 서로 다른 시료 곡선의 변동성을 정규화해야 합니다. 이를 통해 형광 변동이 미세한 실험적 차이와 관련되어 있는 서로 다른 시료의 결과들을 더 효과적으로 비교할 수 있습니다. 정규화를 위한 각 온도선 쌍은 약 1°C 간격으로 배치해야 합니다.데이터는 멜트 곡선 프로파일 파일을 보여주는 그래프 또는 HRMA 분석 후 참조 시료와 비교하여 감산 차이 플롯(subtractive difference plot)을 보여주는 그래프의 두 가지 방식으로 표현될 수 있으며, 이를 통해 돌연변이나 트랜스진을 검출할 수 있습니다. EIF2B5 유전자의 두 가지 서로 다른 돌연변이가 빨간색과 파란색 곡선으로 표시되어 있습니다. 이러한 돌연변이 시료들은 표준 야생형 곡선과 비교했을 때 멜트 곡선의 형태에서 유의미한 차이가 나타나거나 형광 값의 변화가 있음으로써 식별됩니다.단일 배아 집단 내에서 네 가지 서로 다른 유전자형을 확인한 이 사례는 본 방법의 강력함과 민감도를 잘 보여줍니다. 숙달되면 이 기술은 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 제브라피쉬 유전자형의 효율적인 대규모 스크리닝을 위해 HRMA를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기사는 제브라피시 꼬리 클립에서 DNA를 추출하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 유전자형을 빠르고 효율적으로 분석하는 방법을 보여줍니다.

테일 클립에서 DNA 추출: 제브라피시 유전형 분석에 사용되는 방법

이 비디오에서는 용융 온도 분석을 기반으로 다양한 염기서열 길이의 DNA 단편의 길이 다형성을 결정하는 고해상도 용융 PCR 기술에 대해 설명합니다.

돌연변이 DNA 염기서열의 염기서열 변화를 결정하기 위한 고분해능 용융 PCR

고해상도 융점 분석은 이종 집단에서 단일 염기 다형성을 구별 할 수있는 능력을 제공하지만, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 샘플 내의 비교적 낮은 비율로 존재 대립 유전자를 검출하는 능력을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜은 고해상도 융점 분석의 감도를 향상 개선을 설명한다.

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Zebrafish 최근 연구 개발 하는 동안 DNA 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 사용 되었다. 여기 상세한 프로필 복제 타이밍에 zebrafish 태아를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 프로토콜 돌연변이, 개별 세포 유형, 질병 모델, 그리고 다른 종에서 복제 타이밍을 공부 하기 쉽게 적응 될 수 있다.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

유전자 편집 기술은 연구원이 상대적으로 쉽게 유전자 기능을 조사하기 위해 제브라피시 돌연변이를 생성할 수 있게 했습니다. 여기서, 우리는 제브라피시에서 의 회동 배아 하노티핑 및 정량화 신호를 수행하는 가이드를 제공한다. 이러한 편견없는 접근 방식은 situ 하이브리드화를 기반으로 한 현상별 분석에서 더 높은 정확도를 제공합니다.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

배우세요 고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 제브라피쉬의 유전자형을 신속하게 선별하는 방법을. 이 기술은 단일 염기 변이와 작은 삽입·결실을 감지하는 데 뛰어난 민감도를 제공합니다.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

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