고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시에서 다양한 유전자형, 돌연변이 또는 전이유전자를 신속하게 스크리닝하는 것입니다. 이것은 먼저 얇은 클립에서 DNA를 추출한 다음 PCR로 DNA를 증폭함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 PCR Amplicon을 변성시키는 동시에 용융 곡선을 기록하여 소프트웨어로 분석하는 것입니다.

궁극적으로 결과는 서로 다른 유전자형에 대해 구별 가능한 용융 곡선을 보여줍니다. 젤 전기 이동법 양 PCR를 같이 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은, 단 하나 뉴클레오티드 변화, 작은 삽입, 모든 결실에 과민하, 이 기술은 빠르고 믿을 수 있습니다입니다. 이 기술은 제브라 피쉬의 유전자형을 빠르고 효과적으로 분석하는 데 사용될 수 있지만, 세포주, 마우스 및 기타 동물을 포함한 다른 시스템 및 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다.

DNA 전처리 당일, 새로운 단백질 분해 효소 K를 밀리리터당 1mg의 농도로 용해 완충액에 첨가합니다. 조직은 얇은 클립을 사용하여 성체 물고기 또는 배아 물고기에서 수집할 수 있습니다. 먼저 Trica 용액에서 물고기를 마취시킵니다.

아가미의 움직임이 느려질 때까지 기다립니다. 그런 다음 물고기를 티슈 더미에 놓고 멸균 면도날로 약 2-3mm 길이의 꼬리 지느러미의 작은 조각을 잘라냅니다. 회수를 위해 담수가 담긴 라벨이 붙은 수조에 물고기를 빠르게 넣으십시오.

멸균 피펫 팁으로 핀 클립을 집어 100마이크로리터의 DNA 용해 완충액으로 채워진 튜브로 옮깁니다. 동물의 수조와 튜브에 모두 라벨을 붙이고, 수집된 모든 조직을 최소 4시간 동안 배양하고 배양 후 섭씨 55도에서 하룻밤까지 배양하십시오. 튜브를 섭씨 95도에서 15분 동안 가열하여 단백질 ACE K를 비활성화합니다.

이 샘플은 즉시 PCR에 사용해야 하지만 섭씨 영하 20도에서 최대 3개월 동안 보관할 수도 있습니다. 각 반응에 대해 96 또는 384 웰 플레이트에서 PCR을 수행합니다. 1마이크로리터 이하의 성인 DNA와 4마이크로리터의 광 스캐너를 결합하십시오.

형광 프로브와 프라이머를 각각 5피코 몰의 최종 농도로 함유한 마스터 믹스. DNA가 배아에서 나온 것이라면 최대 3마이크로리터를 사용하십시오. 30 마이크로 리터의 미네랄 오일로 반응을 덮은 다음 뚜껑을 닫으십시오.

다음으로, 주입된 PCR 플레이트를 광학적으로 투명한 접착 씰로 덮습니다. 이제 PCR 사이클링 조건을 최적화합니다. 일반적인 조건 세트는 5분의 용융 시간으로 시작합니다.

그 다음에는 10 초 용융, 25 초의 무릎 꿇기 시간 및 30 초의 연신율로 30 개의 PCR 사이클이 이어집니다. 반응은 32번째 용융을 추가한 다음 섭씨 15도로 냉각하여 끝나야 합니다. PCR 플레이트를 소프트웨어의 용융 분석 시스템에 배치하여 분석합니다.

온도를 설정하고 새 데이터 저장소 파일을 만듭니다. 하위 집합을 설정합니다. 화면 왼쪽 아래에 있는 샘플이 있는 웰을 선택합니다.

normalized 탭을 선택하여 형광 변형을 제거합니다. 평행한 이중선을 prem, melt 및 post melt 영역에 수동으로 배치하고 모든 샘플의 premel 및 post melt 형광 신호를 각각 1과 0으로 정규화합니다. 다음으로, 먼저 그룹화를 선택하여 용융 온도에 따라 유전자형을 구별합니다.

그런 다음 표준 선택 목록에서 자동 그룹을 선택합니다. 그룹화 섹션에서 Normal 또는 High를 선택하여 각각 단일 전이 또는 다중 전이가 있는 용융 프로파일을 선택합니다. 그룹화 섹션 아래의 민감도 선택 목록에 있습니다.

이제 그룹화 섹션에서 컴퓨팅 그룹을 선택한 다음 파일 메뉴로 이동하여 저장을 클릭하여 결과를 저장합니다. 프로토콜은 하루 동안 수행하거나 며칠에 걸쳐 단계적으로 분리할 수 있습니다. PCR을 수행할 때 앰플리콘의 용융 온도는 크기와 GC 함량에 따라 다르지만, 일반적으로 용융이 수행되면 섭씨 60도 및 섭씨 95도의 시작 및 종료 온도가 적절합니다.

형광 용융 곡선을 분석하려면 일반적으로 용융 전후 영역을 표준으로 사용하여 서로 다른 샘플 곡선의 변화를 정규화해야 합니다. 이는 형광의 변화가 사소한 실험적 변화와 관련된 다른 샘플의 결과를 비교하는 것을 개선합니다. 정규화를 위한 각 온도 라인 쌍은 약 섭씨 1도 간격으로 배치해야 합니다.

데이터는 용융 곡선 프로파일 파일을 보여주는 그래프 또는 HRMA 분석 후 돌연변이 또는 전이유전자를 검출할 수 있는 참조 샘플과 비교하여 빼기 차이 플롯을 보여주는 그래프로 두 가지 방법으로 나타낼 수 있습니다. EIF two B five 유전자의 두 가지 다른 돌연변이는 빨간색과 파란색 곡선으로 표시됩니다. 이러한 돌연변이 샘플은 표준 야생형 곡선과 비교할 때 용융 곡선, 모양 또는 형광 변화의 현저한 차이로 식별됩니다.

단일 배아 컬렉션에서 4개의 서로 다른 유전자형에 대한 이 예는 이 방법의 힘과 민감성을 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 제브라피시 유전자형의 효율적인 대규모 스크리닝을 위해 HRMA를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.