폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

이 폐 전이 분석의 전반적인 목표는 생존 가능한 폐 조직에서 전이성 골육종 세포의 성장을 직접 시각화하고 연구하는 것입니다. 이 방법은 골육종 전이 분야에서 매우 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 전이성 골육종 세포가 폐 미세 환경에서 어떻게 적응하고, 생존하고, 증식하는지.

이 기술의 주요 장점은 관련 3차원 마이크로 환경에서 전이성 골육종 세포 성장을 직접 시각화할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 기관을 캐뉼리로 삽입하고 폐를 팽창시키는 기술적으로 어려운 단계 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 종양 세포의 꼬리 정맥 주입 및 마우스 안락사는 표준 기관 지침에 따라 수행됩니다.

5분 후, 안락사된 쥐를 등쪽 누운 상태로 층류 후드의 멸균 패드에 놓고 작고 멸균된 가위를 사용하여 폐에 구멍을 뚫지 않고 기관 양쪽의 흉부 입구를 지나 흉골을 조심스럽게 절개합니다. 기관을 둘러싼 모든 근육과 결합 조직을 절개하는 것은 성공적인 캐뉼레이션을 위해 필수적입니다. 다음으로, 20게이지 IV 카테터를 사용하여 기관을 조심스럽게 캐뉼레이션하고 멸균 개선 봉합사를 사용하여 카테터와 기관을 느슨하게 고정합니다.

카테터의 IV 확장 세트를 중력 확산 장치의 10ml 주사기에 부착하고 중간 용액과 혼합된 섭씨 37도의 액체 아가로스를 주사기에 붓습니다. 폐가 완전히 팽창할 때까지 아가로스 용액으로 폐를 채웁니다. 그런 다음 캐뉼러를 제거하고 봉합사를 단단히 묶어 아가로스 용액의 누출을 방지합니다.

흡입 중에 폐를 그대로 유지하는 것이 중요합니다. 아가로스로 적절하게 흡입하고 뽑은 부분을 식히면 폐가 확장된 상태로 유지됩니다. 뽑기, 기관, 심장 및 폐를 적출하고 폐 표면에 구멍을 내거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.

항생제가 보충된 미리 냉각된 PBS 30ml에 조직을 넣고 아가로스가 응고되도록 합니다. 얼음 위에 20분 동안 얼음 위에 놓습니다. 20분 후, 가는 가위와 핀셋을 사용하여 폐를 3 x 1.5mm 조각으로 자르고 B 배지에 미리 담근 2 x 2cm 젤라틴 스폰지가 들어 있는 6웰 플레이트의 개별 웰에 슬라이스를 놓습니다.

이미징 당일, 실험 그룹에 따라 6웰 플레이트의 폐 조각을 컬럼의 멸균 35mm 유리 바닥 원형 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, 광시야 형광 현미경에서 2.5x 대물렌즈를 선택하고 대조군 조직 샘플 그룹에서 형광 종양 세포와 형광이 발하지 않은 배경 조직 사이에 최상의 대비를 제공하도록 이미징 매개변수를 설정합니다. 대조군 조직과 동일한 파라미터를 사용하여 모든 샘플을 이미지화합니다.

소프트웨어가 스케일 보정되지 않은 경우, 스케일 참조를 얻기 위해 폐 조직과 동일한 대물렌즈를 사용하여 마이크로미터를 이미지화하고 모든 이미지를 tif 파일로 저장합니다. 모든 이미지를 얻었으면 ImageJ의 이미지를 분석하려면 첫 번째 파일을 엽니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 전체 폐 절편의 윤곽을 그리면 전체 폐 절편의 면적을 결정할 수 있습니다.

프로세스를 선택하고 배경을 뺍니다. 롤링 볼 반경을 시작 값인 50픽셀로 설정합니다. 이 값은 배경 형광의 정도에 따라 달라지며 각 데이터 세트에 맞게 최적화해야 합니다.

밝은 배경의 선택을 취소해야 합니다. 이미지 및 유형, 8비트를 선택한 다음 이미지 및 속성을 선택하고 픽셀을 입력합니다. unit of length(길이 단위)에서 픽셀 너비, 픽셀 높이 및 복셀 깊이로 1을 입력합니다.

그런 다음 global을 확인하여 이러한 매개변수를 모든 후속 이미지에 적용합니다. 그런 다음 이미지를 선택한 다음 조정한 다음 임계값을 선택합니다. 기본 및 흑백을 강조 표시하고 슬라이더를 사용하여 대부분의 종양 세포가 정확하게 강조 표시되도록 이미지를 임계값

적용을 한 번 클릭하면 폐가 검게 변하고 형광 병변이 하얗게 변합니다. 그런 다음 적용을 두 번 클릭하여 모든 형광 구조가 검게 변하도록 이미지를 반전시킵니다. 병변의 수와 모양을 정량화하려면 분석을 선택하고 측정값을 설정하고 영역을 확인합니다.

다른 모든 상자의 선택을 취소합니다. 그런 다음 입자 분석을 선택하고 크기 필드에서 ImageJ에 의해 단일 세포로 결정된 가장 작은 병변 영역을 사용하여 프로그램이 열거할 모양의 범위를 설정합니다. day zero vehicle group의 이미지를 사용하여 단일 종양 세포로 간주되는 가장 작은 영역을 선택합니다.

하한이 설정되었으면 확인을 클릭합니다. 열거된 모든 모양과 면적 측정값을 포함하는 결과 창이 나타납니다. 그런 다음 결과 창의 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 합계 수학 함수를 사용하여 특정 폐 절편에 대한 전이성 병변의 모든 영역을 추가합니다.

높고 낮은 전이성 세포주에 대한 전이성 성향은 점진적 시점에 걸쳐 시각적으로 명백합니다. 보다 구체적으로 말하면, 이러한 현미경 이미지는 전이성이 높은 세포가 저전이성 세포주보다 얼마나 효율적으로 폐에 군집화할 수 있는지 보여줍니다. 이미지 데이터의 이미지 분석, 정량화 및 통계 분석을 통해 전이성이 높은 종양 세포가 폐 조직에 효율적으로 군집화할 수 있음을 확인할 수 있습니다.

반면 낮은 전이성 세포는 전혀 성장할 수 없습니다. 고배율 컨포칼 형광 현미경 검사는 종양 세포를 발현하는 EGFP에 비해 폐 실질 세포를 매우 세부적으로 시각화할 수 있습니다. 뿐만 아니라 이러한 미토콘드리아와 같은 세포 내 구조의 분석을 용이하게 합니다.

사용된 마우스의 수에 따라 이 기술을 적절하게 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 깨끗하고 멸균된 수술 장비로 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 쥐의 폐에서 전이 진행을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 절차에 따라 체외 세포 배양 분석 및 웨스턴 블로팅과 같은 다른 방법을 수행하여 암세포에 대한 유전자 넉다운 또는 약물 치료의 영향에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 폐 전이 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 암세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 바이오 레벨 안전성 2 실험실에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.