Name: 폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 학습하세요 폐 전이 분석(PuMA)을 통해 골육종 세포의 폐 조직 내 성장을 직접 관찰하고 연구하는 방법을. 이 기술은 3차원 미세환경에서 전이성 암 세포의 적응과 생존 메커니즘을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 박사 Arnulfo 멘도사 푸 마 기술에서 훈련을 제공 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리는이 연구의 과정에서 그들의 현미경의 사용을 제공 하기 위한 박사 Chand Khanna, 수잔이 필드 (NCI/NIH), 그리고 샘 Aparicio (기원전 암 기구)를 인정 하 고 싶습니다. 이 연구는 건강의 국가 학회, 소아 종양학 분기 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 (부분적으로) 지원 되었다. M.M.L.는 국립 연구소 건강 교내 방문 동료 프로그램의 (수상 15335)에 의해 지원 되었다 그리고 현재 전이 연구에서 조 앤 파커 친교에 의해 지원 됩니다. P.H.S.는 브리티시 컬럼비아 암 재단에 의해 지원 됩니다.

영상 데이터를 가져온 모든 동물 프로토콜 승인 동물 관리 및 사용 위원회 국립 암 연구소, 국립 보건원의 수행 했다. 모든 동물 프로토콜 설명 및 비디오 문서에서 브리티시 컬럼비아의 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 종양 세포 주입 및 푸 마 모델에 대 한 자료 준비
참고: 솔루션 및 셀의 양을 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 미디어 요리법을 표 1 과 표 2를 참조 하십시오.
<ol><li>전 37 oC 물 욕조에 15 mL 원뿔 튜브에 A-미디어의 5 mL 따뜻한.</li>
	<li>1.2% 낮은 녹는 agarose 솔루션을 (살 균 물)에 연구소 전자 레인지를 사용 하 여 녹 인 다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 녹은 agarose의 5 mL을 전송 하 고 37 oC 물 욕조에 따뜻한 유지. 37 oC 및 폐 insufflation 단계 전에 액체에서 녹은 agarose가 확인 합니다.</li>
	<li>미리 30 mL 세포 배양 학년 얼음 양동이에 1 X 펜/strep 보충 PBS의 진정.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 한 잘, 미리 B-미디어의 1.5 mL에 젤라틴 스폰지를 적시 게. 스펀지 폐 조각에 대 한 지원 앵커 것입니다.</li>
	<li>OS 셀은 약 70-90% 보장 절차의 날에 confluent. -합칠 경우 또는 미디어 오렌지 노란색 셀은 일반적으로 스트레스와 시점에서 생존 능력을 감소는 때문에 셀을 사용 하지 마십시오. 다리 셀 라인, MNNG와 호, 100 μ의 볼륨에서 5 x 105 1 마우스의 꼬리 정 맥에 주사에 사용 됩니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 하는 경우 그에 따라 고급.</li>
	<li>0.25 %trypsin-EDTA (3 mL T75 플라스 크 또는 10 cm 배양 접시에 2 mL)을 사용 하 여 종양 세포를 수확. 셀은 시작 하면 접시에서 해제, 완벽 한 미디어 트립 신-EDTA를 중화. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 세포 배양 학년 PBS로 한 번 씻어. PBS의 5 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>표준 방법으로 세포 수를 수행 합니다. 그것은 최고의 세포 현 탁 액의 손실을 자주 바늘 그리기 중 발생 이후 주입 시도 실패 실제로 필요한 것 보다 더 많은 세포 현 탁 액을 확인 하는.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 분석 결과 세포의 생존 능력을 평가 하기 위해 세포 현 탁 액의 샘플에 수행 합니다. 셀 표시 90% 생존 하는 경우에 진행 또는 더 높은.</li>
	<li>5 x 105 셀 100 μ의 볼륨을 주입. 준비 하려면이 금액의 2 배를 초과, 1 x 106 셀 한다 스핀 다운 되며 HBSS 0.2 mL에 resuspended.</li>
	<li>주입을 위한 쥐를 준비 하는 동안 얼음 양동이에 세포 현 탁 액을 놓습니다.</li>
</ol>2. 꼬리 정 맥 주입 및 폐 Insufflation
참고: 솔루션 및이이 섹션에 있는 셀 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 장비, 자료 및 다음 단계에서 사용 되는 수술 도구 목록에 대 한 표 3 및 표 4를 참조 하십시오.
<ol><li>더 눈에 띄게 명백한 그들의 꼬리 정 맥을 만들기 위하여 여성 마우스 (나이 6-8 주) 5 분 동안 열 램프 아래 따뜻한. Murine K7M2 또는 K12 셀 사용 Balb/c 마우스; 인간의 MG63.3, MG63, MNNG, 및 호 셀에 대 한 심한 결합 된 면역 결핍 쥐를 사용 합니다.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션은 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 균일 한 다는 것을 확인 하십시오. 신중 하 게 바늘 없이 1 mL 주사기로 세포 현 탁 액을 그립니다. 모자는 27와 주사기 바늘 게이지. 바늘 베벨은 바늘에 볼륨 표시와 같은 측면에 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>Restrainer에 마우스를 놓고 면봉 알코올 지우기와 꼬리.</li>
	<li>꼬리 정 맥 주사를 수행 하 고 셀 서 스 펜 션의 100 μ 주사를 진행 합니다. 주입 후 5 분 CO2 챔버에 마우스 놓고 (기관 동물 관리 위원회 개요)으로 안락사 표준 운영 절차를 시작 합니다. 자 궁 경부 전위 이후 절차는 기관 손상 됩니다 안락사의 수단으로 사용할 수 없습니다.</li>
	<li>일단 마우스를 안락사 insufflation agarose/A-미디어 솔루션 마우스 폐의 층 류 후드의 준비를 시작 합니다. 층 류 흐름 후드 내에서 살 균 패드와 함께 작업 영역을 설정 합니다. 이 패드에 소독된 기기, 4 카 테 터, IV 확장 세트, 및 중력 관류 장치 ( 보충 그림 1참조)를 넣을 것입니다.</li>
	<li>지 recumbancy에 마우스를 놓습니다. 메 마른 작은 위, 신중 하 게 흉 폭로 흉 골 밖으로 해 부. Agarose/A-미디어 솔루션 폐를 insufflate 하는 데 사용 될 것입니다 폐를 찌를 하지 주의 하십시오.</li>
	<li>때 흉 골 밖으로 해 부 해 부 양쪽에 흉부 입구 과거 기도. 멀리 주변 부드러운 조직 해 부에 의해 기도 노출 합니다.</li>
	<li>20 게이지 4 카 테 터와 기관지 cannulate 느슨하게 cannulated 기관지 주위 살 균 다 봉합 사를 사용 하 여 수술 매듭 넥타이.</li>
	<li>Catheterized 기도에서 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 설정 4 확장을 연결 합니다.</li>
	<li>1:1 혼합물으로 미리 데워 진된 37 oC agarose (5 mL) 및 A-미디어 (5 mL)을 결합. 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 액체 agarose/A-미디어 솔루션을 붓는 다. Insufflation agarose/A-미디어 솔루션으로 폐의, 이전 확장 집합의 전체 길이 agarose/A-미디어, 공기와 함께 폐 샘플의 실수로 insufflation 함으로써 negating와 준비 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>폐는 완전히 insufflated 때까지 폐 agarose/A-미디어 솔루션을 작성 합니다.</li>
	<li>일단 폐 insufflated 완벽 하 게는 정을 제거 하 고 기도 통해 agarase/A-미디어 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 수술 매듭을 단단히 묶어.</li>
	<li>가슴 구멍에서 당기기 (기관, 심장, 폐)에 밖으로 부를 진행 합니다. 빵 꾸 하지 주의 또는 폐의 표면 손상.</li>
	<li>장소 미리 냉장된 30 mL PBS의에서 (아니 특정 방향)에서 뽑은 1 X 펜/strep, 보충 하 고 20 분을 강화 하기 위해 agarose/A 미디어 허용.</li>
	<li>좋은 위, 핀셋, 그림 1A와 같이 폐 (3 m m x 1.5 m m)의 작은 조각을 잘라 사용 합니다. 작은 폐 조각은 수 수 쉽게 몇 군데 2.5 X 목표를 사용 하 여. 여러 조각은 실험 조건, 당 그룹 당 4-10 조각 일반적으로 자를 수 있습니다. 참고: 각 실험 그룹에 대 한 미리 B 미디어에 배어 2 x 2 cm 젤라틴 스폰지를 포함 된 별도 우물 (6 잘 플레이트)으로 폐 조각 놓습니다. 잘 당 미디어의 양을 1.5 mL 이어야 한다. 2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. 약물 연구에 대 한 미디어/약물 변화의 주파수 결정 하는 사용자입니다.</li>
</ol>3. Widefield 형광 이미징 폐 슬라이스 및 분석의
참고: widefield 형광에 대 한 이미징, 작은 조각 폐 섹션 2.5 X 목표를 사용 하 여 1 이미지에 맞추기 위해 (1.5 m m x 1 m m x 3)를 절단 됩니다.
Widefield 형광 현미경에서 이미지 수집:
<ol><li>폐 슬라이스는 일반적으로 0, 3, 7, 14 일 후 주입에서 몇 군데. 생물 캐비닛의 메 마른 환경에서 신중 하 게 폐 분할 영역 전송에서 젤라틴 스폰지 살 균 35 m m 유리 하단에 라운드 접시. 폐 조각에서 초과 하는 액체에서 소량으로 초과 하는 액체는 거울으로 서 행동 하 고 종양 세포에서 나오는 형광 빛을 반영 하는 것을 주의.</li>
	<li>그림 1A에서 묘사 된 비슷한 방식으로 폐 분할 영역을 정렬. 각 열은 다른 실험 상태를 나타내는 것 이다. 교차-오염 하지 폐는 핀셋으로 알아서. 70% 에탄올과 린스를 폐 다른 실험적인 그룹에서 분할 영역을 처리 하기 전에 건조 합니다.</li>
	<li>이미지 매개 변수를 최적화 (즉. 이득, 오프셋, 노출 시간, binning) 형광 종양 세포와 배경 폐 조직 제어 (치료 되지 않는 차량)에 사이 좋은 대조를 제공 하 그룹. 컨트롤 그룹에서 동일한 매개 변수를 사용 하 여 실험적인 그룹 이미지. Tiff 이미지 형식으로 저장 합니다.</li>
	<li>에 대 한 규모, 동일한 목표에는 마이크로미터의 디지털 사진을 찍을.</li>
	<li>이후 폐 자동 형광 시간이 지남에 따라, 이미징 매개 변수 해야 합니다 조정 제어 폐 각 이미징 세션. 한 세션에 대 한 이미징 매개 변수 않을 수 있습니다 반드시 최적의 후속 이미징 세션에 대 한.</li>
</ol>이미지 분석: 참고: 다음 이미지 처리 단계 ImageJ 1.51 h 소프트웨어 패키지 17할 수 있습니다.
<ol><li>ImageJ (그림 3A)에서 이미지 파일을 엽니다.</li>
	<li>배경 빼기: 과정 > 배경 빼기 > 롤링 볼 반경 50 픽셀 (시작), 선택을 취소 "빛 배경" (그림 3B).</li>
	<li>8 비트 형식으로 이미지 변환: 이미지 > 형식 > 8-비트 (그림 3C).</li>
	<li>단위를 픽셀로 설정: 이미지 > Enter "픽셀" 단위의 길이에 "픽셀 너비", "픽셀 높이", "복 깊이"에 1을 입력. "Global" 확인란을 다음 이미지에 적용 합니다.</li>
	<li>다각형 선택 도구를 사용 하 여 전체 폐 조각의 윤곽 고 총 폐 조각의 영역 (픽셀2)을 결정 합니다. 이 값은 폐의 백분율 종양 부담을 계산 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>임계값 이미지: 이미지 > 조정 > 임계값 > "기본" 및 "B & W" 강조 > 종양 세포의 대부분은 정확 하 게 강조 표시 되도록 임계값 이미지 슬라이더를 사용. 폐는 모든 검정, 및 형광 성 병 변은 흰색 흑인과 백인 이미지를 귀 착될 것 이다 "적용"을 누르면 (그림 3D). 두 번째 시간 "적용"을 누르면 모든 형광 구조는 지금 검은 모양 (그림 3E) 이미지를 반전 됩니다.</li>
	<li>병 변의 모양과 수의 정량화: 분석 > 측정 설정 > "지역"를 확인 하십시오. 다른 모든 상자를 선택 취소 합니다. 입자 분석 > 크기 (픽셀2): 0-무한 ImageJ 열거 하는 도형 범위를 나타냅니다. 경험적으로 하루 0 차량 이미지에는 단일 종양 셀 것으로 판단 되는 작은 병 변을 확인 합니다. 하한값으로이 단일 종양 세포의 영역을 사용 하 여 데이터 집합에는 나머지 이미지에 대 한. 이 문서에 소개 된 작품에 대 한 11 픽셀2 하한값으로 설정 됩니다. 비디오 예제에 제시 하는 작품에 대 한 24 픽셀2 하한값으로 설정 됩니다. "순환" 범위를 0-1로 둡니다. "표시"로 설정할 수 있습니다 "아무것도". 또는, "표시" 및 "설명"을 선택 하는 경우 모든 개요 도형 드로잉 생성 됩니다. 팝업 측정의 별도 창에 대 한 "표시 결과"를 확인 합니다. 필요한 경우, "관리자 추가" 상자를 체크 하는 데 나중에 참조할 저장 될 수 있다 투자 수익 관리자를 측정할 모든 셰이프 저장 됩니다. 확인을 누른 후 "결과" 창 포함 하는 모든 열거 모양 및 면적 측정 (그림 3 층) 나타납니다.</li>
	<li>복사 하는 스프레드시트에 "결과" 창에서 데이터를 붙여 넣습니다. Excel에서 SUM 수학 함수를 사용 하 여 해당 특정 폐 슬라이스에 대 한 전이성 병 변의 모든 분야를 요약. 폐 조각의 백분율 폐 종양 부담 평가, 폐 조각의 전체 면적에 의해 전이성 병 변의 영역의 합계를 나눕니다. 이 매개 변수는 일컬어 지역 일부 (A)는 언더우드 18여 더. 폐 종양 부담 = 폐 슬라이스의 전이성 병 변 지역/총 면적의 합</li>
	<li>제어 그룹 및 그룹 남은 폐 섹션의 나머지 부분에 대 한 폐 종양 부담을 계산 합니다. 0, 3, 7, 14 일 동안 그룹당 평균 폐 종양 부담을 플롯 합니다. 진보적인 시간 포인트에서 푸 마 모델에 성장 및 로우 전이성 인간 OS 셀의 대표 widefield 형광 사진 (그림 4A) 표시 됩니다. 시간이 지남에 따라 백분율 전이성 종양 부담에 배 변경 (0으로 정규화)을 보여주는 선 그래프 (그림 4B) 표시 됩니다.</li>
</ol>4. 푸 마 모델의 confocal 형광 이미징
참고: confocal 이미징, 조직 처리가 비슷합니다 그 이전 섹션에서 제외 하 고는 큰 폐 슬라이스 이미지 수를 더 ROIs 있도록 (완전 한 횡 근 섹션, 1-2 m m 두께) 잘립니다.
DAR4M와 폐 실질의 라벨:
<ol><li>폐 조각 10 μμM에서 DAR4M (HBSS)에서 37 ° c.에 45 분 동안 담가 DAR4M 라벨 폐의 세포 내에서 반응성 질소 종.</li>
	<li>외피의 45 분, 후 폐 조각 신선한 HBSS로 린스.</li>
	<li>요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.</li>
	<li>그림 5 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 5에 나열 됩니다.</li>
	<li>관심 영역에 대 한 Z-스택 취득. 나이 키스 트 샘플링에 대 한 제안된 Z 슬라이스 두께 사용 합니다. 3D 스택 DAR4M 표시 된 폐 조직에서 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 대표 영화 영화 1 과 보충 영화 1에 제공 됩니다.</li>
</ol>그림 5에 표시 된 예제에서는 confocal 이미지 이미징 세션 터미널 이었다. 경도 화상 진 찰이 필요한 경우 2 광자 또는 다 광자 갖춘된 confocal LSM 현미경 이미징의 사용 때문에 생활에 더 적은 photodamage 좋습니다 조직19,20. 푸 마 모델에서 미토 RFP 표현 MG63 세포 이미징:
<ol><li>1 단계와 2 미토 RFP 구조를 표현 하는 MG63 세포를 사용 하 여 윤곽선으로 푸 마 프로토콜을 수행 합니다.</li>
	<li>요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.</li>
	<li>그림 6 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 6에 나열 됩니다. 영화 2 에 추가 영화 2형광 미토 콘 드리 아를 제공 하는 빨간색과 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 3 차원 스택의 대표적인 영화.</li>
</ol>

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<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Metabolomics+uncovers+a+link+between+inositol+metabolism+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22+Oncotarget%22%5BJournal%5D)"> Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis.</a> Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

다음 기술 문서에서는 운영 체제에서 폐 식민지 공부에서 푸 마 모델의 몇 가지 실용적인 측면을 설명 합니다. 어디 연구 해야 합니다 여분의 처리 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계는 다음과 같습니다.
a) cannulation 기도 의입니다. 기도 주변 근육 및 결합 조직 해 부 동안 쉽게 손상 될 수 있습니다. 또한, 카 테 터의 바늘 기도 통해 쉽게 밀어 수 있습니다. 바늘의 경사는 캐 뉼 러를 삽입 하는 경우 기도 입력 하는 방법에 세심 한 관심을 지불 합니다.
b) puncturing 또는 폐의 표면에 손상을 입히기. 폐는 쉽게 구멍이 나 흉 골을 제거 하 고 흉 노출 동안가 위를 해 부 손상 될 수 있습니다. 가슴 구멍에서 당기기에 밖으로 해 부 할 때 주의 해야 합니다. Puncturing 또는 폐의 표면에 손상을 입히기를 발생 합니다 미디어 밖으로 누출 agarose/A는-액체는 폐의 공기를 빼는 것입니다.
<p...

전이성 osteosarcoma (OS)와 소아 환자에 대 한 향상 된 결과 여전히 중요 한 충족된 임상 필요 1남아 있습니다. 이 새로운 분자로-타겟 요법 개발의 중요성을 밑줄. 대상 종양 세포 증식 하지 전이성 질병, 그리고 이렇게 새로운 전략을 치료에 효과가 입증 된 기존의 chemotherapeutics 2전이성 과정 자체를 타겟으로 해야 합니다. 현재 문서에서는 상대적으로 새로운 유형의 비보 전 폐 전이 모델, 폐 전이 분석 결과 (푸 마) 멘도사와 동료3, 새로운 발견에 유용한 도구를 제공 하 여 개발의 실용적인 측면을 설명 합니다. OS 4,5에서 폐 전이 진행에서 분자 드라이버. 그러나 계속 하기 전에, 그것은 간단히, 전이의 몇 가지 현재 모델에 따라 터치 것 하 고 어떻게 푸 마 모델은 기존의 시험관에 비해 여러 이점을 제공 분석 실험.
전이 공부 하는 데 사용 하는 가장 실험적인 모델 특정 단계 또는 전이성 캐스케이드의 여러 단계를 정리 하는 생체 외에서 그리고 vivo에서 시스템의 구성. 이러한 단계를 포함: 1) 종양 세포 주변 혈관 (혈액 또는 임 파 액) 및 교통 순환, 내 기본 종양, 2) intravasation에서 마이그레이션 3) 보조 사이트, 4) 넘쳐 흐름 및 보조 사이트, 5) 형성에 생존에서 체포 micrometastases, 및 6)의 vascularized 전이 (그림 1)로 성장. 전이의 생체 외에서 모델 2 차원 (2D) 마이그레이션을 포함할 수 있으며 3 차원 (3D) Matrigel 침공 분석 실험에서 검토는 자세히 다른 곳 6. Vivo에서 모델에 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되 모델 시스템 포함: 1) 자발적 전이 모델 은 종양 세포가 저절로 전이성 세포 나 지방 종양을 형성 하는 특정 조직 유형으로 주입 하는 orthotopically 먼 사이트; 2) 실험 전이 모델 은 종양 세포는 혈관 상류의 대상 기관에 주사 된다. 예를 들어 한 꼬리 정 맥 주입의 종양 세포 개발 폐 전이5,,78. 다른 실험적인 전이 모델 비장 또는 간 전이9,10의 개발에 결과 mesenteric 정 맥으로 종양 세포의 주입을 포함 됩니다. 이러한 비보에 모델의 실용적인 고려 사항 웰 치 11자세히 설명 되어 있습니다. 또 다른 vivo 모델 소아 sarcomas에 전이 공부 하는 데 사용 로컬 종양 형성 및 자연 스러운 전이 폐 12,13에 귀착되는 신장 신장 subcapsular 종양 이식 모델이입니다. Intravital videomicroscopy 수 같은 더 기술적으로 까다로운 기술을 직접 시각화에 전이성 암 세포와 전이성 사이트의 microvasculature 간의 실시간, 상호 작용 (예. 폐 또는 간) 맥도날드14에 의해 설명 된 대로 및 Entenberg15또는 김 16에 의해 설명 된 대로 chorioallantoic 막에 암 셀 넘쳐 흐름.
푸 마 모델은 폐 조직 explant 비보, ex , 닫힌된 문화 시스템 어디 형광 종양 세포의 성장을 관찰 될 수 있다 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 한 달의 기간 동안 ( 그림 2A참조). 이 모델이 전이성 캐스케이드에서 폐 식민 (3 ~ 5 단계)의 초기 단계. 기존의 체 외에 모델을 통해 푸 마 모델의 주요 장점은: 1)에 경도 측정 폐 microenvironment 의 많은 기능을 유지 하는 3D microenvironment에 전이성 암 세포 성장 하는 기회 제공 vivo 3; 2) 푸 마 수 후보 유전자 또는 약물 치료의 최저 3D 폐 microenvironment;의 맥락에서 안티 전이성 활동을가지고 있는지를 평가 하는 연구원 3) 푸 마 모델은 유연한 형광 현미경 검사 법 (그림 2B)와 같은 플랫폼 widefield 형광 현미경 검사 법 또는 레이저 스캔 confocal 현미경 검사 법의 많은 유형으로, 각각의 예제 그림 2C & D에 표시 됩니다. 각각. 이 문서는 푸 마 모델의 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 전이성 성장에 경도 이미징 데이터를 얻기 위해 사용 하는 방법을 설명 합니다-표현, 인간의 높고 낮은 전이성 다리 셀 (MNNG와 호 셀, 각각)를 사용 하 여 낮은 확대 widefield의 형광 형광 성 염료는 폐 실질, 레이블 및 레이블 운영 체제에서 미토 콘 드리 아 유전자 기자 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하는 푸 마 모델에 셀 레드-형광 단백질 이미징의 예 또한 토론 된다.

<table><tbody><tr><td>표 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-media, B-media, and complete media용 세포 배양 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>고전이성 OS 세포주</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>전이가 심한 OS 세포주</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory(NCI)</td><td>N/A</td><td>고전이성 OS 세포주</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>전이가 잘 되지 않는 OS 세포주</td></tr><tr><td>10X M199 배지</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>A-배지 및 B-배지용 기본 배지</td></tr><tr><td>증류수(멸균)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>A-배지 및 A-배지의 구성 요소 & B-미디어</td></tr><tr><td>7.5% 중탄산나트륨 용액</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>A-미디어 구성 요소 & B 매체</td></tr><tr><td>Hydrocortizone</td><td>시그마 Alrich</td><td>H6909</td><td>A 매체의 분대 & B-미디어</td></tr><tr><td>레티놀 아세테이트-수용성</td><td>시그마-알리치</td><td>R0635-5MG</td><td>A-미디어 구성 요소 & B-배지</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 10X 농축(10000 U/ml) 용액</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>A-배지 및 성분 B-미디어, 완전한 미디어.</td></tr><tr><td>둔감한 인슐린 해결책 (10mg/ml)</td> A-매체의 <td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>성분 & B-media</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>Complete Media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Complete Media</td></tr><tr><td>Fetal bovine Serum</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>Complete Media</td></tr><tr><td>Dulbecco' 구성 요소 s Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>세포 배양에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>행크' s 완충염 용액, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td> 트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드 써모피셔 25200114 주입 <td>전 세포 펠릿을 재현탁하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>폐 실질을 표시하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Table 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials for PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal</td><td>LSM Zeiss</td><td>N/A</td><td>Upright LSM Confocal 현미경</td></tr><tr><td>Zeiss 780 컨포칼 LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>도립 LSM 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>SCID 마우스</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, 여성, 6-8주</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>폐 조직 절편을 지지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>폐 팽창 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>27 게이지 바늘이 있는 1ml 주사기</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>꼬리 정맥 주사에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>10ml 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td>폐의 흡입에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>20 게이지 카테터</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>폐의 흡입 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Abbott IV 확장 세트(30", 멸균)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>폐 흡입 시 사용.</td></tr><tr><td>알코올 면봉</td><td>BD</td><td>326895</td><td>주사 전 꼬리 정맥 닦기 무</td></tr><tr><td>균 수술 장갑</td><td>Fisherscientific</td><td>크기에 따라 다름</td><td>마우스 폐의 셉틱 핸드링</td></tr><tr><td>30cm 눈금자</td><td>스테이플</td><td></td><td>폐의 흡입에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>ruler Pipette.com HS29022A 대한 지지대</td><td></td><td></td><td>폐의 흡입에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 배양 접시</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>폐 슬라이스 이미징 시 사용</td></tr><tr><td>방수 수분 장벽이 있는 흡수성 언더패드</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>생물학적 후드의 멸균 작업 영역을 라이닝하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Catgut Plain Absorbable Suture</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>캐뉼레이트 기관을 묶는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Table 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical instrument for PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors 3.5" 스트레이트 샤프/샤프</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>폐 단면 절단용</td></tr><tr><td>4" (10cm) 긴 톱니 모양 직선 매우 섬세한 0.5mm 팁</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>폐 단면을 조작/유지하기 위해.</td></tr><tr><td>4인치 (10cm) 긴 톱니 모양의 약간의 곡선 0.8mm 팁</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>폐 단면을 조작/유지하기 위해.</td></tr><tr><td>엄지 드레싱 겸자; 톱니 모양의; 민감한; 4.5" 길이; 1.3mm 팁 너비</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>일반 해부용.</td></tr><tr><td>엄지 드레싱 집게 4.5" 톱니 모양 2.2mm 팁 너비</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>일반 해부용.</td></tr><tr><td>초미세 마이크로 해부 가위 3.5" 스트레이트 샤프/샤프, 20mm 블레이드</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>일반 해부용.</td></tr><tr><td>냅 가위; 곧장; 날카롭고 무딘; 27mm 블레이드 길이; 4" 전체 길이</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>일반 해부용.</td></tr></tbody></table>

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

폐 전이 분석 결과 (푸 마) 이며 폐 explant 비보 전 폐쇄 셀 문화 시스템 형광 현미경 검사 법에 의해 폐 식민 osteosarcoma (OS)에서 생물학을 공부 하는 연구원입니다. 이 문서는 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 전이성 성장 widefield 또는 공초점 형광 현미경 플랫폼을 사용 하 여 이미지 데이터를 얻는 예에 설명 합니다. 푸 마 모델의 유연성 허용 연구원 폐 microenvironment에서 운영 체제 셀의 성장 뿐만 아니라 공부 뿐만 아니라 시간이 지남에 안티 전이성 치료제의 효과 평가 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 폐 실질과 OS 세포 상호 작용의 전례 없는, 고해상도 이미징에 대 한 수 있습니다. 또한, 푸 마 모델은 형광 염료 나 형광 단백질 유전자 기자와 함께, 연구팀은 폐 microenvironment, 세포 및 subcellular 구조, 유전자 기능 및 전이성 OS 셀에 발기인 활동 공부할 수 있습니다. 푸 마 모델 다리 연구자 새로운 전이 생물학 발견 하 고 새로운 안티 전이성, 타겟 요법의 활동을 평가에 대 한 새로운 도구를 제공 합니다.

낮은 확대 widefield 형광 현미경 검사 법
푸 마 폐 조각의 widefield 형광 현미경, 대표 이미지와 부 량 데이터 그림 2C및 그림 4A 와 B에 표시 됩니다. 높고 낮은 전이성 세포 라인에 대 한 전이성 경향은 시각적으로 명백한 진보적인 시간 포인트. 호 셀 전혀 성장할 수 없다 반면 MNNG 세포 폐 조직 식민지 화 효율적으로 수 있습니다. 이미지 분석, 그림 4B의 그래프와 같이 시간이 지남에 성장 평가를 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 낮은 확대율 (2.5 X)에서 획득 한 이미지에 전체 폐 슬라이스를 캡처...

이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

이 폐 전이 분석의 전반적인 목표는 생존 가능한 폐 조직에서 전이성 골육종 세포의 성장을 직접 시각화하고 연구하는 것입니다. 이 방법은 골육종 전이 분야에서 매우 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 전이성 골육종 세포가 폐 미세 환경에서 어떻게 적응하고, 생존하고, 증식하는지.이 기술의 주요 장점은 관련 3차원 마이크로 환경에서 전이성 골육종 세포 성장을 직접 시각화할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 기관을 캐뉼리로 삽입하고 폐를 팽창시키는 기술적으로 어려운 단계 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 종양 세포의 꼬리 정맥 주입 및 마우스 안락사는 표준 기관 지침에 따라 수행됩니다.5분 후, 안락사된 쥐를 등쪽 누운 상태로 층류 후드의 멸균 패드에 놓고 작고 멸균된 가위를 사용하여 폐에 구멍을 뚫지 않고 기관 양쪽의 흉부 입구를 지나 흉골을 조심스럽게 절개합니다. 기관을 둘러싼 모든 근육과 결합 조직을 절개하는 것은 성공적인 캐뉼레이션을 위해 필수적입니다. 다음으로, 20게이지 IV 카테터를 사용하여 기관을 조심스럽게 캐뉼레이션하고 멸균 개선 봉합사를 사용하여 카테터와 기관을 느슨하게 고정합니다.카테터의 IV 확장 세트를 중력 확산 장치의 10ml 주사기에 부착하고 중간 용액과 혼합된 섭씨 37도의 액체 아가로스를 주사기에 붓습니다. 폐가 완전히 팽창할 때까지 아가로스 용액으로 폐를 채웁니다. 그런 다음 캐뉼러를 제거하고 봉합사를 단단히 묶어 아가로스 용액의 누출을 방지합니다.흡입 중에 폐를 그대로 유지하는 것이 중요합니다. 아가로스로 적절하게 흡입하고 뽑은 부분을 식히면 폐가 확장된 상태로 유지됩니다. 뽑기, 기관, 심장 및 폐를 적출하고 폐 표면에 구멍을 내거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.항생제가 보충된 미리 냉각된 PBS 30ml에 조직을 넣고 아가로스가 응고되도록 합니다. 얼음 위에 20분 동안 얼음 위에 놓습니다. 20분 후, 가는 가위와 핀셋을 사용하여 폐를 3 x 1.5mm 조각으로 자르고 B 배지에 미리 담근 2 x 2cm 젤라틴 스폰지가 들어 있는 6웰 플레이트의 개별 웰에 슬라이스를 놓습니다.이미징 당일, 실험 그룹에 따라 6웰 플레이트의 폐 조각을 컬럼의 멸균 35mm 유리 바닥 원형 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, 광시야 형광 현미경에서 2.5x 대물렌즈를 선택하고 대조군 조직 샘플 그룹에서 형광 종양 세포와 형광이 발하지 않은 배경 조직 사이에 최상의 대비를 제공하도록 이미징 매개변수를 설정합니다. 대조군 조직과 동일한 파라미터를 사용하여 모든 샘플을 이미지화합니다.소프트웨어가 스케일 보정되지 않은 경우, 스케일 참조를 얻기 위해 폐 조직과 동일한 대물렌즈를 사용하여 마이크로미터를 이미지화하고 모든 이미지를 tif 파일로 저장합니다. 모든 이미지를 얻었으면 ImageJ의 이미지를 분석하려면 첫 번째 파일을 엽니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 전체 폐 절편의 윤곽을 그리면 전체 폐 절편의 면적을 결정할 수 있습니다.프로세스를 선택하고 배경을 뺍니다. 롤링 볼 반경을 시작 값인 50픽셀로 설정합니다. 이 값은 배경 형광의 정도에 따라 달라지며 각 데이터 세트에 맞게 최적화해야 합니다.밝은 배경의 선택을 취소해야 합니다. 이미지 및 유형, 8비트를 선택한 다음 이미지 및 속성을 선택하고 픽셀을 입력합니다. unit of length(길이 단위)에서 픽셀 너비, 픽셀 높이 및 복셀 깊이로 1을 입력합니다.그런 다음 global을 확인하여 이러한 매개변수를 모든 후속 이미지에 적용합니다. 그런 다음 이미지를 선택한 다음 조정한 다음 임계값을 선택합니다. 기본 및 흑백을 강조 표시하고 슬라이더를 사용하여 대부분의 종양 세포가 정확하게 강조 표시되도록 이미지를 임계값화합니다.적용을 한 번 클릭하면 폐가 검게 변하고 형광 병변이 하얗게 변합니다. 그런 다음 적용을 두 번 클릭하여 모든 형광 구조가 검게 변하도록 이미지를 반전시킵니다. 병변의 수와 모양을 정량화하려면 분석을 선택하고 측정값을 설정하고 영역을 확인합니다.다른 모든 상자의 선택을 취소합니다. 그런 다음 입자 분석을 선택하고 크기 필드에서 ImageJ에 의해 단일 세포로 결정된 가장 작은 병변 영역을 사용하여 프로그램이 열거할 모양의 범위를 설정합니다. day zero vehicle group의 이미지를 사용하여 단일 종양 세포로 간주되는 가장 작은 영역을 선택합니다.하한이 설정되었으면 확인을 클릭합니다. 열거된 모든 모양과 면적 측정값을 포함하는 결과 창이 나타납니다. 그런 다음 결과 창의 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 합계 수학 함수를 사용하여 특정 폐 절편에 대한 전이성 병변의 모든 영역을 추가합니다.높고 낮은 전이성 세포주에 대한 전이성 성향은 점진적 시점에 걸쳐 시각적으로 명백합니다. 보다 구체적으로 말하면, 이러한 현미경 이미지는 전이성이 높은 세포가 저전이성 세포주보다 얼마나 효율적으로 폐에 군집화할 수 있는지 보여줍니다. 이미지 데이터의 이미지 분석, 정량화 및 통계 분석을 통해 전이성이 높은 종양 세포가 폐 조직에 효율적으로 군집화할 수 있음을 확인할 수 있습니다.반면 낮은 전이성 세포는 전혀 성장할 수 없습니다. 고배율 컨포칼 형광 현미경 검사는 종양 세포를 발현하는 EGFP에 비해 폐 실질 세포를 매우 세부적으로 시각화할 수 있습니다. 뿐만 아니라 이러한 미토콘드리아와 같은 세포 내 구조의 분석을 용이하게 합니다.사용된 마우스의 수에 따라 이 기술을 적절하게 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 깨끗하고 멸균된 수술 장비로 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 쥐의 폐에서 전이 진행을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 절차에 따라 체외 세포 배양 분석 및 웨스턴 블로팅과 같은 다른 방법을 수행하여 암세포에 대한 유전자 넉다운 또는 약물 치료의 영향에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 폐 전이 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 암세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 바이오 레벨 안전성 2 실험실에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 문서는 인간의 암 세포 라인의 전이성 잠재력을 결정하는 데 사용되는 실험적인 전이 분석의 절차를 설명합니다.

실험 전이 분석

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수...

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

이 원고 종양 전이의 동물 모델에서 폐에 종양 세포 축적을 계량 하는 방법을 설명 합니다.

폐 종양 세포 모집 분석 결과

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

여기서, 전이 생물학의 전임상 조사에 사용될 수 있는 자발적인 폐 전이와 함께 골육종의 절단 절차를 따르는 회제 성 직소 이식이 기술되고 새로운 치료법의 개발이 설명된다.

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

이 실험 프로토콜은 lncRNA 녹다운과 콜로니 형성 분석법을 결합하여 lncRNA가 골육종 세포 증식에 미치는 영향을 정량화하는 안정적이고 비용 효율적이며 효율적인 방법을 제공합니다.

LncRNA 노크다운 골육종 세포의 증식 능력을 검출하는 콜로니 형성 분석

학습하세요 폐 전이 분석(PuMA)을 통해 골육종 세포의 폐 조직 내 성장을 직접 관찰하고 연구하는 방법을. 이 기술은 3차원 미세환경에서 전이성 암 세포의 적응과 생존 메커니즘을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

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