Name: 콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질 저하 약물의 차동 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 학습하세요 지질 저하 약물이 콜레스테롤 입자 형태를 변조하는 효과를 플라크 어레이 방법으로 평가하는 기법을. 이 연구는 죽상경화증 진단 바이오마커를 식별하는 데 도움을 줍니다.

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이 작품은 Plaxgen의 연구에 의해 투자 되었다 SM (PLX-1008)에 게 수 여 하는 그랜트. 우리는 IRB 승인 아래 동맥 경화 과목에서 혈 청 샘플을 수집 하기 위해 팔로 알토 의학 연구 재단 연구소를 감사 합니다.

1. 준비의 형광 표시 된 콜레스테롤과 지질 저하 약물 참고: 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 및 스타 틴 우리의 이전 기사에서 설명한 대로 준비 했다 21. 시 약, 교류 cytometer, 화학 분석기 및 데이터 분석 소프트웨어를이 연구에 사용 된 이미지의 세부 정보에 대 한 테이블의 자료를 참조 하시기 바랍니다.
<ol><li>형광 표시 된 동결 건조 된 콜레스테롤을 solubilize (1mg, 전 / Em = 495 nm/507 nm) 100% 알코올의 1 mL에 가루.</li>
	<li>2,040 x g에서 3 분을 위한 견본을 원심 고 성 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 패 배열 분석 결과에서 포함 된 supernatants 사용.</li>
	<li>약물 준비에 대 한 개별적으로 simvastatin로 바 스타 틴, atorvastatin, ezetimibe, 및 100% 알코올의 1 ml에 오메가-3 지방산의 분말 (2 mg)를 solubilize.</li>
	<li>2,040 x g에서 3 분 동안 원심 분리 후 사용 마약 분석 결과에 포함 된 supernatants.</li>
	<li>마찬가지로 solubilize 개별적으로 분말 (2mg) 심, rosuvastatin, 니 아 신, 그리고 이온된 물 2 mg/mL의 재고 솔루션을 만들고의 1 mL에 fibrate.</li>
	<li>2,040 x g에서 3 분 동안 원심 분리 후 사용 마약 패 배열 분석 결과에 포함 된 supernatants.</li>
</ol> 2. 패 배열 분석 결과 검토에 시험관 콜레스테롤 입자 형성을 위한 <ol><li>사용 화학 분석기-1 (재료의 표 참조) 패 배열 분석 결과 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 설정. 둥근 바닥, 낮은 단백질 바인딩 96 잘 접시 섹션 1에서 준비 하는 시 약을 사용 하 여 분석 결과 수행 합니다. 200 µ L에서 각 잘에서 최종 반응 볼륨을 유지 하 고 3 중에 모든 분석을 수행.
	<ol><li>먼저, 부하 194.5 µ L 인산의 염 분 (PBS) 각 음을 버퍼링.</li>
		<li>각 잘 각 지질 저하 약물 솔루션의 2.5 µ L (5 µ g)를 추가 하 고 흔들어 30 접시를 균일 하 게 솔루션으로 약물을 섞어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s. 약 부정적인 컨트롤 샘플에 추가 됩니다.</li>
		<li>마지막으로, 각 음을 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.</li>
		<li>2 h 37 ° C와 200 rpm에서 설정에 대 한 실험실 셰이 커에 접시를 품 어.</li>
		<li>Cytometry 이미징 하 여 입자의 이미지를 수집 부 화, 후.</li>
	</ol></li></ol> 3. 캡처 이미지의 콜레스테롤 입자를 사용 하 여 이미징 Flow Cytometry <ol><li>열기 데이터 수집 템플릿 올바른 악기 설정을 로드를. 클릭 " 파일 ", 다음 선택 " 오픈 템플릿 … " 하 고 서식 파일을 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 " 플러시, 잠금, 부하 " 샘플 로드에 대 한 악기를 준비 하.</li>
	<li>때는 " 로드 샘플 " 대화 상자가 열립니다, 클릭 " 확인 " 이미징 교류 cytometer로 제 2에서 준비 각 샘플의 50 µ L 로드.</li>
	<li>클릭 " 실행 | 설치 " 실시간에서 이미징 영역에서 입자를 볼.</li>
	<li>이미징 영역에서 입자 좋은 초점에 있을 때 클릭 " 실행 | 취득 " 다크 필드 (사이드 분산형/SSC), 밝은 (BF), 녹색 형광와 노란색 형광에 대 한 높은 처리 방식으로 각 개체의 이미지를 동시에 취득 하.</li>
	<li>반복 단계 각 샘플에서 5000-10000 입자를 얻으려고 3.2-3.5.</li>
	<li>개체 형광 강도 및 형태학 상 변이 결정 하기 위한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 모든 raw 이미지 파일을 분석.
	<ol><li>클릭는 " 도구 " 선택 후 이미지 분석 소프트웨어의 상단에 버튼 " 일괄 처리 데이터 파일 " 드롭-다운 메뉴에서을 열 것 이다는 " 배치 " 창.</li>
		<li>에 " 배치 " 창 클릭는 " 추가 배치 " 열립니다 단추는 " 일괄 처리 정의 " 창.</li>
		<li>에는 " 일괄 처리 정의 " 창 클릭는 " 파일 추가 " 버튼 및 raw 이미지 파일을 선택, 클릭는 " 서식 파일 " 버튼 적절 한 데이터 분석 템플릿 파일을 선택한 후 선택 " 확인 " 및 " 일괄 처리 제출 " 처리 및 raw 이미지 파일의 분석을 시작 하려면.</li>
	</ol></li></ol> 4. 배열 분석 결과 기반 평가의 지질-저하 약물 효과 플 라크 콜레스테롤 입자 정화 <ol><li>단계 2.1에에서 설명 된 대로 수행 콜레스테롤 입자 형성 분석 결과 정화 VLDL, LDL 및 HDL 지방 단백질/입자를 사용 하 여. 96 잘 접시에 패 배열 분석을 수행.
	<ol><li>첫째, PBS 가진 모든 우물을 로드; 200 µ L 최종 볼륨을 사용 하 여 각 잘.</li>
	</ol></li> <li>부정적인 제어를 위한 4 µ g VLDL, LDL, 추가 또는 HDL 단백질/입자 각각에 개별적으로 약 없이 고 30 접시를 흔들어 s.
	<ol><li>지질 저하 약물 효과 조사, 추가 4 µ g VLDL, LDL, 또는 HDL 단백질/입자 각각을 개별적으로 잘 흔들어 30 접시 s.</li>
		<li>우물 4 µ g VLDL, LDL, 또는 HDL 추가, 2.5 µ (5 µ g) L ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin, 또는 니 아 신 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1에 그것을 배치 하 여 s.</li>
		<li>마지막으로, 모든 우물을 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.</li>
	</ol></li> <li>37 ° C와 200 rpm에서 설정 실험실 셰이 커에 2 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>이미징 cytometry 다음 단계 3.1-3.5를 사용 하 여 샘플을 수집.</li>
	<li>단계 3.7에서에서 설명한 대로 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 raw 이미지 파일을 분석.</li>
	<li>분석 서식 파일에서 콜레스테롤 입자 모집단의 식별을 위해 다음 제어 체계 사용.
	<ol><li>녹색 채널 포화 픽셀 수 (x 축)와 어두운 필드 채널의 음모에 포화 픽셀 수 (y 축), 어느 채널에서 하나 이상의 포화 픽셀 개체 거부.</li>
		<li>녹색 채널 강도 (x 축) 및 SSC 강도 (y 축)을 사용 하 여 포화 픽셀 없이 개체/입자 플롯: 개체가 그들의 녹색 채널 및 SSC 농도에 따라 세 영역 (VLDL, LDL, HDL) 중 하나에 속합니다. 
		참고: 이러한 게이츠 순화 VLDL, LDL 및 HDL 입자/단백질 약물 없이 사용 하 여 실시 하는 제어 실험에서 생성 된 데이터에 따라 만들어졌습니다.</li>
	</ol></li> <li>각 샘플에 대 한 지질 저하 약물 효과 확인 하려면 계산 각 부분 모집단 (VLDL, LDL, HDL)의 비율 뿐만 아니라 총 단백 입자 농도에 설명 된 단계 6.5.
	다음 수식을 사용 하 여 <ol><li>계산 입자 농도 (입자/mL): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"> 참고:는 VLDL, LDL 및 HDL 게이팅 형광 도트-음모에서 영역 검출 ~ 그들의 각각 부분 모집단, 및 나머지의 80% ~ 20%는 입자의 다른 제어 영역 중복.</li>
	</ol></li></ol> 5. 혈 청 샘플에서 지질 농도의 측정 <ol><li>화학 분석기-2에 의해 LDL, HDL, 콜레스테롤 및 트리 글 리세 리드의 농도 결정 하는 데 사용 나이 일치 하는 정상 및 dyslipidemia 과목에서 얻은 혈 청 샘플.</li>
	<li>LDL, HDL, 콜레스테롤, 고 중성 지방 혈 청 샘플에서 상위 및 하위 참조 값을 넘어 식별 하는 그들의 농도에 따라의 비정상적인 농도 정의.</li>
	<li>따라 일반적인 참조 값 recommen시 약 제조 업체에 의해 공격 한: 콜레스테롤 (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), (4-100 mg/dL), LDL 및 트리 글 리세 리드 (9-200 mg/dL).</li>
	<li>낮은 참조 값 아래 또는 더 높은 참조 콜레스테롤 및 트리 글리세라이드에 대 한 가치와 존재 및 지질 저하 약물의 부재에 심사에 대 한 그들을 사용 된 비정상적인 값 있는 혈 청 샘플 식별.</li>
</ol> 6. 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 약물의 효과 분석 <ol><li>사용 화학 분석기-패 배열 분석 결과 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 설정 1. 둥근 바닥, 낮은 단백질 바인딩 96 잘 접시에에서 분석 결과 수행 합니다. 최종 반응 양의 200 µ L/잘 사용 하 고 3 중에 모든 분석을 수행.</li>
	<li>Stepwise 방식에서 시 약을 로드 하 여 접시를 준비.
	<ol><li>제어 웰 스 준비.</li>
		<li>각 잘을 PBS의 부하 193 µ L.</li>
		<li>2.5% (v/v) 환자 혈 청 (잘 당 하나의 혈 청 샘플)을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.</li>
		<li>추가 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤의 각 음에 솔루션을 집계 및 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.</li>
	</ol></li> <li>약물과 웰 스 준비.
	<ol><li>각 잘을 PBS의 부하 191 µ L.</li>
		<li>2.5% (v/v) 환자 혈 청 (잘 당 하나의 혈 청 샘플)을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.</li>
		<li>추가 2 µ L ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin 또는 니 아 신 솔루션 (4 µ g) 부정적인 제어 웰 스 제외 하 고 모든 우물. 잘 당 하나의 약물을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.</li>
		<li>형광 표시 된 콜레스테롤의 추가 2 µ L 각 우물에 솔루션 (2 µ g)를 집계 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.</li>
	</ol></li> <li>마약 모든 우물만 로드 (제어 및 약물 치료) 그들의 각각 혈 청 샘플 로드 되었습니다 및 형광 표시 된 콜레스테롤이이 단계 끝에 추가.</li>
	<li>37 ° C와 200 rpm에서 설정 실험실 셰이 커에 2 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>교류 cytometer 다음 단계 3.1-3.6에서에서 설명한 설정을 이미지에 의해 샘플을 취득.</li>
	<li>단계 3.7에서에서 설명한 대로 동일한 서식 파일을 사용 하 여 모든 이미지 파일을 처리 하는 일괄 처리에 대 한 소프트웨어를 분석 하는 이미지를 사용 하 여.
	<ol><li>4.5와 4.6 단계에 설명 된 대로 플롯 게이츠를 그려서 데이터 분석을 수행.</li>
	</ol></li> <li>지질 저하 약물 효과/응답 (낮음, 중간, 및 높은) 각 샘플에 대 한 결정, VLDL, LDL과 HDL의 총 입자 구성의 비율 뿐만 아니라 총 단백 입자 농도 계산 부분 모집단.</li>
	<li>플롯 개체의 히스토그램에 VLDL, LDL 및 HDL 인구 ' s 밝은 필드 이미지, 구형 또는 선형 영역으로 길이 (길이-폭), 그리고 게이트에서 뺀 폭: 개체 (길이-폭) ≤ 2 µ m으로가 구형 및 선형 비율 계산에 대 한 구형 영역 모양 입자.</li>
	<li>구형 및 선형 모양의 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자와 각 약물 없이 incubated 각 혈 청 샘플에 대 한 식별의 백분율을 비교 합니다. 각 혈 청 샘플에 대 한 가져온 triplicate 값, 중 동의 구형 및 선형 비율 LDL과 HDL 입자는 약물 효과의 결정에 대 한 SD ± 2 범위 내에 속하는 모양.</li>
</ol>

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박사 Madasamy Plaxgen, Inc에서 보조금 지원을 받고 있으며 경쟁 금융 관심 있습니다. 다른 작성자 공개 경쟁 금융 관심 없습니다 있어야 합니다.

일반적으로, 배포 및 혈액 순환에 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자의 기능 특성 주로 대사, 유전 역학, 세포, 및 플라즈마 요인22,23에 의해 결정 됩니다. 현재 연구에서 지질 변경의 효과 검사 버퍼에 마약 밝혀 ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin, atorvastatin 등 높은 질 성 약 콜레스테롤 입자의 형태에 더 높은 수준의 복잡성을 유도 높은 친수성 rosuvastatin 심 약으로 관찰 된 낮은 수준의 효과에 비해. 이러한 결과 좋은 계약에 우리의 이전 연구 버퍼 및 혈 청 샘플21에서 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 변조에서 스타 틴의 효과 기반으로 하는 비 효소 메커니즘을 설명 하. 따라서, 현재 연구에서 결과 ezetimibe, 니 아 신, fibrate, 그리고 오메가-3 지방산 마약 변조 콜레스테롤 입자 형성에 직접적인 역할을 할 수 있는 행동의 비 효소 메커니즘 밝혀. 약물 및 콜레스테롤 집계 사이 상호 작용 구형 및 선형 가닥 형태학 전시 대형 콜레스테롤 입자 들 2-60 µ m2의 어셈블리에 연결 가능 하다.
게다가, 순화 된 지단백 입자를 사용 하 여 얻은 결과 콜레스테롤 집계와 작곡과 콜레스테롤의 형태학 속성을 변경할 수 있습니다 VLDL, LDL 및 HDL 단백질을 포함 한 플라즈마 요소 간의 상호 작용을 제안 입자입니다. 순화 된 지 단백질 입자와 관련 된 약물 치료 결과 LDL 콜레스테롤 입자 형성에 관찰 하는 그들의 효과에 비해 VLDL 입자 형성에 더 높은 수준의 마약 효과를 나타냅니다. 로 바 스타 틴, simvastatin, ezetimibe 약 프로 약으로 사용 되었다 하 고 그들의 복용량은 분석 실험에서 생리 적 농도 보다 높을 수 있습니다.
흥미롭게도, 선형의 형성에 미치는 영향에 특히 LDL과 HDL 입자를 형성 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자 형성의 프로필 변경에 약물 효과의 변이 보여주었다 혈 청 샘플의 심사. 이러한 약물 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 형성 dyslipidemia에 나이 일치 하는 정상 혈 청 샘플 모양의 선형에 감소 유도. 선형 모양된 입자 형성을 감소에 관찰 약물 효과 simvastatin, ezetimibe로 바 스타 틴, 니 아 신에서 높았다. 정상 및 dyslipidemia 혈 청 샘플에서 구형 및 선형 스트랜드 형태학과 콜레스테롤 입자의 식별 vivo에서 조건에서 유사한 형태학을 가진 입자 형성 수 있습니다 제안 합니다. 이전 연구는 디스크와 인간과 ApoE-/- LDLR-/- 생쥐 모델24,,2526 의 동맥 경 화성 플 라크에 바늘 모양의 콜레스테롤 결정의 존재를 확인 ,2728.
이질적인 혼합물 및 기능 활동 함께 소형 및 대형 크기 HDL 입자의 수준 반전 콜레스테롤 수송을 통해 그들의 심장 보호 효과 발휘 하는 중요 한 요소는 존재 하는 혈액에서 회람 하는 HDL 입자 통로29,30. HDL 콜레스테롤 입자 subfractions elucidating31 콜레스테롤 경과, 안티-염증, 안티 thrombotic 및 안티 산화 등 여러 생물학적 기능에 그들의 역할에 대 한 식별의 중요성을 강조 하는 최근 연구 . 또한, 연구의 숫자는 플라즈마1,5,21에서 HDL의 수준을 알 맞도록 하는 낮은 증가에 지질을 낮추는 치료의 효과 보고 있다. 따라서, 본 연구에서 결과 콜레스테롤 입자의 형태학 적 특징에 새로운 통찰력을 제공합니다. 특히, dyslipidemia 주제의 혈 청 샘플에서 선형 모양의 HDL 콜레스테롤 입자의 높은 수준의 검색 제안 그들은 모두 진단 및 지질 변경의 효과 평가 대 한 신뢰할 수 있는 biomarker를 있을 수 있습니다 마약 환자에. 그러나, 추가 조사는 명료한 형태학 및 CVD에 그들의 협회와 콜레스테롤 입자를 더 잘 이해 하는 큰 임상 샘플을 사용 하 여 필요 합니다.
콜레스테롤 입자의 조립에 약물 효과 조사 분석 한 패 결과 배열, 표시 된 콜레스테롤 집계 및 5 µgof 마약 때문에 형광의 2 µ g 사용 했습니다: (1) 약물은 콜레스테롤을 표시 두 형광 경쟁적으로 바인딩할 및 내 인 성 지질 혈 청 샘플;에 (2) 각 샘플에서에서 큰 크기와 ~ 2-60 μ2;에서 배열 하는 모양으로 조립 하는 5000 ~ 10000 콜레스테롤 입자를 획득 (3) 약물 (5 µ g 복용 300 ng)와 콜레스테롤 입자 형성;의 프로필에 감지 변경 했다 높은 복용량으로 알을 품을 그들의 1 ~ 5% 인 큐베이 팅 세럼 샘플 중 약물 반응의 다양 한 변화 관찰 (4) 콜레스테롤 집계와 지질 저하 약물 간의 상호 작용은 비 효소 과정에 의해 중재. 따라서, 분석 결과에 사용 된 시 약의 농도 그들의 생리 적인 수준 보다 더 높은 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 성공적으로 증명 하고있다는 생체 외에서 이미징 형태학과 콜레스테롤의 조절에 광범위 한 지질 저하 약물의 효과 결정 하기 위한이 연구에서 설명 하는 방법의 장점 입자입니다. 시각화 및 이미지 분석 알고리즘의 별자리를 채용 하 여 지질 입자의 형태를 측정의 접근 환자에서 지질을 낮추는 치료의 결과 평가 하 고 동맥 경화 증의 두 진단을 도움이 됩니다.

고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤에 있는 증가의 온건한 수준에 저밀도 지 단백질 (LDL) 콜레스테롤의 낮은 플라스마 수준을 감소 시키는 지질 저하 약물의 효능을 증명 하는 수많은 임상 연구는 동맥 경화 관련 심장 혈관 부작용1,2,3,,45의 기본 및 보조 부각을 방지할 수 있습니다. 스타 틴, HMG-CoA reductase 효소 저 해제, 그룹 낮은 회전 리드 순환 혈액6,7에서 LDL 콜레스테롤의 수준에에서 내 인 성 콜레스테롤 합성을 차단 합니다. 마찬가지로, 니코틴산의 효과 낮추는 지질 hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, triglyceride 합성8에 관련 된 주요 간 효소의 그것의 직접 적이 고 및 회장 저해에 의해 중재 됩니다. 비교적, ezetimibe 소장9의 상피 세포에 위치한 Niemann 선택 C1-Like 1 (NPC1L1) 단백질에 바인딩하여 exogenous 콜레스테롤의 흡수를 제한 하 여 플라즈마 정도를 LDL 감소 시킨다. Fenofibrate, 다른 지질 저하 약물, 실질적으로 플라스마 트리 글리세라이드의 농도 감소 하 고 또한 알맞게 peroxisome proliferator 활성화 수용 체 통로10통해 LDL 콜레스테롤을 감소. 게다가, 오메가-3 지방산은 LDL11의 플라즈마 저수준에 그것의 능력 때문 항 동맥 경 화성 효과를 보고.
지질 낮추는 약물 LDL 콜레스테롤을 낮추는에 그들의 기본 효과 외에 HDL 수준 향상, 내 피 기능을 개선, 염증, 및 감소 혈소판 억제를 포함 하 여 유익한 다 면 발현 성 효과의 번호가 집계12,,1314. 그러나, HDL 콜레스테롤 입자를 증가 하 고 그들의 구조 기능 수정에 이러한 약물의 기본 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 이러한 의약품 심혈 관계 질환 동맥 경화 관련 (CVDs) 치료를 널리 처방 됩니다, 이후 더 그들의 가능한 역할에 형태학 기능 및 지질 입자의 분포 확인 조사 필수적입니다. 인간의 플라즈마 lipidome 약 600 독특한 지질과 다양 한 크기, 모양, 밀도, 및 작곡15,16,17에 있는 cholesterols의 종류 분자 22의 구성 . 울트라-원심 분리, NMR, 그라데이션 젤 전기 이동 법 등 분석 방법 LDL과 HDL 입자와 그들의 subfractions18,19를 특성화 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 이러한 방법의 응용 형태 및 지질 입자의 변조에서 약물의 효과 결정 하기 위한 연구에 제한 됩니다. 교류 cytometer 기반된 패 배열 기능 생화학 분석 결과 검색에 대 한 개발 이며 혈 청의 지질 및 아 밀 로이드 플 라크 입자20파생. 체 외에 이미징이 연구에서 설명 하는 방법의 장점은 변경 형태 및 버퍼 및 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자의 분포에 지질 조절 약물 효과의 식별 가능

<table><tbody><tr><td>TopFluor 형광 콜레스테롤</td><td>Avanti Polar 지질은</td><td></td><td>100 &마이크로를 저장합니다. l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>simvastatin (pro-drug)</td> <td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>lovastatin (pro-drug)</td> <td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>rosuvastatin</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>아토르바스타틴</td><td>케이맨 화학 물질</td><td></td><td>저장 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>플루바스타틴</td><td>케이맨 화학 물질</td><td></td><td>저장 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>ezetimibe (프로 마약)</td> <td>케이맨 화학 물질</td><td></td><td>상점 100 &micro; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>Niacin</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>스토어 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>피브레이트</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>스토어 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>오메가-3 지방산</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td></tr><tr><td>정제 VLDL 단백질/입자</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정제 LDL 단백질/입자</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정제 HDL 단백질/입자</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human 연령 일치 혈청</td><td>Dx Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 죽상경화증 혈청</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 정상 혈청</td><td>Stanford 혈액 센터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDL 측정 시약 팩</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL 측정 시약 팩</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>총 콜레스테롤 측정</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 마이크로타이터 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리글리세리드 측정</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amnis 이미징 유세포 분석기</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEAS 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902</td><td>Awarness Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemistry Analyzer-2, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질 저하 약물의 차동 효과

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

치료 dyslipidemia 환자 지질 저하 약물의 중요 한 감소 저밀도 지 단백질 (LDL) 수준 및 플라즈마의 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤에 있는 증가의 적당 한 수준 낮은 이끌어 낸다. 그러나, 형태학 및 콜레스테롤 입자의 배포 변경에 이러한 약물의 가능한 역할 제대로 이해 된다. 여기, cytometry 이미징 함께 패 배열 메서드를 사용 하면 콜레스테롤 입자의 형태학 적 기능 변조에 지질 저하 약물 효과의 평가 체 외에서 설명 합니다. 콜레스테롤 입자의 이미지 분석 표시로 바 스타 틴, simvastatin, ezetimibe, atorvastatin 구형 및 선형 가닥 모양 입자의 형성을 유발, 피 브 레이트 류, 심, 신과 rosuvastatin 유도 하는 반면에 만 구형 모양 입자의 형성입니다. 다음, 매우 순화 된 저밀도 지 단백질 (VLDL)과이 약물과 incubated LDL 입자 변화에서에서 보여주었다 콜레스테롤의 형태학 및 이미지 텍스처 입자 모집단. 또한, 혈 청 샘플 50의 심사 dyslipidemia (18.3%의 평균)이 일치 하는 정상 (11.1%의 평균) 샘플에 비해 과목에서 선형 모양의 HDL 콜레스테롤 입자의 높은 수준의 존재를 밝혔다. 우리는 또한 선형 감소에 지질 저하 약물 효과에 상당한 변화 모양 혈 청 샘플에서 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 관찰. 이러한 연구 결과 지질 저하 약물, 그들의 세포 중재 낮추는 효과 뿐만 아니라 행동의 비 효소 메커니즘에 의해 콜레스테롤 입자의 형태를 조절 직접 수 있습니다 나타냅니다. 이러한 결과의 결과 동맥 경화 증의 진단 정보를 최적의 지질을 낮추는 치료 예측 가능성이 있다.

이 연구의 목적은 약물 효과 콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질을 낮추는 생체 외에서 평가 했다. 지질 저하 약물의 비교 콜레스테롤 입자의 형태학 적 기능 변조에 그들의 효과에서 변화를 밝혔다.

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

본 연구의 전반적인 목적은 플라크 어레이 방법을 이용하여 콜레스테롤 입자의 형태학적 특징을 조절하는 지질 저하 약물의 효과를 평가하고, 죽상동맥경화증 진단 및 약물 효과 판단을 위한 잠재적 바이오마커를 확인하는 것이다. 콜레스테롤 입자 형성을 조절하는 데 있어 지질 저하 약물의 역할은 잘 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 지질 저하 약물이 콜레스테롤 입자 형성의 프로필과 형태학적 특징을 변경하는 데 직접적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다.다른 입자 검출 방법에 비해 체외 이미징 방법을 기반으로 하는 플라크 어레이의 주요 장점은 혈청에서 지질 저하 약물의 효과를 평가하기 위해 콜레스테롤 입자를 시각화할 수 있다는 것입니다. Plaxgen의 실험실 기술자인 Jason Lundry가 화학 분석기를 사용하여 플라크 어레이 분석을 설정하는 방법을 시연합니다. Millipore Sigma의 선임 과학자인 Raymond Kong은 이미징 유세포 분석을 사용하여 시료 처리를 수행하는 방법을 시연합니다.마지막으로, Plaxgen의 실험실 기술자인 David Liu가 콜레스테롤 입자 이미지에 대한 데이터 분석을 시연합니다. chemistry analyzer-1을 사용하여 콜레스테롤 입자 형성에 대한 플라크 배열 분석을 설정합니다. 분석 전반에 걸쳐 각 웰의 최종 반응 부피를 200마이크로리터로 유지하고 모든 분석을 3회에 수행합니다.먼저, 194 포인트 5 마이크로 리터의 인산염 완충 식염수 또는 PDS를 둥근 바닥의 저단백질 결합 96 웰 플레이트의 각 웰에로드합니다. 각 웰에 각 지질 저하 약물 용액의 2 점 5 마이크로 리터를 첨가하면 음성 대조군 샘플에 약물이 첨가되지 않습니다. 그런 다음 chemistry analyzer-1 반응 플레이트에 올려 약물을 용액에 균일하게 혼합하여 플레이트를 30초 동안 흔듭니다.마지막으로, 형광 표지된 콜레스테롤 응집체 용액 2마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 이전과 같이 chemistry analyzer-1 반응 플레이트에 플레이트를 올려 30초 동안 흔듭니다. 그런 다음 섭씨 37도 및 200rpm으로 설정된 실험실 셰이커에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.배양 후 유세포 분석을 이미징하여 입자의 이미지를 획득합니다. 데이터 수집 템플릿을 열어 올바른 기기 설정을 로드합니다. 파일을 클릭한 다음 템플릿 로드를 선택하고 템플릿 파일을 선택합니다.Load(로드)를 클릭하여 시료 로딩을 위해 기기를 준비합니다. Load Sample 대화 상자가 열리면 OK를 클릭하여 50마이크로리터의 샘플을 이미징 유세포 분석기에 로드합니다. 이미징 영역에서 입자를 실시간으로 볼 수 있을 때까지 기다립니다.이미징 영역의 입자에 초점이 양호한 경우 Acquire를 클릭하여 암시야, 명시야, 녹색 형광 및 황색 형광에 대한 높은 처리량 방식으로 각 개체의 이미지를 동시에 획득합니다. 수집이 끝나면 Return 버튼을 클릭하여 샘플을 반환합니다. 이 단계를 반복하여 각 샘플에서 5, 000에서 10, 000개의 입자를 획득합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 물체 형광 강도 및 형태학적 변화를 결정하기 위해 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 원시 이미지 파일을 분석합니다. 웰당 200 마이크로리터의 최종 반응 부피를 사용하여 단계적으로 시약을 로딩하여 둥근 바닥의 저단백질 결합 96 웰 플레이트를 준비합니다. 먼저 컨트롤 웰을 준비합니다.각 웰에 193마이크로리터의 PBS를 로드합니다. 환자 혈청 2.5%를 추가하고 웰당 하나의 혈청 샘플만 로드합니다. 그런 다음 화학 분석기 반응 플레이트에 플레이트를 올려 30초 동안 흔듭니다.다음으로, 2마이크로리터의 형광 표지된 콜레스테롤 응집액을 각 웰에 추가합니다. 다시 Chemistry Analyzer-1 반응 플레이트에 플레이트를 올려 30초 동안 흔듭니다. 약물로 우물을 준비하려면 각 우물에 191마이크로리터의 PBS를 로드합니다.그런 다음 웰당 각 환자 혈청 2.5%를 추가하고 chemistry analyzer-1 반응 플레이트에 올려 플레이트를 30초 동안 흔듭니다. 2마이크로리터의 에제티미브(ezetimibe), 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin) 또는 니아신(niacin) 용액을 음성 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 첨가합니다. 웰당 하나의 약물만 추가합니다.이전과 같이 30초 동안 플레이트를 흔듭니다. 다음으로, 플레이트를 30초 동안 흔들기 전에 2마이크로리터의 형광 표지된 콜레스테롤 응집액을 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 200rpm으로 설정된 실험실 셰이커에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.배양 후 이전과 동일한 설정에 따라 유세포 분석을 이미징하여 샘플을 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 이미지 파일을 일괄 처리하려면 이미지 분석 소프트웨어를 사용하십시오. 여기에 나타난 것은 비효소적 메커니즘에 의해 스타틴에 의해 유도된 구형 및 선형 가닥 모양의 콜레스테롤 입자를 식별하는 것을 보여주는 대표적인 결과입니다.다른 지질 저하 약물에 의해 유도되는 콜레스테롤 입자 형성의 두 가지 뚜렷한 형태가 확인되었습니다. 에제티미브, 니아신, 피브레이트, 오메가-3 지방산이 포함되어 있습니다. 여기에 표시된 것은 점도표이며, 여기서 X축은 녹색 형광 채널에서 검출된 콜레스테롤 입자의 스펙트럼을 표시합니다.그리고 Y축은 측면 산란을 표시하고, 게이팅은 형광 점도표에서 감지된 매우 낮은 밀도의 지단백질, 저밀도 지단백질 및 고밀도 지단백질 입자의 영역을 표시합니다. 이러한 결과는 약물, 에제미드, 로바스타틴, 심바스타틴 및 니아신이 없는 상태에서 지질 저하 효과가 정제된 VLDL 및 LDL 콜레스테롤 입자의 프로필을 어떻게 변화시키는지를 보여줍니다. 여기에 보이는 것은 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자 형성의 프로파일을 조절하는 다양한 지질 저하 약물의 감별 효과를 식별하기 위한 3가지 다른 혈청 샘플의 스크린입니다.이러한 프로파일은 세 가지 다른 혈청 샘플 간의 반응 수준에도 차이가 있음을 나타냅니다. 약물 없이 다양한 지질 저하제가 존재하는 상태에서 형성된 구형 및 선형 모양의 콜레스테롤 입자에 대한 혈청 샘플 1의 스크리닝은 혈청 유래 콜레스테롤 입자의 두 가지 뚜렷한 형태를 확인하여 구형 및 선형 가닥 모양을 모두 표시합니다. 따라서 우리는 콜레스테롤 입자 형성 및 그 임상적 중요성에 대한 관계를 조절하는 지질 저하 약물 효과를 식별하기 위한 체외 이미징 접근 방식을 성공적으로 입증했습니다.우리의 예비 결과는 유망하며, 우리는 대규모 임상 샘플을 사용하여 이 플라크 어레이 분석을 추가로 검증하는 과정에 있습니다. 표준 지질 패널은 혈청 내 LDL 및 HDL 콜레스테롤 수치를 측정합니다. 당사의 플라크 어레이 분석법은 죽상동맥경화증 위험의 정확도를 높이고 혈청을 이용하여 지질저하약물 반응을 예측하고자 합니다.

differential-effects-lipid-lowering-drugs-modulating-morphology

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

콜레스테롤 분석은 교양 세포에서 콜레스테롤 유출의 속도와 세포에서 풀려나는 콜레스테롤을 수락하기위한 플라즈마 acceptors의 용량을 quantitate하도록 설계되었습니다. 분석은 세포 내 수영장과 세포 수용체에 콜레스테롤의 릴리스 간의 콜레스테롤 콜레스테롤, 평균으로 세포를 레이블링으로 구성되어 있습니다.

콜레스테롤 유출 분석

더 많은 단백질의 절반 이상이 전자 현미경 영상과 3 차원 재구성 모두 도전하고 작은 단백질 (분자량 &lt;200 kDa의)이다. 최적화 네거티브 염색 고 대비 및 비교적 높은 해상도 (~ 1 nm의) 다른 생리적 조건 하에서 작은 비대칭 또는 단백질 복합체의 이미지를 얻기 위해 견고하고 높은 처리량 프로토콜이다.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

이 프로토콜에는 라이브 셀 이미징 다양 한 셀 형식에 시스템을 사용 하 여 실시간으로 유입 속도와 LDL 콜레스테롤 흡수를 측정 하는 효율적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 세포 형태학 및 그러므로 잠재적인 세포 독성에 대 한 모니터링 하면서 LDL 유입에 영향을 미치는 화합물의 약리 활동 화면 플랫폼을 제공 합니다.

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 천연 마이크로 RNA 함량 (절대/상대)의 결정을 위해 제시 된다. 또한, 마이크로 RNA 레벨을 증가 시키는 방법 뿐만 아니라, 지 단백질 입자의 세포 흡수 율을 결정 하는 방법이 입증 되어 있다.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

콜레스테롤 농축의 두 가지 방법이 제시된다 : 포유류 조직과 세포를 풍부하게하기 위해 콜레스테롤포화 사이클로 덱스트린의 응용 프로그램, 그리고 콜레스테롤 농축 인지질 기반 분산의 사용 (리포좀) 제노푸스 oocytes을 풍부하게. 이 방법은 분자에 높은 콜레스테롤 수치의 영향을 결정 하기 위한 도구, 세포, 그리고 장기 기능.

포유류 조직과 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 우세포의 농축

혈장 지단백질을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었습니다. 그러나, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법 중 하나입니다. 여기서는 순차밀도 극심분리를 이용하여 플라즈마로부터 지단백질을 분리하는 방법과 진단 및 연구 목적으로 아폴리포단백질을 분석하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

극심분리에 의한 혈장 지단백질의 격리 및 분석

본원에서, 우리는 전체 인간 혈장 또는 혈청에 존재하는 고밀도 지단백질(HDL)에 의해 지질 공여자 입자로부터 특이적으로 제거된 형광 인지질의 양을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 HDL 기능의 이 지표가 발생 심혈관 질환을 예측한다는 것을 보여주었습니다.

고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출 분석

glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다.

항암 약의 특이성 평가<em&gt; 체외</em

토끼는 안구 주사 약물의 약동학을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 토끼 눈을 사용하여 안구 내 약물의 약동학 연구를 수행하는 방법을 설명합니다.

안구 약의 약동학 연구에서 토끼 눈의 사용

학습하세요 지질 저하 약물이 콜레스테롤 입자 형태를 변조하는 효과를 플라크 어레이 방법으로 평가하는 기법을. 이 연구는 죽상경화증 진단 바이오마커를 식별하는 데 도움을 줍니다.

콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질 저하 약물의 차동 효과

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