콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질 저하 약물의 차동 효과

본 연구의 전반적인 목적은 플라크 어레이 방법을 이용하여 콜레스테롤 입자의 형태학적 특징을 조절하는 지질 저하 약물의 효과를 평가하고, 죽상동맥경화증 진단 및 약물 효과 판단을 위한 잠재적 바이오마커를 확인하는 것이다. 콜레스테롤 입자 형성을 조절하는 데 있어 지질 저하 약물의 역할은 잘 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 지질 저하 약물이 콜레스테롤 입자 형성의 프로필과 형태학적 특징을 변경하는 데 직접적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

다른 입자 검출 방법에 비해 체외 이미징 방법을 기반으로 하는 플라크 어레이의 주요 장점은 혈청에서 지질 저하 약물의 효과를 평가하기 위해 콜레스테롤 입자를 시각화할 수 있다는 것입니다. Plaxgen의 실험실 기술자인 Jason Lundry가 화학 분석기를 사용하여 플라크 어레이 분석을 설정하는 방법을 시연합니다. Millipore Sigma의 선임 과학자인 Raymond Kong은 이미징 유세포 분석을 사용하여 시료 처리를 수행하는 방법을 시연합니다.

마지막으로, Plaxgen의 실험실 기술자인 David Liu가 콜레스테롤 입자 이미지에 대한 데이터 분석을 시연합니다. chemistry analyzer-1을 사용하여 콜레스테롤 입자 형성에 대한 플라크 배열 분석을 설정합니다. 분석 전반에 걸쳐 각 웰의 최종 반응 부피를 200마이크로리터로 유지하고 모든 분석을 3회에 수행합니다.

먼저, 194 포인트 5 마이크로 리터의 인산염 완충 식염수 또는 PDS를 둥근 바닥의 저단백질 결합 96 웰 플레이트의 각 웰에로드합니다. 각 웰에 각 지질 저하 약물 용액의 2 점 5 마이크로 리터를 첨가하면 음성 대조군 샘플에 약물이 첨가되지 않습니다. 그런 다음 chemistry analyzer-1 반응 플레이트에 올려 약물을 용액에 균일하게 혼합하여 플레이트를 30초 동안 흔듭니다.

마지막으로, 형광 표지된 콜레스테롤 응집체 용액 2마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 이전과 같이 chemistry analyzer-1 반응 플레이트에 플레이트를 올려 30초 동안 흔듭니다. 그런 다음 섭씨 37도 및 200rpm으로 설정된 실험실 셰이커에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

배양 후 유세포 분석을 이미징하여 입자의 이미지를 획득합니다. 데이터 수집 템플릿을 열어 올바른 기기 설정을 로드합니다. 파일을 클릭한 다음 템플릿 로드를 선택하고 템플릿 파일을 선택합니다.

Load(로드)를 클릭하여 시료 로딩을 위해 기기를 준비합니다. Load Sample 대화 상자가 열리면 OK를 클릭하여 50마이크로리터의 샘플을 이미징 유세포 분석기에 로드합니다. 이미징 영역에서 입자를 실시간으로 볼 수 있을 때까지 기다립니다.

이미징 영역의 입자에 초점이 양호한 경우 Acquire를 클릭하여 암시야, 명시야, 녹색 형광 및 황색 형광에 대한 높은 처리량 방식으로 각 개체의 이미지를 동시에 획득합니다. 수집이 끝나면 Return 버튼을 클릭하여 샘플을 반환합니다. 이 단계를 반복하여 각 샘플에서 5, 000에서 10, 000개의 입자를 획득합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 물체 형광 강도 및 형태학적 변화를 결정하기 위해 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 원시 이미지 파일을 분석합니다. 웰당 200 마이크로리터의 최종 반응 부피를 사용하여 단계적으로 시약을 로딩하여 둥근 바닥의 저단백질 결합 96 웰 플레이트를 준비합니다. 먼저 컨트롤 웰을 준비합니다.

각 웰에 193마이크로리터의 PBS를 로드합니다. 환자 혈청 2.5%를 추가하고 웰당 하나의 혈청 샘플만 로드합니다. 그런 다음 화학 분석기 반응 플레이트에 플레이트를 올려 30초 동안 흔듭니다.

다음으로, 2마이크로리터의 형광 표지된 콜레스테롤 응집액을 각 웰에 추가합니다. 다시 Chemistry Analyzer-1 반응 플레이트에 플레이트를 올려 30초 동안 흔듭니다. 약물로 우물을 준비하려면 각 우물에 191마이크로리터의 PBS를 로드합니다.

그런 다음 웰당 각 환자 혈청 2.5%를 추가하고 chemistry analyzer-1 반응 플레이트에 올려 플레이트를 30초 동안 흔듭니다. 2마이크로리터의 에제티미브(ezetimibe), 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin) 또는 니아신(niacin) 용액을 음성 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 첨가합니다. 웰당 하나의 약물만 추가합니다.

이전과 같이 30초 동안 플레이트를 흔듭니다. 다음으로, 플레이트를 30초 동안 흔들기 전에 2마이크로리터의 형광 표지된 콜레스테롤 응집액을 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 200rpm으로 설정된 실험실 셰이커에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

배양 후 이전과 동일한 설정에 따라 유세포 분석을 이미징하여 샘플을 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 이미지 파일을 일괄 처리하려면 이미지 분석 소프트웨어를 사용하십시오. 여기에 나타난 것은 비효소적 메커니즘에 의해 스타틴에 의해 유도된 구형 및 선형 가닥 모양의 콜레스테롤 입자를 식별하는 것을 보여주는 대표적인 결과입니다.

다른 지질 저하 약물에 의해 유도되는 콜레스테롤 입자 형성의 두 가지 뚜렷한 형태가 확인되었습니다. 에제티미브, 니아신, 피브레이트, 오메가-3 지방산이 포함되어 있습니다. 여기에 표시된 것은 점도표이며, 여기서 X축은 녹색 형광 채널에서 검출된 콜레스테롤 입자의 스펙트럼을 표시합니다.

그리고 Y축은 측면 산란을 표시하고, 게이팅은 형광 점도표에서 감지된 매우 낮은 밀도의 지단백질, 저밀도 지단백질 및 고밀도 지단백질 입자의 영역을 표시합니다. 이러한 결과는 약물, 에제미드, 로바스타틴, 심바스타틴 및 니아신이 없는 상태에서 지질 저하 효과가 정제된 VLDL 및 LDL 콜레스테롤 입자의 프로필을 어떻게 변화시키는지를 보여줍니다. 여기에 보이는 것은 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자 형성의 프로파일을 조절하는 다양한 지질 저하 약물의 감별 효과를 식별하기 위한 3가지 다른 혈청 샘플의 스크린입니다.

이러한 프로파일은 세 가지 다른 혈청 샘플 간의 반응 수준에도 차이가 있음을 나타냅니다. 약물 없이 다양한 지질 저하제가 존재하는 상태에서 형성된 구형 및 선형 모양의 콜레스테롤 입자에 대한 혈청 샘플 1의 스크리닝은 혈청 유래 콜레스테롤 입자의 두 가지 뚜렷한 형태를 확인하여 구형 및 선형 가닥 모양을 모두 표시합니다. 따라서 우리는 콜레스테롤 입자 형성 및 그 임상적 중요성에 대한 관계를 조절하는 지질 저하 약물 효과를 식별하기 위한 체외 이미징 접근 방식을 성공적으로 입증했습니다.

우리의 예비 결과는 유망하며, 우리는 대규모 임상 샘플을 사용하여 이 플라크 어레이 분석을 추가로 검증하는 과정에 있습니다. 표준 지질 패널은 혈청 내 LDL 및 HDL 콜레스테롤 수치를 측정합니다. 당사의 플라크 어레이 분석법은 죽상동맥경화증 위험의 정확도를 높이고 혈청을 이용하여 지질저하약물 반응을 예측