최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 음성 염색 전자현미경의 고처리량 최적화 프로토콜을 사용하여 작고 비대칭적인 단백질의 이미지를 얻는 것입니다. 이는 먼저 음성 염색 작업대를 준비하는 동안 단백질을 준비된 배양 스테이션에서 배양함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 세 개의 물방울에서 샘플을 순차적으로 빠르게 세척하는 것입니다.

세 번째 단계는 세 개의 염색액 방울에 샘플을 순차적으로 조심스럽게 염색하는 것입니다. 마지막 단계는 EM 그리드의 뒷면을 블로팅하여 과잉 용액을 제거한 다음, 질소 가스 하에서 부드럽게 건조하는 것입니다. 결과적으로, 낮은 디포커스 조건의 TEM 이미징을 통해 작은 단백질의 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다.

이 기술의 저온 전자 현미경 대비 주요 장점은 다음과 같습니다. 이 방법은 기존의 네거티브 염색법에서 발생하는 구조적 아티팩트를 줄이면서, 작고 비대칭적인 단백질 구조에 대한 고처리량 검토와 고대비 이미징을 가능하게 합니다. 따라서 이 방법은 콜레스테롤 에스테르 전송 단백질과 같은 작은 단백질 기전의 구조적 기초에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

또한 이 방법은 크기가 매우 다양한 IgG 항체, 고밀도 지질단백질 및 프로테아좀과 같은 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다. 세척 및 염색 단계는 시간 차이가 있고 샘플 블로팅 정도에 따라 최종 염색된 단백질에 상당한 영향을 미칠 수 있어 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 절차를 시연함으로써 저희 실험실의 Z.A 연구원이 놓칠 수 있는 부분을 보완할 것입니다. 이 프로토콜을 준비할 때, 빛 노출을 최소화하는 데 각별히 주의하여 1% urinal form eight 용액을 제조해야 합니다.

여기에는 용액을 처음 여과할 때 시린지 0.2 micron 필터 부품을 호일로 감싸는 과정이 포함됩니다. 여과 후, 실험 당일에 2 mL씩 호일로 감싼 바이알 분주액을 -80 °C에서 보관하십시오. 실온의 워터 배스에서 분주액을 완전히 해동될 때까지 녹여 사용하십시오.

호일로 감싼 장치를 사용하여 0.02 micron 필터로 다시 여과합니다. 수집 바이알 또한 호일로 감싸야 합니다. 음성 염색액을 사용 전까지 아이스박스에 옮겨 보관하십시오.

8인치 길이의 파라필름을 피펫 팁 지지대에 눌러 액적 유지 시트를 만듭니다. 이렇게 하면 5mm 직경의 웰 역할을 하는 홈이 형성됩니다. 6줄의 웰을 만든 후, 스티로폼 트레이 표면의 얼음을 평평하게 펴고 그 위에 시트를 배치합니다.

다음으로, 왼쪽 시트의 처음 세 개 웰에 35 µL의 DI water를 넣습니다. 그런 다음 오른쪽 세 개 웰에 준비된 음성 염색 용액 35 µL를 로딩합니다. 용액의 빛 노출을 최소화하기 위해 트레이를 덮어줍니다.

이곳은 염색 스테이션으로 사용됩니다. 이제 핀셋을 장착할 수 있는 부착물이 있는 빈 피펫 팁 박스를 사용하여 EM 그리드 배양 스테이션을 준비하십시오. 핀셋을 장착했을 때 얼음 표면이 핀셋 끝에 가깝게 닿도록 박스의 절반을 얼음으로 채웁니다.

먼저 탄소 코팅된 300 mesh 구리 EM 그리드를 약 10초 동안 글로우 방전 처리합니다. 그다음, EM 그리드 배양 스테이션에 걸 수 있는 핀셋으로 그리드를 집어 듭니다. 그리드가 얼음 위 0.5인치 높이에서 45도 각도로 기울어지도록 핀셋과 그리드를 함께 걸어둡니다.

이제 단백질 샘플을 DPBS로 희석하여 용액 1mL당 단백질 농도가 50~100 µg이 되도록 합니다. 희석액 약 4 µL를 EM 그리드에 즉시 도포합니다. 샘플을 약 1분 동안 배양합니다.

1분 후에 필터 페이퍼로 메쉬를 빠르게 가볍게 눌러 여분의 용액을 제거합니다. 그 다음 염색 스테이션에서 파라필름 위의 첫 번째 물방울에 메쉬를 접촉시킵니다. 필터를 말리고 다음 물방울로 다시 적시는 과정을 빠르게 반복합니다.

총 세 방울의 물을 사용하며, 이 과정을 가능한 한 빠르게 수행하십시오. 버퍼의 변화가 단백질에 미치는 부정적인 영향을 방지하기 위해 그리드를 물로 세척하는 과정은 신속하게 이루어져야 합니다. 마지막 세척액을 3초 이내에 닦아낸 후, 즉시 그리드를 첫 번째 음성 염색 용액 방울 위에 띄우십시오.

10초 동안 그대로 띄워 둡니다. 그동안 핀셋의 끝부분을 여과지에 눌러 깨끗이 닦아냅니다. 10초간 띄워 둔 후, 여과지로 용액을 닦아내고 다음 염색액 방울에 2초 동안 다시 띄우는 과정을 반복합니다.

2초 동안 핀셋을 세척하십시오. 다음으로, 그리드의 물기를 닦아내고 세 번째 액적 위에 올리십시오. 이 단계 동안 1분 동안 염색 스테이션을 덮어두십시오.

그리드가 균일하게 건조되도록 하기 위해서는 EM 그리드의 뒷면을 정확한 시간 동안 접촉시켜 염색약을 제거해야 합니다. 여과지가 염색약에 너무 오래 접촉하면 염색약이 과도하게 제거되어 이미징 품질이 저하될 수 있습니다. 그 다음, 그리드를 건조하십시오.

먼저, 용액이 모두 옮겨질 때까지 비탄소 쪽 전체를 여과지에 접촉시킵니다. 둘째로, 질소 가스를 약하게 분사합니다. 이제 그리드를 여과지가 깔린 접시에 옮기고 접시를 부분적으로 덮습니다.

그리드를 디쉬 내에서 상온으로 30분 동안 건조하십시오. 또는, 지질을 포함하는 시료는 40 °C에서 1시간 동안 베이킹할 수 있습니다. 완전히 건조되면, TEM 정렬을 시작하기 전에 EM 그리드를 EM 그리드 보관함으로 옮기십시오.

음성 염색된 그리드의 카본 필름 영역의 파워 스펙트럼을 통해 가시적인 가장 높은 차수의 Thon 링 해상도를 확인하며, 이는 목표 해상도보다 더 좋아야 합니다. 그런 다음, 정렬을 조정하기 위해 시료의 카본 필름 영역에서 파워 스펙트럼을 세밀하게 확인합니다. 적절하게 정렬된 상태에서는 20개 이상의 Thon 링이 보이며, 이는 5 Å 미만의 해상도로 시각화됨을 의미합니다.

링은 1.6 µm의 디포커스와 Ų당 20.4 electrons의 조사량 조건에서 비정질 탄소 이미지의 푸리에 변환을 통해 생성되었습니다. 이제 EM 그리드를 검사하는 동안 소형 단백질 이미징을 위해 초점을 약 0.1 µm의 셔처(Scherzer) 초점 근접 조건으로 다시 조정하십시오. 이상적으로는, 저배율에서 염색된 영역은 보통 두껍게 염색된 구름 모양 영역의 가장자리 부근에 위치합니다.

지질단백질 시료의 구조를 OPNS로 관찰하였습니다. 관찰 예시에는 재조합 HDL, 인간 혈장, LDL, 인간 혈장 IDL 및 인간 혈장 VLDL이 포함됩니다. 53 kilodalton 크기의 CETP와 같은 더 작은 구조 또한 관찰하였습니다.

이것은 eem으로 성공적으로 이미징된 가장 작은 단백질 중 하나입니다. CETP 결정 구조를 겹쳐 놓았을 때 이미지와 매우 잘 일치하며, 매우 역동적입니다. 160 kilodalton immunoglobulin G 항체에서 불균일한 단백질 또한 관찰되었습니다.

세 개의 서브도메인이 명확하게 관찰되었습니다. IgG1 항체의 결정 구조와 비교하기 위해 해당 항체를 더욱 정밀하게 분석하였습니다. IgG1 항체의 결정 구조는 도메인의 위치와 형태 등 여러 면에서 이 항체들의 전자현미경(EM) 영상과 일치합니다.

관찰된 다른 분자로는 28 kilodalton의 지질 제거 apo lipoprotein A one grow EL 및 프로테아좀이 있습니다. 기본적으로, OPNS 방법은 소형 비대칭 구조에 대한 EM 이미징뿐만 아니라 관련된 메커니즘 연구의 경계를 크게 확장합니다. 이 절차를 수행할 때, 염색 시약에 대한 빛 노출을 최대한 줄여 시료를 빠르게 세척하고, 이미징 시 근사 초점(near treasure focus)을 사용하는 것이 중요합니다.

단일 분자의 나노미터 해상도 구조 및 그들 사이의 구조적 변화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전자 토모그래피와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 인간 혈장 지질단백질 간의 클러스터 에스테르 전이 매커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.