최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

더 많은 단백질의 절반 이상이 전자 현미경 영상과 3 차원 재구성 모두 도전하고 작은 단백질 (분자량 <200 kDa의)이다. 최적화 네거티브 염색 고 대비 및 비교적 높은 해상도 (~ 1 nm의) 다른 생리적 조건 하에서 작은 비대칭 또는 단백질 복합체의 이미지를 얻기 위해 견고하고 높은 처리량 프로토콜이다.

이 절차의 전반적인 목표는 음성 염색 전자 현미경의 고처리량 최적화 프로토콜을 사용하여 작고 비대칭적인 단백질을 이미지화하는 것입니다. 이는 먼저 준비된 배양 스테이션에서 단백질을 배양하는 동시에 음성 염색 워크스테이션을 준비함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 세 개의 물방울에 담긴 시료를 순차적으로 빠르게 세척하는 것입니다.

세 번째 단계는 세 개의 염색 방울에 샘플을 순차적으로 조심스럽게 염색하는 것입니다. 마지막 단계는 EM 그리드의 뒷면을 블로팅한 다음 질소 가스에서 부드럽게 건조시켜 초과 용액을 제거하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 낮은 디포커스 조건에서 TEM 이미징을 통해 작은 단백질의 고해상도 이미지를 보여줄 수 있습니다.

극저온 전기 현미경에 비해 이 기술의 주요 장점이 설정됩니다. 이를 통해 작은 비대칭 단백질 구조에 대한 고처리량 검사와 고대비 이미징을 수행할 수 있으며 기존의 음성 염색으로 인한 구조 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 이 방법은 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질과 같은 작은 단백질 메커니즘의 구조적 기초에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 크기가 매우 다양한 IgG 단일 항체, 고밀도 지단백질 및 프로테아솜과 같은 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다. 타이밍의 변화로 인해 세척 및 염색 단계를 배우기가 어렵고 샘플 블로팅조차도 완성 된 염색 된 단백질에 극적인 효과를 일으킬 수 있기 때문에이 방법의 시각적 시연은 중요합니다. 이 프로토콜을 준비할 때 1% 소변기 폼 에이트 용액을 만들고 빛에 대한 노출을 최소화하는 데 최대한의 주의를 기울여

여기에는 용액을 처음 여과할 때 주사기 N 0.2 미크론 필터 부품을 호일로 감싸는 것이 포함됩니다. 여과 후, 실험 당일 2밀리리터 호일로 포장된 바이알 부분 표본을 섭씨 음의 80도에서 보관합니다. 완전히 해동된 후 실온 수조에서 부분 표본을 해동합니다.

부품을 호일로 감싼 0.02 미크론 필터를 통해 다시 필터링합니다. 수집 바이알도 호일로 싸야 합니다. 사용할 때까지 음극 얼룩을 아이스박스에 옮깁니다.

8인치 길이의 파라마를 피펫 팁 지지대에 눌러 액적 고정 시트를 만듭니다. 이것은 5mm 직경의 우물 역할을 하는 도로 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 6줄의 우물을 만든 후 스티로폼 트레이 표면의 얼음을 평평하게 만든 다음 시트를 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 왼쪽에 있는 시트의 처음 세 개의 웰에 35마이크로리터의 DI 물을 추가합니다. 그런 다음 준비된 35마이크로리터의 음성 염색 용액을 시트에 3개의 오른쪽 웰에 로드합니다. 용액에 대한 빛 노출을 최소화하기 위해 트레이를 덮습니다.

이것은 염색 스테이션 역할을 합니다. 이제 핀셋을 장착할 수 있는 부착물이 있는 빈 피펫 팁 상자에서 EM 그리드 인큐베이션 스테이션을 준비합니다. 핀셋을 장착할 때 얼음 표면이 핀셋 끝에 가까워지도록 상자를 반쯤 얼음으로 채웁니다.

첫 번째 글로우 : 얇은 탄소 코팅 300 메쉬 구리 EM 그리드를 약 10 초 동안 방전합니다. 다음으로, EM 그리드 인큐베이션 스테이션에 연결되는 핀셋으로 그리드를 선택합니다. 핀셋을 그리드와 함께 걸어 그리드가 얼음 위 반 인치 위로 45도 기울어지도록 합니다.

이제 DPBS의 단백질 샘플을 용액 1밀리리터당 50-100마이크로그램의 단백질로 희석합니다. 즉시 약 4마이크로리터의 희석액을 EM 그리드에 적용합니다. 샘플을 약 1분 동안 배양합니다.

1분 후 여과지로 메쉬를 빠르게 두드려 과도한 용액을 제거합니다. 그런 다음 염색 스테이션에서 파라 필름의 첫 번째 물 한 방울에 메쉬를 만집니다. 필터를 건조시키고 다음 물방울로 다시 만드는 과정을 빠르게 반복합니다.

총 3개의 물방울을 사용하고 가능한 한 빨리 이 작업을 수행하십시오. 그리드를 물로 세척하는 것은 단백질에 대한 완충액 변화의 부작용을 피하기 위해 신속하게 수행해야 합니다. 3초 이내에 마지막 세척을 두드린 후 첫 번째 음수 염색 용액에 그리드를 띄우기 시작합니다.

10초 동안 거기에 띄우십시오. 한편, 핀셋 끝을 여과지에 눌러 청소합니다. 10초 플로트 후 몇 번 여과지로 용액을 닦아내고 다음 얼룩 방울에서 2초 동안 다른 플로트를 시작합니다.

2초 동안 핀셋을 청소합니다. 다음으로, 그리드를 닦아내고 세 번째 물방울에 놓습니다. 이 단계에서 염색 스테이션을 1분 동안 덮습니다.

얼룩 제거는 그리드가 균일하게 건조되도록 정확한 시간 동안 EM 그리드의 뒷면을 만져 수행해야 합니다. 여과지가 얼룩에 너무 오래 닿으면 얼룩이 너무 많이 제거되어 이미징 불량이 발생할 수 있습니다. 다음으로 그리드 건조를 진행합니다.

먼저 용액이 떨어질 때까지 탄소가 없는 면 전체를 여과지에 만집니다. 둘째, 질소 가스를 부드럽게 주입합니다. 이제 그리드를 여과지가 깐 접시로 옮기고 접시를 부분적으로 덮습니다.

그리드를 실온에서 30분 동안 접시에서 건조시킵니다. 또는 지질이 포함된 샘플을 섭씨 40도에서 한 시간 동안 베이킹할 수 있습니다. 완전히 건조되면 EM 그리드를 EM 그리드 보관 상자로 옮기고 먼저 시작하기 전에 TEM을 정렬합니다.

네거티브로 염색된 그리드의 탄소 필름 영역의 파워 스펙트럼으로 가장 높은 가시적 해동 링의 해상도를 확인하며, 이는 목표 해상도보다 좋아야 합니다. 그런 다음 정렬을 조정하려면 시편의 탄소 필름 영역의 전력 스펙트럼을 주의 깊게 확인하십시오. 적절하게 정렬된 조건에서 20개 이상의 T 고리를 시각화할 수 있으며, 이는 5옹스트롬보다 더 나은 시각화에 해당합니다.

고리는 1.6 미크론의 디 포커스와 평방 당 20.4 전자의 선량 하에서 비정질 탄소 이미지의 모피 전달에 의해 만들어졌습니다. 옹스트롬. 이제 EM 그리드를 검사하는 동안 작은 단백질 이미징을 위해 약 0.1마이크로미터의 Scherzer 초점 상태에 가깝게 초점을 다시 가져옵니다. 이상적으로, 얼룩진 영역은 일반적으로 낮은 배율에서 더 두껍고 얼룩진 흐린 영역의 가장자리 근처에 있습니다.

지단백질 표본의 구조는 OPNS로 관찰되었습니다. 예를 들어 재조합 HDL, 인간 혈장, LDL, 인간 혈장 IDL 및 인간 혈장 VLDL이 있습니다. 53 킬로달톤, CETP와 같은 더 작은 구조물도 관찰되었습니다.

이것은 eem에 의해 성공적으로 이미징된 가장 작은 단백질 중 하나입니다. CETP 결정 구조의 슈퍼 임포지션은 이미지와 매우 잘 일치하고 매우 역동적입니다. 이종 단백질은 또한 160개의 킬로달톤 면역글로불린 G 항체에서 관찰되었습니다.

세 개의 하위 도메인이 명확하게 보였습니다. IgG에 대한 면밀한 검사는 결정 구조를 비교하기 위해 하나의 항체를 사용하는 데 사용되었습니다. IgG one 항체의 결정 구조는 도메인 위치 및 모양과 같은 여러 가지 면에서 이러한 항체의 EM 보기와 일치합니다.

다른 것으로 보이는 분자에는 28 kilodalton, 지질이 없는 apo lipoprotein A one grow EL 및 프로테아좀이 포함됩니다. 기본적으로 OPNS 방법은 절차를 시도하는 동안 관련 기계론적 연구뿐만 아니라 작은 비대칭 구조에 대한 EM 이미징의 경계를 크게 발전시킵니다. 염색 시약에 대한 빛 노출을 최대한 줄여 표본을 빠르게 세척하고 이미징을 위해 보물 초점 근처에서 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따릅니다.

전자 단층 촬영과 같은 다른 방법은 단일 분자의 나노미터 분해능 구조 및 이들 간의 확인 변화와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 개발 이후, 이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 인간 혈장 지단백질 사이의 클러스터 에스테르 전달 자석을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.