청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.

이 전기생리학적 분석의 전반적인 목표는 출생 후 발달 중 달팽이관 유모 세포의 형태학적 및 기능적 변화를 조사하는 것입니다. 이 방법은 청각 보조 부서 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 출생 후 새끼 쥐에서 분리된 개별 유모 세포의 기능을 평가할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 학생들인 Wenlu Pan, Shasha Guo 및 Nana Xu입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 동물을 폴리에틸렌 폼 틀에 넣어 동물의 몸을 움직이지 못하게 합니다. 그런 다음 동물을 소음 감쇠실의 진동 방지 테이블에 놓습니다.

발열 패드로 동물의 체온을 섭씨 37.5도로 유지하십시오. 다음으로 70% 에탄올로 머리 부분을 닦습니다. 외부 귓바퀴까지 복부 측면으로 1-2mm 절개를 만들어 기준 전극 또는 접지 전극을 배치합니다.

그런 다음 두개골 꼭짓점 위에 피하 기록 전극을 놓습니다. 함수 발생기를 사용하여 다양한 주파수와 강도의 보정된 톤 버스트를 생성할 수 있습니다. 동물의 머리에서 10cm 떨어진 곳에 있는 정전기 스피커를 통해 소리 자극을 전달합니다.

청각 뇌간 반응을 얻기 위해 소리로 유발된 전위는 다기능 프로세서를 사용하여 필터링, 증폭 및 평균화됩니다. 40분 ABR 기록은 온라인으로 모니터링되고 오프라인 분석을 위해 저장됩니다. 이 섹션에서는 70% 에탄올을 분사하여 동물의 머리를 살균합니다.

그런 다음 시상 정중선을 따라 두개골을 가위로 열고 뇌를 제거하여 내이를 노출시킵니다. 그런 다음 내이를 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 Medium 3ml로 채운 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 가는 집게를 사용하여 달팽이관의 뼈낭을 제거합니다.

그런 다음 modiolus에서 연결된 OC 및 SV의 래핑을 해제합니다. SV의 기저 부분을 겸자로 잡고 기저부에서 정점까지 천천히 풀어 SV에서 OC를 완전히 분리합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 OC를 세 조각으로 골고루 자릅니다.

모든 단계는 분해 및 조직 열화를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 얼음처럼 차가운 L-15에서 수행해야 합니다. 이 단계에서는 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 OC 세그먼트를 유리 슬라이드로 옮깁니다. 100 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 섭씨 4 도에서 최소 4 시간 동안 고정하십시오.

그런 다음 파라포름알데히드를 100마이크로리터의 새 PBS로 대체하여 조직을 씻습니다. 그런 다음 매번 10분씩 티슈를 세 번 씻습니다. 그 후, PBS에 0.3%투과성제로 조직을 실온에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후 투과제를 버리고 PBS로 조직을 3회 세척합니다. 그 후, 실온에서 1시간 동안 10% 정상 염소 혈청과 PBS로 조직을 차단합니다. 항프레스틴 C 말단 항체와 차단 용액으로 조직을 실온에서 2시간 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 PBS로 5분씩 조직을 세 번 씻습니다. 그 후, Alexa 488-conjugated secondary antibody in blocking solution으로 조직을 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 어둠 속에서 매번 5분 동안 PBS로 조직을 세 번 씻습니다.

다음으로, 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 로다민 팔로이딘으로 조직을 배양합니다. 어둠 속에서 5분 동안 PBS로 티슈를 세 번 씻습니다. 그런 다음 장착 매체가 있는 유리 슬라이드에 샘플을 장착합니다.

405 나노미터, 488 나노미터 및 594 나노미터 레이저를 사용하는 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 이 절차에서는 피펫 풀러와 마이크로포저를 사용합니다. 팁 직경이 2-3 미크론인 패치 피펫을 만드십시오.

그런 다음 세포 내 용액으로 피펫을 다시 채웁니다. 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 OC 조각을 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 100마이크로리터의 효소 분해 배지로 실온에서 5분 동안 조직을 소화합니다.

다음으로, 효소 소화 매체를 100 마이크로 리터의 L-15로 대체합니다. 유모 세포를 분리하기 위해 미세 메스를 사용하여 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 부드럽게 피펫팅한 후, 효소가 없는 수조 용액으로 채워진 집에서 만든 작은 플라스틱 챔버로 세포를 옮깁니다.

그런 다음 챔버를 도립 현미경의 스테이지에 놓고 건강해 보이는 단독 OHC를 찾습니다. 그런 다음 패치 피펫을 700B 증폭기의 헤드 스테이지에 로드합니다. 바깥쪽 유모 세포의 아래쪽에 패치 피펫을 놓습니다.

그 후, 전체 세포 패치는 세포체의 측벽을 밀봉하여 OHC를 고정합니다. 세포막이 파열될 때까지 가볍게 흡입합니다. 그런 다음 유지 전위를 70밀리볼트로 설정합니다.

10 - 17 메가옴 범위의 접근 저항과 100 - 500 메가옴 범위의 멤브레인 저항을 가진 세포는 성공적인 전체 세포 구성으로 간주됩니다. 과분극 및 탈분극 전압을 셀에 적용하여 전체 셀 전류를 유도합니다. 패치 클램프 소프트웨어에 의해 제어되는 2개의 사인파 전압 자극 프로토콜을 사용하여 OHC의 멤브레인 커패시턴스를 측정합니다.

자극 전압 범위를 140에서 110밀리볼트로 설정하고 오프라인 분석을 위해 데이터를 저장합니다. 부드러운 소화 후, OHC는 OC에서 분리되었습니다. 전체 세포 전압 클램프 기록은 쥐 달팽이관에서 급성으로 분리된 OHC에서 수행되었습니다. 멤브레인 전위가 140 밀리 볼트에서 107 밀리 볼트로 변화함에 따라 분리 된 P9 OHC에서 기록 된 전체 셀 전류의 대표적인 예가 여기에 나와 있습니다.

이 그림은 서로 다른 연대에서 두 개의 OHC에서 얻은 비선형 멤브레인 커패시턴스를 보여줍니다. 커패시턴스 전압 응답은 Boltzmann 함수에 장착되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 유모 세포에서 프레스틴과 같은 일부 단백질의 발현 수준을 평가하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 웨스턴 블로팅 및 PCR과 같은 다른 조치를 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 유모 세포 분야의 연구자들이 달팽이관과 전정계의 전기생리학적 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 산후 발달 중 달팽이관 유모 세포의 형태학적 및 기능적 변화를 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.