Name: 청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 출생 후 쥐의 외부 머리 세포에서 전체 셀 패치 클램프 기록을 이용한 청각 뇌간 응답 측정 방법입니다. 이 기술은 개별 머리 세포의 기능 평가와 청각 발생 시점의 생물학적 변화 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 973 프로그램 (2014CB943002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (11534013, 31500841)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

동물 주제와 관련 된 모든 실험 프로토콜 남부 의과대학의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험에 대 한 솔루션을 준비 합니다.
<ol><li>마 취 준비 ( 재료의 표참조): 1.5 %pentobarbital 나트륨 ddH2오에에서 녹아</li>
	<li>해 부 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): 1 M NaOH와 ddH2O. 조절 pH 7.3 1 리터에 Leiboviz의 L-15 분말의 1 개의 부 대를 해산. 300-330 mOsm osmolarity osmometer를 사용 하기 전에 10 mM HEPES 사용 하 여 조정 합니다.</li>
	<li>2 mg/mL 콜라 IV 해산 ( 재료의 표참조) 해 부 솔루션 단계 1.2 준비.</li>
	<li>( 재료의 표참조) immunostaining 솔루션 준비: 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde 해산. 주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.</li>
	<li>0.3% 침투성 에이전트 PBS에 희석. 블로킹 버퍼 PBS에 10% 정상 염소 혈 청을 희석. 블로킹 버퍼에서 prestin 항 체 1: 200을 희석. 블로킹 버퍼에 Alexa488 활용 된 항 체 1:600 희석. Phalloidin Tetramethylrhodamine B isothiocyanate 1: 200 PBS에 희석.</li>
	<li>Extracellular 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 Leiboviz의 L-15 매체를 준비.</li>
	<li>세포내 솔루션 준비 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>2. ABR 기록
참고: ABR 녹음 이전 설명 하고있다9우리의 이전 연구 자세히.
<ol><li>Sprague Dawley (SD) 쥐 (1-14 주 오래 된 강아지와 2 개월 된 성인, 남녀) 1.5% 나트륨 pentobarbital (새끼에 대 한 22 mg/kg과 30 mg/kg 성인, 복 (i.p.))의 단일 주사로 anesthetize.</li>
	<li>동물의 신체를 고정 하는 폴 리 에틸렌 거품 형에 마 취 동물을 배치 합니다. 동물 소리 약하게 방에 방진 테이블에 놓습니다. 생리대와 37.5 ° C에서 동물의 체온을 유지.</li>
	<li>70% (vol/vol) 에탄올과 머리 영역을 닦으십시오. 좋은 위를 사용 하 여에 게 1-2 m m 절 개를 ventrolateral 참조 전극 또는 지상에 외부 pinna. 쳇 바늘 전극 (기록 전극)는 두개골 꼭지점 (그림 1A)에 있습니다.</li>
	<li>다양 한 주파수의 보정된 음색 파열 (1 ms 상승/하강, 3 ms 고원) 생성 함수 발생기를 사용 하 여 (2, 4, 8, 16, 24 및 32 kHz)와 강도 (dB 5 단계에서 10 dB SPL 85에서 감소). 주파수와 진폭을 수동으로 다 또는 컴퓨터를 사용 하 여. 동물의 머리 쪽으로 떨어져 10 cm에 있는 정전기 스피커를 통해 소리 자극을 제공 합니다.</li>
	<li>(100-1000 Hz)를 필터링 하 고 증폭 (256 회) 사운드 이끌려 잠재력에 Abr를 다기능 프로세서를 사용 하 여 평균. 온라인 및 오프 라인 분석을 위해 저장 된 ABR 추적 모니터링 됩니다. 그것은 하나의 동물에서 녹음 하는 ABR을 완료 하는 데 약 40 분 걸립니다. 참고: 일반적으로, 3 ~ 7 봉우리 (파 나 파 7 세) 대기 시간은 15 ms 수 보다 적게 식별 (그림 1B). ABR 임계값 어느 파에 I와 II는 검출 될 수 있는 최소 소리 수준으로 정의 됩니다.</li>
	<li>안락사 (0.3 mL 1.5% 나트륨 pentobarbital 복 주사)와 마 취에서 깨어 동물 전에.</li>
</ol>3. 장기의 Corti (OC) 해 부
<ol><li>쥐 새끼 anesthetize 쥐 보다 6 일 이전에 대 한 (< P6), 100 mm 문화 접시에 있는 동물을 유지 하 고 10 분 동안 얼음 접시 커버. 쥐를 위해 > P6, 1.5% 나트륨 pentobarbital (22 mg/kg, i.p.)의 단일 주입으로 동물을 anesthetize. 마 취 후 쥐 새끼를 목을 벨.</li>
	<li>70% (vol/vol) 에탄올을 분사 하 여 머리를 소독.</li>
	<li>가 위; 화살 중간에 따라 두개골을 열으십시오 내가 폭로 뇌를 제거 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 L-15 (그림 2A)의 3 mL 가득 35 mm 페 트리 접시로 내가 전송 합니다.</li>
	<li>해 부 현미경 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관 (그림 2B)의 뼈 캡슐을 제거 하.</li>
	<li>OC를 풀 다 및 관련 흔 vascularis (SV)는 modiolus에서.</li>
	<li>개최 하 여 집게와 SV의 기저 부분 구분 OC SV에서 완전히 기지에 정점 (그림 2C)에서 천천히 해제 합니다.</li>
	<li>잘라 OC 균등 하 게 3 개의 조각으로 고급가 위 (그림 2D)를 사용 하 여.</li>
</ol>4. 면역 형광 염색
<ol><li>200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 유리 슬라이드에 OC (3.8 단계)의 세그먼트를 전송 하 고 적어도 4 h 4 ° c.에 대 한 4 %paraformaldehyde 100 µ L로 수정 주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.</li>
	<li>신선한 PBS의 100 µ L로 paraformaldehyde 여 조직을 씻어. 워시 3 시간 10 분 대 한 조직.</li>
	<li>실 온에서 30 분 PBS에 0.3% 침투성 에이전트 조직 품 어.</li>
	<li>PBS에 침투성 에이전트를 삭제 하 고 세 번 PBS 가진 조직 씻어.</li>
	<li>10% 정상 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h와 함께 차단 합니다.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C에서 2 시간에 대 한 솔루션을 차단에 안티-prestin-C-말단 항 체 (1: 200)로 품 어.</li>
	<li>5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.</li>
	<li>Alexa488 활용 된 이차 항 체 (1:600)와 함께 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션에서 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 rhodamine-phalloidin (1: 200)으로 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.</li>
	<li>장착 매체 (DAPI 포함) 유리 슬라이드에 탑재 합니다. Confocal 현미경 검사 법 405를 사용 하 여 이미지 nm, 488 nm, 그리고 594 nm 레이저. 0.1-0.5에서 레이저 전원 설정 mW 및 스캔 속도 0.5 프레임/s에서.</li>
</ol>5. 패치 클램프 격리 OHCs의 기록
<ol><li>피펫은 끌어당기는 사람을 사용 하 고 마이크로-위조 패치를 pipettes 팁 직경 2-3 µ m. 다시 채우기 세포내 솔루션 펫. 일반적으로, 패치 피 펫의 초기 저항 2.5-3.5 m ω 목욕 솔루션에서 이었다.</li>
	<li>200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 (단계 3.8)에서 OC의 조각 35 mm 페 트리 접시에 전송 합니다. 소화 효소 소화 매체의 100 µ L와 조직 (콜라 4, 참조 테이블의 재료) 실 온에서 5 분.</li>
	<li>효소 소화 매체 L-15의 100 µ L로 치환 조직에서 세포를 분리 하는 마이크로 메스를 사용 하 여 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>부드러운 pipetting 후 만든 작은 플라스틱 챔버로 셀 전송 (직경 ~ 1.5 c m) 효소 무료 목욕 솔루션으로 가득 (~ 1.5 mL 재료의 표참조).</li>
	<li>챔버는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 합니다. 건강 한 나타나는 독방 OHCs 찾아.</li>
	<li>700B 앰프의 헤드 단계에 패치 피 펫을 로드 합니다. micromanipulator에 의해 패치 피 펫을 신중 하 게 이동 하 고 외부 머리 세포 (그림 3A)의 바닥의 주위에 위치.</li>
	<li>전체 셀 패치 클램프 세포 체의 측면 벽을 씰링 하 여 OHC 세포 막 파열까지 가벼운 흡입을 적용 합니다. 개최 잠재적인 설정-70 mV. 셀 액세스 저항 10에서 17 m ω에 배열 했다와 막 저항 500 m ω, 100에서 배열 했다 그리고 성공적인 전체 셀 구성으로 간주 됩니다.</li>
	<li>Hyperpolarizing 및 depolarizing 전압 적용 컴퓨터 제어를 사용 하 여 (250 ms 기간 및 −140에서 +94에 이르기까지 13 mV 단계에 mV) 전체 셀 전류를 유도 하는 셀.</li>
	<li>전체 셀 전류를 증폭, 700B 증폭기 (5 kHz의 코너 주파수) 필터링. 1440A 컨버터 및 오프 라인 분석에 대 한 저장소로 데이터를 변환 합니다.</li>
	<li>패치 클램프 소프트웨어에 의해 제어 하는 두 개의 사인파 전압 자극 프로토콜을 사용 하 여 OHCs의 막 커패시턴스를 측정 합니다. 110-140에서 stimulate 전압 범위 설정 mV. 오프 라인 분석을 위해 데이터를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

쥐 날 11 미만, 청각 피 질6,7소리 자극에 대 한 응답에서 행동 잠재력을 관찰 수 있었다. 따라서, 출생 후 하루 11 "청각 발병"10로 설명 되어 있습니다. 청각 기능 공부 하기 전에 청력 발병은 하지 잘 아직 개발. 성인 ABR 녹음에 대 한 유사한 방법을 사용 하 여, Abr P11 보다 젊은 쥐 새끼에서 순수한 톤 버스트 여 elicited 될 수 보여 줍니다 (그림 1). 그러나, 쥐 새끼에서 얻은 ABR 파형 성인 동물의 몇 가지 다른 기능을 보여주었다. ABR 응답은 상대적으로 높은 임계값과 진폭에 작은. 이 결과 개발 청각 시스템 사운드 신호를 낮은 감도 것을 의미 합니다. 중요 한 차이 쥐 새끼에서 기록 하는 ABR 파형에서 관찰 되었다. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 ABR 파형<sup class=...

달팽이 관의 감각 세포의 두 가지 기능 포유류 청각을 위해 필수적입니다: mechanoelectric 변환 (메트로) 및 electromotility1,2. 메트로 채널 머리 번들, IHCs (IHCs) 및 막 잠재적인 변경으로 OHCs 변환 사운드 진동 뿐만 아니라 innervated 나선형 ganglion 신경의 전기 신호에 의해 OHCs 막 잠재력과 셀 길이 변경 하 고 낮은 수준의 소리의 진동 증폭. Electromotility 나이 활동 OHCs3의 측면 벽에 있는 모터 단백질 prestin에 의해 파생 됩니다.
많은 종의 설치류를 포함 하 여, 청각 기능 초기 산 후 신 기원4,5에 성숙 하지 않습니다. 사운드 신호에 대응에서 행동 잠재력 심리 발병6,7전에 청각 피 질에서 검출 될 수 있습니다. 형태학의 개발 및 달팽이 관의 기능 마우스, 햄스터, 쥐4,5,8에서 널리 공부 되었습니다 했다. Mechanotransduction 및 electromotility 세포의 또한 개발 초기 생명 시대5.
다른 산 후 나가에 쥐의 청각 감도 평가 하기 위해 청각 brainstem 응답 (ABR) 쥐 새끼에 기록 하는 방법을 개발 했습니다. 전체 셀 패치 클램프 electrophysiologically는 OHCs를 조사 하는 이상적인 기술입니다. 그러나, 전체 셀 씰링의 저속 절연된 OHCs의 electromotility의 조사 제한 된 신경 세포와 다른 상피 세포에서 수행 하는 패치 클램프와 비교.
여기는 산 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에 형태학 상으로 electrophysiologically는 OHCs을 조사 하는 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 내부 머리 전지 개발 및 기능을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>마취</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨</td><td>시그마</td><td>P3761</td><td>1.5% 수중</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dissection solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz의 L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 팩 1 L 물</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 IV</td><td>시그마</td><td>C5138</td><td>2 mg/mL in L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>7365-45-9</td><td>10</td></tr> <tr><td>mMName</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Immunostaining solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>PBS</td></tr> Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% PBS 중 10% PH 7.3 파라<tr><td>포름알데히</td><td></td><td>158127</td><td></td>드</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프레스틴 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Name</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Extracellular solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz의 L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1L 물에 1팩</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>세포내 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>시그마</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>67-42-5</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>7365-45-9</td><td>10</td></tr> <tr><td>mMName</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 basic</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>WPI</td><td>14095</td><td>핀셋 dumont</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>미니 운영 체제</td><td>셔터 기기</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>저잡음 데이터 수집 시스템</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 발표자</td>: <td>Tucker-Davis Technologies TDT 시스템, 3 Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP 소프트웨어</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSigRP 소프트웨어</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>남부 의과 대학의</td><td></td><td></td> <td>SD 쥐</td> 실험 동물 센터</tr></tbody></table>

청각 brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

외부 머리 세포 포유류 달팽이 관의 감각 세포의 두 종류 중 하나입니다. 그들은 약한 진동의 저수준 사운드 신호를 증폭 하는 잠재적인 수용 체와 그들의 셀 길이 변경 합니다. 형태학 및 electrophysiological 속성 외부 머리 세포 (OHCs)의 이른 출생 후 년에 발전 한다. 외부 머리 세포의 성숙 청각 시스템의 발전에 기여할 수 있습니다. 그러나, OHCs 개발의 과정은 잘 공부 하지. 이 부분적으로 electrophysiological 접근 하 여 그들의 기능을 측정 하는 데 어려움입니다. 위의 문제를 해결 하는 간단한 방법을 개발, 목적 여기 우리가 출생 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에서 OHCs의 기능을 공부 하는 단계별로 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법으로 순수 톤 자극에 인공 응답을 평가 하 고 식 수준 및 OHCs에 모터 단백질 prestin의 기능 검사 수 있습니다. 이 메서드는 또한 내부 세포 (IHCs) 조사를 사용할 수 있습니다.

ABR에서 마 취 쥐 새끼 산 후 제 7 일 보다 오래 된 (P7) 순수한 톤 버스트 (그림 1A)를 사용 하 여 elicited 될 수 있습니다. 그림 1B같이 ABR 파형 쥐 새끼만 3 ~ 4 가지 파도 작은 진폭 보여준에서 얻은. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 동물 (그림 1B)의 ABR 파형에서 관찰 되었다.
다음 immunostaining 및 electrophysiological 측정, 쥐 귀 갓 측 뼈에서 해 부 했다. 우리는 SV를 modiolus (그림 2A-2 C) OC...

이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

이 전기생리학적 분석의 전반적인 목표는 출생 후 발달 중 달팽이관 유모 세포의 형태학적 및 기능적 변화를 조사하는 것입니다. 이 방법은 청각 보조 부서 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 출생 후 새끼 쥐에서 분리된 개별 유모 세포의 기능을 평가할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 학생들인 Wenlu Pan, Shasha Guo 및 Nana Xu입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 동물을 폴리에틸렌 폼 틀에 넣어 동물의 몸을 움직이지 못하게 합니다. 그런 다음 동물을 소음 감쇠실의 진동 방지 테이블에 놓습니다.발열 패드로 동물의 체온을 섭씨 37.5도로 유지하십시오. 다음으로 70% 에탄올로 머리 부분을 닦습니다. 외부 귓바퀴까지 복부 측면으로 1-2mm 절개를 만들어 기준 전극 또는 접지 전극을 배치합니다.그런 다음 두개골 꼭짓점 위에 피하 기록 전극을 놓습니다. 함수 발생기를 사용하여 다양한 주파수와 강도의 보정된 톤 버스트를 생성할 수 있습니다. 동물의 머리에서 10cm 떨어진 곳에 있는 정전기 스피커를 통해 소리 자극을 전달합니다.청각 뇌간 반응을 얻기 위해 소리로 유발된 전위는 다기능 프로세서를 사용하여 필터링, 증폭 및 평균화됩니다. 40분 ABR 기록은 온라인으로 모니터링되고 오프라인 분석을 위해 저장됩니다. 이 섹션에서는 70% 에탄올을 분사하여 동물의 머리를 살균합니다.그런 다음 시상 정중선을 따라 두개골을 가위로 열고 뇌를 제거하여 내이를 노출시킵니다. 그런 다음 내이를 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 Medium 3ml로 채운 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 가는 집게를 사용하여 달팽이관의 뼈낭을 제거합니다.그런 다음 modiolus에서 연결된 OC 및 SV의 래핑을 해제합니다. SV의 기저 부분을 겸자로 잡고 기저부에서 정점까지 천천히 풀어 SV에서 OC를 완전히 분리합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 OC를 세 조각으로 골고루 자릅니다.모든 단계는 분해 및 조직 열화를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 얼음처럼 차가운 L-15에서 수행해야 합니다. 이 단계에서는 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 OC 세그먼트를 유리 슬라이드로 옮깁니다. 100 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 섭씨 4 도에서 최소 4 시간 동안 고정하십시오.그런 다음 파라포름알데히드를 100마이크로리터의 새 PBS로 대체하여 조직을 씻습니다. 그런 다음 매번 10분씩 티슈를 세 번 씻습니다. 그 후, PBS에 0.3%투과성제로 조직을 실온에서 30분 동안 배양합니다.30분 후 투과제를 버리고 PBS로 조직을 3회 세척합니다. 그 후, 실온에서 1시간 동안 10% 정상 염소 혈청과 PBS로 조직을 차단합니다. 항프레스틴 C 말단 항체와 차단 용액으로 조직을 실온에서 2시간 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.그런 다음 PBS로 5분씩 조직을 세 번 씻습니다. 그 후, Alexa 488-conjugated secondary antibody in blocking solution으로 조직을 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 어둠 속에서 매번 5분 동안 PBS로 조직을 세 번 씻습니다.다음으로, 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 로다민 팔로이딘으로 조직을 배양합니다. 어둠 속에서 5분 동안 PBS로 티슈를 세 번 씻습니다. 그런 다음 장착 매체가 있는 유리 슬라이드에 샘플을 장착합니다.405 나노미터, 488 나노미터 및 594 나노미터 레이저를 사용하는 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 이 절차에서는 피펫 풀러와 마이크로포저를 사용합니다. 팁 직경이 2-3 미크론인 패치 피펫을 만드십시오.그런 다음 세포 내 용액으로 피펫을 다시 채웁니다. 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 OC 조각을 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 100마이크로리터의 효소 분해 배지로 실온에서 5분 동안 조직을 소화합니다.다음으로, 효소 소화 매체를 100 마이크로 리터의 L-15로 대체합니다. 유모 세포를 분리하기 위해 미세 메스를 사용하여 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 부드럽게 피펫팅한 후, 효소가 없는 수조 용액으로 채워진 집에서 만든 작은 플라스틱 챔버로 세포를 옮깁니다.그런 다음 챔버를 도립 현미경의 스테이지에 놓고 건강해 보이는 단독 OHC를 찾습니다. 그런 다음 패치 피펫을 700B 증폭기의 헤드 스테이지에 로드합니다. 바깥쪽 유모 세포의 아래쪽에 패치 피펫을 놓습니다.그 후, 전체 세포 패치는 세포체의 측벽을 밀봉하여 OHC를 고정합니다. 세포막이 파열될 때까지 가볍게 흡입합니다. 그런 다음 유지 전위를 70밀리볼트로 설정합니다.10 - 17 메가옴 범위의 접근 저항과 100 - 500 메가옴 범위의 멤브레인 저항을 가진 세포는 성공적인 전체 세포 구성으로 간주됩니다. 과분극 및 탈분극 전압을 셀에 적용하여 전체 셀 전류를 유도합니다. 패치 클램프 소프트웨어에 의해 제어되는 2개의 사인파 전압 자극 프로토콜을 사용하여 OHC의 멤브레인 커패시턴스를 측정합니다.자극 전압 범위를 140에서 110밀리볼트로 설정하고 오프라인 분석을 위해 데이터를 저장합니다. 부드러운 소화 후, OHC는 OC에서 분리되었습니다. 전체 세포 전압 클램프 기록은 쥐 달팽이관에서 급성으로 분리된 OHC에서 수행되었습니다. 멤브레인 전위가 140 밀리 볼트에서 107 밀리 볼트로 변화함에 따라 분리 된 P9 OHC에서 기록 된 전체 셀 전류의 대표적인 예가 여기에 나와 있습니다.이 그림은 서로 다른 연대에서 두 개의 OHC에서 얻은 비선형 멤브레인 커패시턴스를 보여줍니다. 커패시턴스 전압 응답은 Boltzmann 함수에 장착되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라 유모 세포에서 프레스틴과 같은 일부 단백질의 발현 수준을 평가하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 웨스턴 블로팅 및 PCR과 같은 다른 조치를 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 유모 세포 분야의 연구자들이 달팽이관과 전정계의 전기생리학적 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 산후 발달 중 달팽이관 유모 세포의 형태학적 및 기능적 변화를 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

포유류의 달팽이관에있는 내부 헤어 셀 리본 버렸네에서 청각 신경 섬유 dendrites에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

이 비디오는 새끼 쥐의 청각 뇌간 반응(ABR)을 기록하는 방법을 보여줍니다. 신경 반응을 평가하기 위해 전극 배치, 소리 자극 적용 및 뇌간의 신호 처리 분석 단계를 간략하게 설명합니다.

새끼 쥐의 청각 뇌간 반응 기록

이 동영상은 청각 장애가 있는 쥐에게 인공와우를 이식하고 전기 자극을 가하여 청각 뇌간 반응을 기록하는 절차를 보여줍니다. 이 절차를 통해 전기 청력의 기본 메커니즘을 이해할 수 있으며 인공와우 기술 및 청각 신경 과학의 발전에 기여할 수 있습니다.

귀가 먹먹한 쥐에서 전기적으로 유발된 청각 뇌간 반응 기록

이 비디오는 내이 감각 뉴런 세포체의 이온 전류를 측정하기 위한 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 이 백서에서는 암포테리신 B가 함유된 내부 용액으로 채워진 광택 있는 패치 클램프 피펫의 준비 및 사용에 대해 자세히 설명하며, 이 피펫은 멤브레인을 천공하여 세포 내 상태를 보존하면서 이온 이동을 허용합니다. 전압 펄스는 이온 채널 활동을 트리거하고 기록하기 위해 적용되어 이온 채널 활동과 그 특성에 대한 통찰력을 제공합니다.

내이 감각 뉴런 세포체의 천공된 패치 클램프 기록

이 비디오는 패치 클램프 기술을 사용하여 유변기저와 막 전위를 측정하고 증분 전류 주입에 대한 뉴런의 반응을 분석하여 등쪽 신경절의 감각 뉴런 흥분성을 검사하는 방법을 보여줍니다.

온전한 쥐 등쪽 뿌리 신경절에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록

이 원고는 패치 클램프 기록을 위해 온전한 등쪽 뿌리 신경절을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 제제는 뉴런과 위성 신경교세포의 미세환경을 유지하여 해리된 DRG 뉴런에서 볼 수 있는 표현형 및 기능적 변화를 방지합니다.

성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

우리는 달팽이 관에 트랜스 귀 경로 통해 약물의 지역화 된 관리 기법을 제시. Cisplatin 같은 화학요법 약물의 항 암 효능이이 경로 통해 약물 전달 방해 하지 것 이다.

Ototoxicity의 치료에 대 한 트랜스-귀 약물 전달

뇌간 은 임상 신경 생리학에서 중요한 도구입니다 반응 청력 측정을 불러 일으켰다. 요즘, 뇌간 은 약리학 및 유전 동물 모델 모두를 포함하는 기초 과학 및 전임상 연구에서도 반응 청력 측정을 불러 일으켰다. 여기에서 우리는 청각 뇌간 반응이 마우스에서 성공적으로 기록되고 분석될 수 있는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다.

마우스에서 뇌간 에서 데이터 수집 및 분석 음성 응답 청력 측정

여기에 제시된 방법은 내이의 전정 신경절 및 나선형 신경절 뉴런에서 해부, 해리, 배양 및 패치 클램프 기록에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

배우세요 출생 후 쥐의 외부 머리 세포에서 전체 셀 패치 클램프 기록을 이용한 청각 뇌간 응답 측정 방법입니다. 이 기술은 개별 머리 세포의 기능 평가와 청각 발생 시점의 생물학적 변화 연구에 활용됩니다.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

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