고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

이 접근법의 전반적인 목표는 인슐린 자극 조건에서 췌장 베타 세포의 호흡 기능을 직접 평가하는 것입니다. 이것은 또한 베타 세포 호흡 기능에 대한 다양한 화합물의 효과를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 특정 화합물이 호흡의 변화를 통해 췌장 베타 세포 기능에 영향을 미치는지 여부와 같은 췌장 베타 세포 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 기저 및 인슐린 자극 조건에서 췌장 베타 세포의 호흡 기능을 직접 평가하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 세포 준비 및 호흡 측정에 필요한 정밀도로 인해 세포 준비 및 기계 사용 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저 INS-1 유래 832/13 베타 세포를 RPMI 1640을 보충하여 배양합니다.

2ml의 0.25%트립신을 첨가하여 T75 플라스크에서 세포를 제거하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 8ml의 완전한 RPMI 1640 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 100마이크로리터의 세포 부피를 900마이크로리터의 PBS에 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

그런 다음 10cm 접시에 100만 개당 100만 개의 세포 밀도로 세포를 플레이트합니다. 호흡 실험을 시작하기 전에 섭씨 37도 및 5%CO2의 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 832/13 세포를 섭씨 37도 및 5%CO2의 가습 배양기에서 플레이팅 및 배양한 후 24시간 후에 배지를 교체합니다.

그런 다음 세포를 비히클 제어 또는 코코아 유래인 에피카테킨 단량체로 처리하여 최종 농도를 100나노몰로 만듭니다. 이후 섭씨 37도 및 5%CO2의 가습 인큐베이터에서 추가로 24시간 동안 배양 처리를 추가합니다. 그런 다음 1x 저포도당 분비 분석 완충액(SAB)으로 세포를 5분 동안 세척합니다.

완충액을 흡인하고 1x 저포도당 SAB에서 세포를 3시간 동안 배양하고 매시간 완충액을 교체합니다. 배양 후 1ml의 0.25%트립신으로 접시에서 세포를 제거합니다. 차량 제어 처리된 접시의 트립신에 있는 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 4ml의 SAB와 결합합니다.

마찬가지로, 관심 화합물로 처리된 접시를 완충액과 함께 결합하십시오. 100마이크로리터의 세포 부피를 900마이크로리터의 PBS에 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 100마이크로리터의 세포 부피를 900마이크로리터의 PBS에 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

데이터는 밀리리터당 100만 개의 세포 농도가 가장 효과적임을 보여줍니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 고해상도 호흡계를 준비한 후 각 산소 그래프 챔버에 2.4ml의 1x 저혈당 SAB 버퍼를 추가합니다. 챔버 내의 마그네틱 교반 막대를 사용하여 750rpm 및 섭씨 37도에서 2.0초의 데이터 기록 간격으로 완충액을 지속적으로 교반합니다.

이렇게 하려면 F7 버튼을 선택하고 시스템이라고 표시된 탭을 엽니다. 플런저를 끝까지 밀어 넣은 다음 렌치 폭기 설정으로 집어넣습니다. 안정적인 산소 플럭스를 얻을 때까지 기계를 최소 1시간 동안 평형을 유지하십시오.

그런 다음 실험 기간 동안 기계를 섭씨 37도로 설정합니다. F7 버튼을 누르고 Oxygen O2라고 표시된 탭을 열어 편광 전압을 2의 이득으로 800밀리볼트로 설정합니다. 산소 농도의 변화가 안정될 때까지 최소 30분 동안 SAB 완충액의 산소 농도를 평형화합니다.

그런 다음 Shift 키를 누르고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭한 다음 선택한 영역을 가로질러 마우스를 드래그하여 산소 농도 변화의 배경 측정을 설정하기 위해 산소 농도 변화가 안정적인 영역을 선택합니다. 선택한 영역과 연결된 문자를 클릭하고 두 챔버 각각에 해당하는 각 트레이스에 대해 R1으로 변경합니다. 화면의 왼쪽 하단과 오른쪽 모서리에 있는 O2 보정 상자를 두 번 클릭합니다.

R1로 공기 보정에 대한 Select Mark(마크 선택) 버튼을 클릭한 다음 두 챔버에 대해 calibrate and copy to clipboard(보정을 선택하고 클립보드에 복사)를 선택합니다. 다음으로, 각 챔버에 2.4ml의 샘플을 로드하고, 한 챔버에는 대조 차량 처리 셀이 있고 다른 챔버에는 1x 저포도당 SAB에 복합 처리된 셀이 있는 챔버를 로드합니다. 플런저를 끝까지 밀어 넣고 잔류 부피를 흡인합니다.

모든 후속 단계에 대해 750rpm 및 섭씨 37도에서 실험 내내 세포를 계속 저어줍니다. F4를 클릭하고 샘플이 로드될 때 마크를 셀로 레이블을 지정하여 마크를 만듭니다. 30분 동안 샘플을 측정합니다.

신호 안정화 후 저포도당 조건에 해당하는 산소 농도 변화 영역을 선택합니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 티타늄 로딩 포트를 통해 각 챔버에 12.5마이크로리터의 45% 멸균 포도당 용액을 추가합니다. 트리트먼트가 추가될 때 glucose라고 표시된 표시를 만드십시오.

안정적인 산소 플럭스가 달성될 때까지 신호를 안정화하고 세포 호흡을 기록하도록 합니다. 이 시점에서 산소 농도 변화 영역을 선택하여 자극 조건에 해당하는 16.7 밀리몰 포도당 판독값을 나타냅니다. 신호 안정화에 도달한 후 로딩 포트를 통해 각 챔버에 1마이크로리터의 5밀리몰 올리고마이신 A를 추가합니다.

트리트먼트가 추가될 때 OligoA라고 표시된 표시를 만듭니다. 안정적인 산소 플럭스가 달성될 때까지 신호를 안정화하고 세포 호흡을 기록하도록 합니다. 안정적인 산소 플럭스에 도달하면 곡선의 이 영역을 선택합니다.

올리고마이신 A는 ATP 합성효소를 억제하므로 발생하는 유일한 산소 플럭스는 산화적 인산화가 아닌 전자 누출을 통한 것입니다. 다음으로, 최대 호흡수가 설정될 때까지 1마이크로리터 단위로 1밀리몰 FCCP를 추가합니다. 이것은 최대 비결합 호흡을 나타냅니다.

3-4마이크로리터의 FCCP는 INS-1 유래 832/13 베타 세포의 최대 비결합 호흡을 유도하기에 충분합니다. 트리트먼트가 추가될 때 FCCP라고 표시된 표시를 만드십시오. 안정적인 산소 플럭스가 달성될 때까지 신호를 안정화하고 세포 호흡을 기록하도록 합니다.

그런 다음 곡선의 이 영역을 선택합니다. FCCP는 분리형 호흡을 측정할 수 있는 분리제입니다. 신호 안정화에 도달한 후 로딩 포트를 통해 각 챔버에 1마이크로리터의 5밀리몰 Antimycin A를 추가합니다.

트리트먼트가 추가될 때 AntiA라고 표시된 마크를 만들고 곡선 선택 절차를 반복합니다. 호흡계 분석 프로그램의 F3 버튼을 눌러 분석에 사용된 밀리리터당 세포 수를 입력합니다. 단위를 밀리리터당 셀로 변경하고 세포 농도를 입력한 다음 매체를 SAB로 변경합니다.

데이터를 정규화하려면 배경 판독값을 선택하고 산소 보정 양식에 입력하여 입력합니다. 2.5 밀리몰 포도당, 16.7 밀리몰 포도당, 올리고마이신 A, FCCP 및 안티마이신 A에서 판독값을 선택합니다.호흡계 분석 프로그램 내에서 단백질 농도를 입력하고 호흡 측정 중 각 치료에 대한 적절한 평균값을 선택합니다. 그런 다음 F2 키를 클릭하고 클립보드에 복사 기능을 클릭합니다.

이렇게 하면 다른 분석 프로그램에서 사용할 수 있도록 데이터를 내보냅니다. 계산에 O2 기울기 음수 값을 사용합니다. INS-1 유래 832/13 베타 세포의 온전한 세포 호흡에 미치는 영향을 결정하기 위해 차량 처리 대조군 및 천연 화합물 처리 세포를 3-5회 독립적으로 실행하기 위한 데이터를 컴파일합니다.

온전한 INS-1 유래 832/13 베타 세포는 포도당에 의한 산소 이용의 증가를 보여줍니다. 적절한 수의 셀을 사용하는 것이 중요합니다. 이 실험에서 수집된 결과는 밀리리터당 100만 개의 세포가 최적의 양임을 보여줍니다.

커큐민으로 처리된 INS-1 유래 832/13 베타 세포는 전반적인 호흡에 변화가 없습니다. 반대로, 단량체 코코아 에피카테킨으로 처리된 INS-1 유래 832/13 베타 세포는 2.5 밀리몰 포도당과 16.7 밀리몰 포도당에서 호흡을 증가시켰습니다. 증가된 호흡은 기저부, 비인산화 호흡 상태인 누출 상태와 최대 호흡인 전자 수송 시스템 호흡 또는 ETS 상태에서도 관찰됩니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인슐린 자극 조건에서 췌장 베타 세포의 호흡 기능을 직접 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 포도당 SAB 완충액이 낮은 세포를 전처리하고 분석을 위한 정확한 세포 수를 얻는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 효과적인 측정을 위해 적절한 양의 세포를 얻는 데 어려움을 겪을 것입니다. 셀이 너무 많으면 신호를 평가하기 어렵고 셀이 너무 적으면 신호가 일관되게 측정할 수 있을 만큼 충분히 높지 않습니다. 이 기술의 의미는 당뇨병 및 췌장 베타 세포 기능의 변화에 의해 영향을 받는 모든 상태의 치료 또는 진단으로 확장되는데, 이는 미토콘드리아 호흡이 인슐린 분비가 작동하는 방식의 중요한 구성 요소이기 때문입니다.

이 절차에 따라 포도당 자극 인슐린 분비와 같은 다른 방법을 수행하여 인슐린 분비에 대한 이러한 화합물의 영향은 무엇입니까? 이 방법은 베타 세포 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 근육, 간, 지방 및 기타 미토콘드리아 호흡 분석과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.