Name: 고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 배우세요 고해상도 레스피로메트리를 이용해 INS-1 유래 832/13 베타 세포의 미토콘드리아 호흡 기능을 측정하는 방법을. 인슐린 자극 조건에서 천연 화합물이 베타 세포 대사에 미치는 영향을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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저자 조 및 과학적인 토론을 위한 Tessem 및 핸 콕 연구소의 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다. 저자 코코아 파생된 epicatechin 단위체 분수를 제공 하는 앤드류 Neilson, 박사 (버지니아 공대) 감사 합니다. 이 연구는 JST에 당뇨병 액션 연구 및 교육 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 세포 배양
<ol><li>문화 기능-1 파생 832/13 베타 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린-스, 10 mM HEPES, 2mm 글루타민, 1 mM 나트륨 Pyruvate, 0.05 m m 2-mercaptoethanol9,10,11 보충 RPMI 1640 ,,1213.</li>
	<li>완전 한 RPMI 1640 미디어의 8 mL을 추가 하 여 10 분 중화 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하는 0.25 %trypsin 2 개 mL를 사용 하 여 T75 플라스 크에서 832/13 셀을 제거 합니다.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 1.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.</li>
	<li>2 x 106 6에서 셀/mL의 조밀도에 접시 832/13 셀 잘 요리.</li>
	<li>호흡 실험을 시작 하기 전에 셀에서 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에서 48 h에 대 한 문화.</li>
</ol>2입니다. 고해상도 Respirometry에 대 한 셀의 준비
<ol><li>
코코아 파생된 epicatechin 단위체와 832/13 세포 치료.
	<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금 후 24 h에 대 한 832/13 셀 문화.</li>
		<li>도금, 후 미디어 24 h 변경 하 고 차량 통제 (3 정) 또는 100 nM 코코아 단위체 (3 정), 37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에는 추가적인 24 h (총 48 h)에 대 한 문화 뒤 832/13 세포 치료.</li>
		<li>낮은 포도 당 분 비 분석 결과 버퍼 (SAB) 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 x 1에 832/13 세포를 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.<ol>
<li>게 10 x SAB 33.32 g의 NaCl, KCl, KH2포4, MgSO4 의 0.7 g의 0.82 g 1.73 g H2O 500 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.</li>
			<li>만들기 1 낮은 포도 SAB SAB, 100 µ L의 45% 포도 당, 1 M HEPES, 1 mL의 2 mL x 10의 10 mL와 함께 x 0.25 M CaCl2, 35 %BSA 솔루션, NaHCO3 의 0.21 g의 0.57 mL의 H2O 100 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Curcumin와 832/13 세포 치료.
	<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금 후 48 h에 대 한 832/13 셀 문화.</li>
		<li>832/13 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 있는 셀을 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.</li>
		<li>낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 외피의 2.5 h, 후 버퍼를 발음 하 고 낮은 포도 당 SAB 차량 제어 또는 30 분 동안 40 µ M curcumin x 1에 있는 셀을 품 어. 부 화, 다음 버퍼 발음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수확 하는 고해상도 respirometry에 대 한 트립 신 셀
	<ol>
<li>낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 부 화 후 잘 당 0.25 %trypsin 250 µ L로 접시에서 셀을 제거 합니다.</li>
		<li>차량 제어 또는 15 mL 원뿔 튜브에 SAB의 4 mL와의 복합 치료 3 우물에서 트립 신에 셀 결합.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 2.3.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.</li>
		<li>낮은 포도 SAB 각 챔버에 대 한 적절 한 농도에서 3 mL을 x 1에 있는 셀의 적절 한 수를 희석. 데이터 1 x 106 셀/mL의 농도 가장 효과적인 방법을 보여 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
고해상도 respirometry에 대 한 기계적 분리 된 세포를 수확
	<ol>
<li>1 x에서 3 h 부 화 후 낮은 포도 SAB, 1 x 각 낮은 포도 당 SAB 잘하고 부드럽게 1000 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 기계적 분리와 접시에서 셀 타격의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>차량 통제로 또는 호흡에 대 한 15 mL 원뿔 튜브 3 mL SAB의 총에 대 한 관심의 복합 치료 3 우물에서 세포를 결합 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 고해상도 Respirometry
<ol><li>고해상도 respirometer의 준비입니다.
	<ol>
<li>켜고 고해상도 respirometer respirometer 분석 프로그램을 실행 하 여 바탕 화면에 연결.</li>
		<li>두 약 실 전부에서 70% 에탄올 발음 이 약 실은 45 분의 최소 70% 에탄올에 담근 다.</li>
		<li>각 단계 후 발음 70% 에탄올으로 두 번 챔버 세척.</li>
		<li>DdH2O, 각 단계 후 발음과 세 번 챔버 세척.</li>
		<li>DdH2오 챔버 plungers 린스 이 plungers와 티타늄 포트에서 잔여 에탄올을 정리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Polarographic 산소 센서의 구경 측정입니다.
	<ol>
<li>지속적으로 사용 하 여 자기 볶음 바 데이터 기록 간격 750 rpm 고 37 ° C에서 약 실에 있는 2.0에서 버퍼를 교 반 각 oxygraph 챔버에 낮은 포도 당 SAB 버퍼 x 1의 2.4 mL을 추가 F7 버튼을 탭 열기 s 분류 "시스템". Plungers를 밀어 모든 방법에서 후 렌치 폭 설정에 철회 하 고. 안정적인 산소 유량을 얻을 때까지 1 시간 최소 equilibrate 기계를 하자.</li>
		<li>37 ° C에 실험의 기간에 대 한 기계를 설정 합니다. 800 분극 전압 설정 F7 버튼을 "산소, O2"탭을 열고 2의 이득을 mV. 산소 농도 변화는 안정 되어 있는 하는 동안 적어도 30 분 동안 SAB 버퍼의 산소 농도 equilibrate (2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>산소 농도 안정화에 따라 산소 농도의 변화는 안정 산소 농도 변화의 배경 측정을 설정 하는 영역을 선택 합니다.<ol>
<li>Shift 키를 누른 다, 왼쪽 마우스를 클릭 하 고 선택된 영역에서 마우스를 드래그 하 여 영역을 선택 합니다. 두 챔버의 각각에 해당 하는 각 추적에 대 한 선택한 지역 및 변경 "r1"와 관련 된 문자를 클릭 하십시오.</li>
			<li>왼쪽 하단에 있는 "O2 교정" 상자를 두 번 클릭 하 고 스크린의 모서리를 마우스 오른쪽, r 1으로 "공기 교정"에 대 한 "선택 표시" 버튼을 클릭 고 두 약 실 전부에 대 한 "보정 하 고 클립보드에 복사"를 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>2.1.5 또는 2.2.5 832/13 베타 세포의 호흡의 평가 단계에서 준비.
	<ol>
<li>1 x 낮은 포도 당 SAB.에 각 약 실 (한 실 제어 차량 취급 셀, 복합 치료 세포 한 챔버)에 샘플의 2.4 mL 로드 기계적 분리 방식 (-20 ° C에서 측정 후 동결)를 사용 하 여 경우 BCA (Bicinchoninic 산) 분석 결과 의해 단백질 정량에 대 한 셀 샘플의 0.5 mL를 유지 합니다.<ol>
<li>모든 방법으로 플런저를 밀어 하 고 잔류 볼륨 발음. 750 rpm 및 모든 후속 단계에 대 한 37 ° C에서 실험을 통해 지속적으로 세포를 저 어. F 4를 클릭 하 여 샘플 로드 되 면 "세포"로 라벨 표시를 확인 합니다.</li>
			<li>30 분에 대 한 샘플을 측정 합니다. 신호 안정화 후 3.2.3에 설명 된 대로 낮은 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 해당 하는 산소 농도 변화의 영역을 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 주사기를 사용 하 여 포트 로드 티타늄 통해 각 챔버에 45% 살 균 포도 당 솔루션 (16.7 m m 최종 농도)의 12.5 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 치료 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "포도". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 산소 농도 변화는이 영역을 선택 합니다. 이것은 16.7 m m 포도 당 독서 하 고 물질로 조건7해당 합니다.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 5mm oligomycin (2.5 최종 농도) 각 챔버로 로딩 포트를 통해의 1 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "OligoA". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. Oligomycin A 억제 ATP synthase 이며 따라서 발생 하는 유일한 산소 유량 전자와 아닌 산화 인 산화7의 누설을 통해.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 최대 호흡 율 설정 될 때까지 1 µ L 단위로 1mm FCCP 추가 합니다. 이 최대한 uncoupled 호흡을 나타냅니다. 3-4 µ L 사이 FCCP 충분 한 (1.5-2.0 µ M 최종 농도) 기능-1 832/13 셀의 최대 uncoupled 호흡을 유도 하는 것 이다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "FCCP" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. FCCP 연결을 푸는 에이전트입니다. 이 uncoupled 호흡7을 측정할 수 있습니다.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 로드 포트를 통해 각 실에 1 µ L 5mm Antimycin A (2.5 최종 농도)를 추가 합니다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "AntiA" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. 참고: Antimycin A 시 토 크롬 C 환 원 효소, ubiquinone 산화를 억제 한다 모든 호흡을 차단. 호흡7을 완전히 막을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 베타 세포 단백질 농도 호흡 정규화에 대 한 측정.
	<ol>
<li>샘플 측정 단백질 샘플13BCA 메서드 사용 하 여 로드 시 유지의 0.5 mL를 사용 하 여.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 희석 하지 않고 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>trypsinized 셀에서 832/13 베타 세포 호흡 계산.<ol>
<li>Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 분석 결과에 mL 사용 당 셀의 수를 입력 합니다. 단위 셀/mL를 변경 세포 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경</li>
		<li>선택 하 고 O2 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.</li>
		<li>2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.</li>
		<li>Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O2 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.</li>
		<li>자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 베타 세포 호흡 계산에서 기계적으로 해리 셀.<ol>
<li>Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 BCA 분석 결과에서 단백질 계산을 입력 합니다. 밀리 그램 단위 변경, BCA 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경</li>
		<li>선택 하 고 O2 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.</li>
		<li>2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.</li>
		<li>Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O2 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.</li>
		<li>자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 목적은 그대로 췌 장 베타 세포에서 호흡 속도 측정에 고해상도 respirometry를 사용 하는 것입니다. 이 메서드는 증가 된 포도 당 수준으로 베타 세포 반응의 측정을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자연스럽 게 발생 단위체 epicatechin 또는 curcumin4,5에서 같이 프로토콜 또한 다양 한 화합물과 전처리에 대 한 수 있습니다. 다른 다양 한 화합물과 치료는이 프로토콜을 전처리 (다음과 같이)를 사용 하거나 기본 프로토콜에 대 한 최소한의 수정으로 호흡기 챔버 내에서 치료에 사용 될 수 있습니다.
다양 한 방법으로이 메서드는 수정할 수 있다. 다른 베타 세포 라인을 사용할 수; 그러나, 세포 수와 SAB 세척 시간 실험적으로 결정...

췌 장 베타 세포의 주된 목적은 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 시스템 normoglycemia를 유지 하는 것입니다. 베타 세포 느낄 회람 포도 당 크게 낮은 선호도, 고용량 포도 당 운송업 자 GLUT2 때문에 생리 적 변화 (포도 당 운송업 자 2, Km 16.7 m m)1. 순환 포도 당 수준을 증가,이 높은-용량 낮은 선호도 전송 셀 내에 베타 세포내 포도 당에 있는 비례 증가 촉진 합니다. 포도 당 분해, TCA 사이클 (tricarboxylic 산 주기) 및 높은 세포질 ATP (아데노신 3 인산 염) 수준에서 발생 하는 미토 콘 드리 아 호흡 대사입니다. 높은 ATP 농도 ATP 민감한 K+ 채널, 막 도발은 결과 차단 합니다. 막 도발은 전압 Ca2 + 채널 개방 원인과 기의 후속 릴리스 바인딩된 인슐린과 립2. 베타 세포 기능 장애 제 2 형 당뇨병 (T2D), 각 인 이며, 감소 하 고 가난 하 게 통제 하는 인슐린 분 비 및 궁극적으로 베타 세포 죽음3. 유지 하거나 베타 세포 기능을 개선 하는 메커니즘 T2D에 대 한 치료로 사용 될 수 있습니다.
학문은 자연스럽 게 발생의 유익한 효과 설명 했다 췌 장 beta 세포4공장 기반 화합물. 이 화합물은 증가 베타 세포 증식, 생존, 또는 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 그들의 효과 할 수 있습니다. 예를 들어, 최근 연구는 단위체 epicatechin 미토 콘 드리 아 호흡 증가 통해 포도 당 자극 인슐린 분 비를 강화 하 고5레벨 셀룰러 ATP를 증가 증명 하고있다. 따라서, 이러한 화합물 기능 베타 셀을 어떻게 증가할 수 있는지 이해 질량 잠재적인 치료로 이러한 화합물을 활용 하는 것이 중요 하다.
세포 호흡은 여러 가지 도구를 통해 측정할 수 있습니다. 고해상도 respirometer의 사용 permeabilized 또는 그대로 셀 인구6화학 변조기의 적정에 대 한 수 있습니다. 이 도구에 따라서 다양 한 정보를 제공 하는 다양 한 농도, 다양 한 화합물의 추가 허용 합니다.
포도 당 대사 및 베타 세포 기능 사이 친밀 한 연결을 감안할 때, 세포 호흡의 측정은 중요 합니다. 세포 호흡의 측정을 수행할 수 있습니다 갖는 각 고유한 장점과 단점7,8permeabilized 또는 그대로 베타 세포를 사용 하 여. 베타 세포의 permeabilization 전자 전송 체인의 다양 한 측면을 측정 한 수, 하는 동안 그것은 beta 세포 포도 당 통풍 관, 신진 대사 호흡을 유도 하는 메커니즘에 관계 없이 이렇게 한다. 따라서, unpermeabilized 베타 세포 호흡의 사용 다양 한 포도 당 수준, 판독으로 산소 소비를 사용 하 여 베타 세포 응답을 결정 하는 매우 유용한 기술입니다.
이 기법의 목적은 그대로 기능-1에서 산소 소비량을 측정 하 832/13 베타 세포 파생입니다. 이 기술은 수 있습니다 unstimulatory 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 대 한 베타 세포의 응답 결정 물질로 포도 당 조건 (16.7 m m 포도 당) 뿐만 아니라. Unpermeabilized 셀 개별적으로 복잡 한 테스트를 허용 하지 않는 하는 동안 I, II 또는 III의 전자 수송 체인, 기술을 다루는 복잡 한 IV 억제 (Oligomycin A) 상태로 호흡 (FCCP 카보닐기 시안-측정 허용 않는다 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), 호흡 (Antimycin A) 완전히 저해. 이 연구에서는 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 뿐 아니라 그대로 unpermeabilized 췌 장 베타 세포, 호흡 측정의 효능을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>O2k 코어: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>고해상도 호흡량 측정을 위한 기기</td></tr><tr><td>DatLab 6 프로그램</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>고해상도 호흡량 측정</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 세포주</td> 분석을 위한 컴퓨터 프로그램 <td>Duke University Medical Center</td><td>NONE</td><td>베타 세포주, Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumin</td> <td>박사의 선물Sigma</td><td>C7727</td><td>베타 세포 전처리</td></tr><tr><td>코코아 에피카테킨 단량체</td><td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td><td>NONE</td><td>베타 세포 전처리, Andrew Neilson 박사의 선물</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 베타 세포 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 베타 세포 배지 구성</td></tr> 요소 <tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4458</td><td>832/13 베타 세포 배지 구성</td></tr><tr><td>요소 HEPES</td><td>시그마</td><td>H3662</td><td>832/13 베타 세포 배지 구성 요소/ 1x SAB 버퍼</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>케이슨</td><td>GLL01</td><td>832/13 베타 세포 배지 구성</td></tr><tr><td>요소 피루브산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S8636</td><td>832/13 베타 세포 배지 구성</td></tr> <tr>요소<td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 베타 세포 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>10x SAB 버퍼의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>10x SAB 버퍼의 구성 요소</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>10x SAB 버퍼 구성</td></tr> 요소 <tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>10x SAB 완충액</td></tr><tr><td>D-(+)-포도당 용액</td>의 구성 <td>요소 Sigma</td><td>G8769</td><td>1x SAB 완충액의 구성 요소, 호흡 분석용 화학 물질</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>1x SAB 완충액의 구성</td></tr><tr><td>요소 35% BSA 용액</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>1x SAB 완충액의 성분</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>1x SAB 버퍼</td></tr><tr><td>구성 요소 200 프루프 에탄올</td><td>시그마</td><td>459844</td><td>세척 산소 그래프 O2k 챔버</td></tr><tr><td>올리고마이신 A</td><td>시그마</td><td>O4876</td><td>호흡 분석 용 화학 물질</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>시그마</td><td>C2920</td><td>호흡 분석 용 화학 물질</td></tr><tr><td>Anitmycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>호흡 분석 용 화학 물질</td></tr><tr><td>BCA 단백질 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>단백질 농도 측정용</td></tr></tbody></table>

고해상도 respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

고해상도 respirometry 고립 된 미토 콘 드리 아, 세포와 조직에의 산소 소비량의 측정에 대 한 수 있습니다. 베타 세포는 높은 포도 당 농도에 대 한 응답에서 인슐린 분 비를 통해 통제 혈액 포도 당 수준에 의해 신체에 중요 한 역할을 한다. 인슐린 분 비는 포도 당 대사 및 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 제어 됩니다. 따라서, 본래 베타 세포 호흡 측정 당뇨병을 위한 치료로 베타 세포 기능을 향상 시킬 수 있을 필수적 이다. 그대로 832/13 기능-1을 사용 하 여 우리 세포 호흡에 포도 당 농도 증가의 효과 측정할 수 있는 베타 세포 파생. 이 프로토콜의 효과 결정 하는 하나를 수 있도록 다양 한 화합물의 유무에서 베타 세포 호흡 측정 수 있습니다 화합물 그대로 세포 호흡에 주어진. 여기 우리가 (2.5 m m) 낮은 또는 높은 혈당 (16.7 m m) 존재에서 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 보여줍니다. 이 기술은 다른 포도 당 농도 면 전에 서 그대로 베타 세포 호흡에 다양 한 화합물의 효과 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

기능 1 832/13 베타 세포 준비 프로토콜에 설명 된 대로 수확을 다양 한 화학 개입 (그림 1A)에 따라 산소 소비에 변조를 시연할 예정 이다. 호흡 증가 16.7 mM 포도 (그림 1B)에 포도 당 농도 증가 때 관찰 됩니다. 호흡은 그대로 셀 Oligomycin a 치료는 줄어 이 호흡은 기저, nonphosphorylating 호흡기 상태로 정의 되는 누설으로 알려져 있다. 최대한 호흡 때 베타 세포 FCCP, ETS 호흡, 또는 전자 전송 시스템 호흡으로 정의 되는 연결을 푸는 에이전트와 함께 처리 됩니다 달성 될 것입니다. 마지막으로, 호흡은 Antimycin a를 이용한 (잔여 산소 소비) 비 호흡기 세포 산소 소비를 참조로 대우 될 때 0으로 떨어질 것 이다.
핸드폰 번호에 차이 크게이 기술에서 얻은 데이터의 품질을 변경 됩니다. 포도 당 유도 호흡은 0....

이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

이 접근법의 전반적인 목표는 인슐린 자극 조건에서 췌장 베타 세포의 호흡 기능을 직접 평가하는 것입니다. 이것은 또한 베타 세포 호흡 기능에 대한 다양한 화합물의 효과를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 특정 화합물이 호흡의 변화를 통해 췌장 베타 세포 기능에 영향을 미치는지 여부와 같은 췌장 베타 세포 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 기저 및 인슐린 자극 조건에서 췌장 베타 세포의 호흡 기능을 직접 평가하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 세포 준비 및 호흡 측정에 필요한 정밀도로 인해 세포 준비 및 기계 사용 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저 INS-1 유래 832/13 베타 세포를 RPMI 1640을 보충하여 배양합니다.2ml의 0.25%트립신을 첨가하여 T75 플라스크에서 세포를 제거하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 8ml의 완전한 RPMI 1640 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 100마이크로리터의 세포 부피를 900마이크로리터의 PBS에 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.그런 다음 10cm 접시에 100만 개당 100만 개의 세포 밀도로 세포를 플레이트합니다. 호흡 실험을 시작하기 전에 섭씨 37도 및 5%CO2의 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 832/13 세포를 섭씨 37도 및 5%CO2의 가습 배양기에서 플레이팅 및 배양한 후 24시간 후에 배지를 교체합니다.그런 다음 세포를 비히클 제어 또는 코코아 유래인 에피카테킨 단량체로 처리하여 최종 농도를 100나노몰로 만듭니다. 이후 섭씨 37도 및 5%CO2의 가습 인큐베이터에서 추가로 24시간 동안 배양 처리를 추가합니다. 그런 다음 1x 저포도당 분비 분석 완충액(SAB)으로 세포를 5분 동안 세척합니다.완충액을 흡인하고 1x 저포도당 SAB에서 세포를 3시간 동안 배양하고 매시간 완충액을 교체합니다. 배양 후 1ml의 0.25%트립신으로 접시에서 세포를 제거합니다. 차량 제어 처리된 접시의 트립신에 있는 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 4ml의 SAB와 결합합니다.마찬가지로, 관심 화합물로 처리된 접시를 완충액과 함께 결합하십시오. 100마이크로리터의 세포 부피를 900마이크로리터의 PBS에 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 100마이크로리터의 세포 부피를 900마이크로리터의 PBS에 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.데이터는 밀리리터당 100만 개의 세포 농도가 가장 효과적임을 보여줍니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 고해상도 호흡계를 준비한 후 각 산소 그래프 챔버에 2.4ml의 1x 저혈당 SAB 버퍼를 추가합니다. 챔버 내의 마그네틱 교반 막대를 사용하여 750rpm 및 섭씨 37도에서 2.0초의 데이터 기록 간격으로 완충액을 지속적으로 교반합니다.이렇게 하려면 F7 버튼을 선택하고 시스템이라고 표시된 탭을 엽니다. 플런저를 끝까지 밀어 넣은 다음 렌치 폭기 설정으로 집어넣습니다. 안정적인 산소 플럭스를 얻을 때까지 기계를 최소 1시간 동안 평형을 유지하십시오.그런 다음 실험 기간 동안 기계를 섭씨 37도로 설정합니다. F7 버튼을 누르고 Oxygen O2라고 표시된 탭을 열어 편광 전압을 2의 이득으로 800밀리볼트로 설정합니다. 산소 농도의 변화가 안정될 때까지 최소 30분 동안 SAB 완충액의 산소 농도를 평형화합니다.그런 다음 Shift 키를 누르고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭한 다음 선택한 영역을 가로질러 마우스를 드래그하여 산소 농도 변화의 배경 측정을 설정하기 위해 산소 농도 변화가 안정적인 영역을 선택합니다. 선택한 영역과 연결된 문자를 클릭하고 두 챔버 각각에 해당하는 각 트레이스에 대해 R1으로 변경합니다. 화면의 왼쪽 하단과 오른쪽 모서리에 있는 O2 보정 상자를 두 번 클릭합니다.R1로 공기 보정에 대한 Select Mark(마크 선택) 버튼을 클릭한 다음 두 챔버에 대해 calibrate and copy to clipboard(보정을 선택하고 클립보드에 복사)를 선택합니다. 다음으로, 각 챔버에 2.4ml의 샘플을 로드하고, 한 챔버에는 대조 차량 처리 셀이 있고 다른 챔버에는 1x 저포도당 SAB에 복합 처리된 셀이 있는 챔버를 로드합니다. 플런저를 끝까지 밀어 넣고 잔류 부피를 흡인합니다.모든 후속 단계에 대해 750rpm 및 섭씨 37도에서 실험 내내 세포를 계속 저어줍니다. F4를 클릭하고 샘플이 로드될 때 마크를 셀로 레이블을 지정하여 마크를 만듭니다. 30분 동안 샘플을 측정합니다.신호 안정화 후 저포도당 조건에 해당하는 산소 농도 변화 영역을 선택합니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 티타늄 로딩 포트를 통해 각 챔버에 12.5마이크로리터의 45% 멸균 포도당 용액을 추가합니다. 트리트먼트가 추가될 때 glucose라고 표시된 표시를 만드십시오.안정적인 산소 플럭스가 달성될 때까지 신호를 안정화하고 세포 호흡을 기록하도록 합니다. 이 시점에서 산소 농도 변화 영역을 선택하여 자극 조건에 해당하는 16.7 밀리몰 포도당 판독값을 나타냅니다. 신호 안정화에 도달한 후 로딩 포트를 통해 각 챔버에 1마이크로리터의 5밀리몰 올리고마이신 A를 추가합니다.트리트먼트가 추가될 때 OligoA라고 표시된 표시를 만듭니다. 안정적인 산소 플럭스가 달성될 때까지 신호를 안정화하고 세포 호흡을 기록하도록 합니다. 안정적인 산소 플럭스에 도달하면 곡선의 이 영역을 선택합니다.올리고마이신 A는 ATP 합성효소를 억제하므로 발생하는 유일한 산소 플럭스는 산화적 인산화가 아닌 전자 누출을 통한 것입니다. 다음으로, 최대 호흡수가 설정될 때까지 1마이크로리터 단위로 1밀리몰 FCCP를 추가합니다. 이것은 최대 비결합 호흡을 나타냅니다.3-4마이크로리터의 FCCP는 INS-1 유래 832/13 베타 세포의 최대 비결합 호흡을 유도하기에 충분합니다. 트리트먼트가 추가될 때 FCCP라고 표시된 표시를 만드십시오. 안정적인 산소 플럭스가 달성될 때까지 신호를 안정화하고 세포 호흡을 기록하도록 합니다.그런 다음 곡선의 이 영역을 선택합니다. FCCP는 분리형 호흡을 측정할 수 있는 분리제입니다. 신호 안정화에 도달한 후 로딩 포트를 통해 각 챔버에 1마이크로리터의 5밀리몰 Antimycin A를 추가합니다.트리트먼트가 추가될 때 AntiA라고 표시된 마크를 만들고 곡선 선택 절차를 반복합니다. 호흡계 분석 프로그램의 F3 버튼을 눌러 분석에 사용된 밀리리터당 세포 수를 입력합니다. 단위를 밀리리터당 셀로 변경하고 세포 농도를 입력한 다음 매체를 SAB로 변경합니다.데이터를 정규화하려면 배경 판독값을 선택하고 산소 보정 양식에 입력하여 입력합니다. 2.5 밀리몰 포도당, 16.7 밀리몰 포도당, 올리고마이신 A, FCCP 및 안티마이신 A에서 판독값을 선택합니다.호흡계 분석 프로그램 내에서 단백질 농도를 입력하고 호흡 측정 중 각 치료에 대한 적절한 평균값을 선택합니다. 그런 다음 F2 키를 클릭하고 클립보드에 복사 기능을 클릭합니다.이렇게 하면 다른 분석 프로그램에서 사용할 수 있도록 데이터를 내보냅니다. 계산에 O2 기울기 음수 값을 사용합니다. INS-1 유래 832/13 베타 세포의 온전한 세포 호흡에 미치는 영향을 결정하기 위해 차량 처리 대조군 및 천연 화합물 처리 세포를 3-5회 독립적으로 실행하기 위한 데이터를 컴파일합니다.온전한 INS-1 유래 832/13 베타 세포는 포도당에 의한 산소 이용의 증가를 보여줍니다. 적절한 수의 셀을 사용하는 것이 중요합니다. 이 실험에서 수집된 결과는 밀리리터당 100만 개의 세포가 최적의 양임을 보여줍니다.커큐민으로 처리된 INS-1 유래 832/13 베타 세포는 전반적인 호흡에 변화가 없습니다. 반대로, 단량체 코코아 에피카테킨으로 처리된 INS-1 유래 832/13 베타 세포는 2.5 밀리몰 포도당과 16.7 밀리몰 포도당에서 호흡을 증가시켰습니다. 증가된 호흡은 기저부, 비인산화 호흡 상태인 누출 상태와 최대 호흡인 전자 수송 시스템 호흡 또는 ETS 상태에서도 관찰됩니다.이 비디오를 시청한 후에는 인슐린 자극 조건에서 췌장 베타 세포의 호흡 기능을 직접 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 포도당 SAB 완충액이 낮은 세포를 전처리하고 분석을 위한 정확한 세포 수를 얻는 것을 기억하는 것이 중요합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 효과적인 측정을 위해 적절한 양의 세포를 얻는 데 어려움을 겪을 것입니다. 셀이 너무 많으면 신호를 평가하기 어렵고 셀이 너무 적으면 신호가 일관되게 측정할 수 있을 만큼 충분히 높지 않습니다. 이 기술의 의미는 당뇨병 및 췌장 베타 세포 기능의 변화에 의해 영향을 받는 모든 상태의 치료 또는 진단으로 확장되는데, 이는 미토콘드리아 호흡이 인슐린 분비가 작동하는 방식의 중요한 구성 요소이기 때문입니다.이 절차에 따라 포도당 자극 인슐린 분비와 같은 다른 방법을 수행하여 인슐린 분비에 대한 이러한 화합물의 영향은 무엇입니까? 이 방법은 베타 세포 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 근육, 간, 지방 및 기타 미토콘드리아 호흡 분석과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

광근의 lateralis의 조직 검사, 정제 미토콘드리아의 준비, 호흡계 프로파일 링하는 방법이 설명되어 있습니다. 작은 부피의 근육 사용은 임상 연구 애플리케이션이 기술에 적합하다.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

여기서, 마취된 돼지에서 대퇴사두근 표본을 채취하고 미토콘드리아를 차등 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡수를 고해상도 호흡 측정을 사용하여 결정합니다.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

고분해능 호흡계를 사용하여 산화 인산화를 평가하는 것은 미토콘드리아와 세포 에너지 대사의 기능 분석의 필수적인 부분이되었습니다. 여기에서는 챔버 및 마이크로 플레이트 기반 고해상도 호흡계를 사용하여 세포 에너지 대사를 분석하기위한 프로토콜을 제시하고 각 장치의 주요 이점에 대해 논의합니다.

챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법

형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

고분해능 호흡 측정법에 의한 정자 미토콘드리아 기능 분석은 밀폐 챔버 시스템에서 자유롭게 움직이는 정자의 산소 소비량을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 정자 미토콘드리아 특성 및 무결성에 대한 정보를 제공하는 인간 정자의 호흡을 측정하는 데 적용할 수 있습니다.

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

여기에서는 인간 또는 생쥐 근육의 신선한 투과화된 골격근 섬유에서 미토콘드리아 산화 인산화를 측정하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 호흡을 실시간으로 정량화하고 연료 선호도 및 대사 유연성을 평가하는 동시에 기존 미토콘드리아 네트워크와 멤브레인 무결성을 유지할 수 있습니다.

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정

면역 세포에서 생리학적으로 관련된 기질 농도 하에서 미토콘드리아 생체 에너지학을 연구하는 방법은 제한적입니다. 당사는 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 인간 T 세포, 단핵구 및 말초 단핵 세포의 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 막 전위의 반응 변화를 평가하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 면역 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 동적 변화를 평가하기 위한 고분해능 폐활량 측정법

여기서, 우리는 고분해능 호흡 측정을 위한 0.5mL 챔버가 적절한 기기 O2 배경 보정이 적용되는 경우 2.0mL 챔버와 일치하는 결과를 보여준다는 것을 보여줍니다. 샘플이 덜 필요하므로 가용성이 제한되거나 호흡 능력이 낮은 연구에 유리합니다.

소용량 챔버에서 고해상도 호흡 측정

배우세요 고해상도 레스피로메트리를 이용해 INS-1 유래 832/13 베타 세포의 미토콘드리아 호흡 기능을 측정하는 방법을. 인슐린 자극 조건에서 천연 화합물이 베타 세포 대사에 미치는 영향을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

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