고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도 호흡계를 사용하여 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하는 것입니다. 이 방법은 다음과 같은 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 증후군 및 질병의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 패혈증, 다양한 신경 질환 및 노화 관련 장애. 이 기술의 주요 장점은 더 높은 감도와 온전한 세포 또는 투과성 세포와 같은 소수의 생물학적 샘플을 사용한 결합 억제제 적정 실험에서 기질을 수행할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Sandra Nansoz가 맡을 것입니다. 절차를 시작하기 전에 폴라로그래픽 산소 센서를 공기 보정한 다음 호흡 완충액의 세포를 1밀리리터당 6번째 세포의 1배로 재현탁시키고 산소 그래프의 한 챔버에 있는 호흡 매체를 2.1ml의 세포 현탁액으로 교체합니다. 스토퍼로 챔버를 닫고 챔버의 자기 교반 막대를 분당 700회 회전으로 설정합니다.

그런 다음 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 5-10분 동안 세포 호흡을 기록합니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 티타늄 주입구를 통해 2마이크로리터의 로테논을 옥시그래프 챔버에 주입하고 5-10분 동안 세포 호흡을 기록합니다. 안정적인 산소 플럭스 신호가 달성되면 20마이크로리터의 1몰 숙시네이트를 주입한 다음 10마이크로리터의 0.5몰 ADP를 주입합니다.

그런 다음 2 밀리 몰 디지 토닌 2 마이크로 리터를 2 부피로 주입하고 각 주입 후 2-5 분 동안 세포 호흡을 기록 한 다음 산소 플럭스 신호가 최대 수준에 도달하고 추가 디지토 닌 주입이 호흡수를 증가시키지 않을 때까지 2-4 마이크로 리터의 2 밀리 몰 디지토닌을 단계적으로 주입합니다. 미토콘드리아 외막의 무결성을 평가하기 위해 방금 설명한 대로 옥시그래프 챔버를 준비하고 2마이크로리터의 8밀리몰 디지토닌을 주입하여 세포를 투과화합니다. 5분 후, 20마이크로리터의 1몰 숙시네이트를 주입하고 안정적인 산소 플럭스 신호가 얻어질 때까지 5-10분 동안 세포 호흡을 기록합니다.

그런 다음 10 마이크로 리터의 0.5 몰 ADP를 주입하여 복합 2를 자극하고 산소 소비량 증가를 유도합니다. 안정적인 플럭스 신호가 달성되면 5마이크로리터의 4밀리몰 시토크롬 c를 주입한 다음 1마이크로리터의 리가마이신을 1밀리리터당 4밀리그램으로 주입합니다. 간 간세포 암종 세포의 ADP 자극 호흡을 측정하기 위해, 방금 시연한 바와 같이 오이그래프 챔버를 준비하고, 2마이크로리터의 8밀리몰 디지토닌을 산소 챔버에 주입하여 5분 동안 세포를 투과시킨 다음, 12.5마이크로리터의 0.8몰 청둥오리와 10마이크로리터의 2몰 글루타메이트를 주입합니다.

안정적인 산소 플럭스가 달성되면 산소 소비량을 늘리기 위해 0.5몰 ADP 10마이크로리터를 주입한 다음 0.2 밀리몰 로테논 2 마이크로리터와 1몰 숙시네이트 20 마이크로리터를 주입합니다. 다음으로, 2마이크로리터의 5밀리몰 항마이신을 주입하고 세포 호흡을 기록합니다. 신호가 감소하고 안정화되면 2.5마이크로리터의 0.8밀리몰 에스코트를 주입한 다음 2.5마이크로리터의 0.2밀리몰 TMPD를 즉시 주입하여 산소 플럭스 신호가 증가하고 안정화될 때까지 세포 호흡을 기록합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 1몰 아자이트나트륨을 옥시그래프 챔버에 주입하고 산소 플럭스 신호가 감소하고 안정화될 때까지 세포 흡인을 기록합니다. 온전한 세포 산소 소비량을 측정하려면 방금 설명한 대로 옥시그래프 챔버를 준비하고 1마이크로리터의 알리기미신당 4밀리그램을 주입한 다음 0.2밀리몰 FCCP를 1회 및 3회 주입합니다. 다음으로, 산소 플럭스 신호가 더 이상 증가하지 않고 최대 수준에 도달할 때까지 0.2 - 1 밀리몰 FCCP를 1 - 3 마이크로리터로 주입하여 FCCP를 0.1 - 0.3 마이크로몰 단계로 적정한 다음 감소하기 시작합니다.

그런 다음 2마이크로리터의 0.2밀리몰 로테논과 2마이크로리터의 5밀리몰 안티마이신 A를 주입하고 산소 플럭스 신호가 감소하고 안정화될 때까지 호흡을 기록합니다. 디지토닌이 없으면 세포 호흡이 매우 낮고 미토콘드리아 기질과 ADP가 있는 경우 온전하고 투과되지 않은 세포의 호흡이 자극되지 않습니다. 그러나 디지토닌을 단계적으로 첨가하면 세포 원형질막이 투과화되고 미토콘드리아 호흡이 완전히 투과화될 때까지 증가하며, 이때 숙시네이트와 ADP가 세포로 들어갑니다.

그러나 과도한 양의 디지토닌이 사용되면 미토콘드리아 외막 무결성이 손상될 수 있으며, 이로 인해 복합체에서 의존성 상태로의 3차 호흡이 감소할 수 있습니다. 사이토크롬 c는 디지토닌 처리된 세포에서 복합체에서 종속 상태 3회 호흡을 강화하지 않으며, 이는 미토콘드리아 외막에서 사이토크롬 c의 손실이 없으며 시토크롬 c가 매우 높은 용량의 디지토닌으로 처리된 세포의 호흡을 향상시킬 수 있음에도 불구하고 미토콘드리아 무결성이 보존됨을 나타냅니다. 디지토닌 투과화 후 미토콘드리아 복합체 활성의 외인성 기질의 추가는 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 1, 2, 4 최대 호흡수의 증가를 유도합니다.

감소된 호흡 수치의 생성은 이전 실험의 미토콘드리아 억제제로 인한 산소 그래프 챔버의 오염 때문일 수 있습니다. 알리기마이신의 존재 및 FCCP의 순차적 첨가 하에서, 세포의 최대 비결합 호흡수가 관찰됩니다. 일단 숙달되면 이러한 기술 중 어느 것이든 제대로 수행되면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 각 실험 후에 세척 산소 그래프 챔버와 스토퍼를 광범위하게 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라, 세포 ATP 함량 측정과 같은 다른 방법, 각각 세포 활성에 나타나고, 미토콘드리아 기질 수치를 수행하여 호흡수의 변화가 미토콘드리아 기질의 부족 또는 ATP 사이네이트 활성 감소로 인한 것인지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 바이오네제틱스 분야의 연구자들이 후천적 및 유전적 미토콘드리아 질환, 산소 스트레스, 피부 관류 손상 및 온전한 또는 투과화된 세포 또는 섬유 및 분리된 미토콘드리아의 노화와 같은 분야에서 미토콘드리아 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 고해상도 호흡량 측정을 사용하여 투과되고 손상되지 않은 세포에서 미토콘드리아의 기능을 돕는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 항마이신 a, 로테논, 요오지드나트륨, FCCP 및 아리코마이신을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험실 가운을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.