Name: 효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 학습하세요 Campylobacter jejuni Tlp3 케모수용체 리간드 결합 도메인의 효율적인 리폴딩 및 정화 방법을. 포함체에서 기능성 단백질을 회수하여 구조생물학 및 리간드 스크리닝 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 그의 초기 작품 Tlp3 LBD 생산에 대 한 유 C. Liu를 감사합니다. Mayra A. Machuca 딸 Admistrativo 데 많은, 기술과 전자 Innovación COLCIENCIAS 박사 장학금에 대 한 빚을입니다.

1. 표현의 그의6-Tlp3- 대장균 에 LBD
<ol><li>50 µ g mL-1 암 피 실린 BL21 Codon 플러스 (DE3)를 포함 하는 메 마른 Luria Bertani (파운드) 국물의 150 mL 접종-RIPL 셀 그의6의 표현에 대 한 pET151/D-이동 벡터와 변형-Tlp3-LBD (아미노산 잔류물 42-291), 그리고 품 어 그것 통 (궤도 직경, 25 m m)에 37 ° C에서 200 rpm으로 하룻밤.</li>
	<li>포함 하는 살 균 파운드 국물과 50 µ g mL-1 암 피 실린의 800 mL 6 2 L 삼각 플라스 크를 준비 합니다. 야간 문화 단계 1.1에서에서 얻은 20 mL와 함께 각 플라스 크 예방 600 nm에 도달 0.6에서 광학 밀도까지 200 rpm에서 연속 떨고와 37 ° C에서 그들을 품 어.</li>
	<li>1 mL aliquot 펠 릿 벤치탑 원심 분리기 (13000 x g, 4 ° C, 10 분)를 사용 하 여 플라스 크 (uninduced 컨트롤 샘플) 중 하나에서 고는 상쾌한 삭제. 이후 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 세균성 펠 릿을 저장 합니다.</li>
	<li>1mm 이소프로필 β-D-thiogalactoside (IPTG)의 문화 각 플라스 크에 추가 하 여 단백질 발현을 유도. 추가 4 h 200 rpm에서 통에 37 ° C에서 플라스 크 배양을 계속 한다.</li>
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 5000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 하 고는 상쾌한 삭제. 참고:이 시점에서 절차 수 있습니다 수 일시 중지-80 ° C 냉장고 저장용으로 셀 펠 릿을 배치 하 여.</li>
</ol>2. 절연 및 포함 시체의 변성
<ol><li>250 mL 비 커에 1.5 단계에서 얻은 하는 모든 셀 펠 릿 전송 및 버퍼 A의 100 mL (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl) 추가. 완전히 (경우 냉동) 해 동, 세포를 허용 하 고 resuspend는 펠 릿. 달리 명시 되지 않는 한 얼음 샘플을 유지.</li>
	<li>세 번 하는 세포를 lyse genomic DNA의 완전 한 전단 고압 균질 화를 통해 resuspended 세포를 전달 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 10000 x g에서 lysate 원심 상쾌한 (녹는 분수)의 1 mL 샘플을 수집 하 고 후속 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 그것을 저장. 상쾌한의 나머지를 취소 하 고 얼음에 펠 릿을 놓습니다. 참고:이 펠 릿은 색상에 흰색 (손상 되지 않은 세포는 갈색의 그늘에서 쉽게 구별할 수 색에) 포함 시체를 포함.</li>
	<li>철저 하 게 20 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 B에에서 포함 시체 펠 릿 resuspend (10 mM Tris HCl pH 8.0, 0.2 m m phenylmethanesulfonyl 불 (PMSF), 1% 트라이 톤 X-100). 이 용이 막 및 막 단백질의 solubilisation. 1-2 분 물의 resuspension 원조 소용돌이.</li>
	<li>원심에서 4 ° C에서 15 분 동안 10000 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>Vortexing 1-2 분 펠 릿 작은 조각으로 나누어져 확인에 대 한 튜브에 의해 철저 하 게 20 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 B에에서 펠 릿을 resuspend. 피펫으로 물의 resuspension 펠 릿을 아래로 샘플. 참고: 그것은 불순물에서 무료 포함 시체를 철저 하 게 펠 릿을 resuspend 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>2.5 단계를 반복 합니다. 인지는 상쾌한 흐린 색의 반복 단계 2.6 2.5 (순서 대로)는 상쾌한까지 명확 하 고 무색입니다.</li>
	<li>Vortexing 1-2 분에 대 한 튜브에 의해 (10 mM Tris HCl pH 8.0 0.2 밀리미터 PMSF) 얼음 처럼 차가운 버퍼 C 20 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>2.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>25 mL의 얼음 변성 버퍼 D (10 mM Tris HCl pH 8.0, 8 M 요소, 10 m m dithiothreitol (DTT), 0.2 밀리미터 PMSF) 포함 시체 펠 릿을 해산을 추가 합니다. 1-2 분, 또는 펠 릿은 작은 조각으로 부 러 때까지 vortexing에 의해 철저 하 게 resuspend.</li>
	<li>혼합 4 ° c.에 30-120 분 30 rpm의 회전 속도와 축 회전에 의해 서 스 펜 션</li>
	<li>30000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리에 의해 변성된 단백질 해결책을 명확히는 상쾌한 얼음에 놓고는 펠 릿을 삭제 합니다.</li>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 24 SDS 젤 분석을 위한 약 수 고-20 ° c.에 그것을 배치합니다 참고:이 시점에서, 절차 스냅 어 aliquoted 샘플 액체 질소에 의해 일시 중지 될 수 및 스토리지-80 ° C에서 그것을 유지.</li>
</ol>3. 단백질을 Refolding
<ol><li>250 mL의 버퍼 E (3m 우 레 아, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 0.4 M L-아르기닌 monohydrochloride, 20 mM 감소 L-티, 2 mM 산화 L 티) 500 mL 비 커에 준비 하 고 4 ° c.까지 버퍼를 냉각</li>
	<li>그의6을 포함 하는 변성된 단백질 혼합의 60 mg을 추가-Tlp3-LBD 500 rpm에서 버퍼를 교 반 하면서 단계 버퍼 E의 2.13 ~ 250 mL에서에서 얻은. 연속 교 반 24-48 h에 대 한 500 rpm으로 4 ° C에서 refolding 믹스를 품 어. 이 단계에서 최종 단백질 농도 0.2 mg mL-1.</li>
	<li>8-10 L 물통에 버퍼 A의 7 L를 준비 하 고 24-48 h에서 열린다 다음 단계 (단계 3.4)에 대 한 준비에 4 ° C까지 냉각 ( 그림 1의 순서도 참조).</li>
	<li>28mm 비정상적된 직경, 10 m m ethylenediaminetetraacetic 산 disodium 소금 (EDTA-없음2) 200 mL에 12-14 kDa에 분자량 컷오프의 투 석 튜브의 ~ 50 cm 조각 담가 그리고 끓는 때까지 가스 불꽃을 통해 그것을 열. 린스의 ddH2오 200 mL와 함께 투 석 막</li>
	<li>투 석 배관 폐쇄와 함께 투 석 막의 한쪽 끝을 클램프와 혼합물 분리 튜브에 3.2 단계에서 얻은 refolding 250 mL를 전송. 다른 클램프와 오픈 엔드를 닫습니다. 아무 누출 확인 막의 무결성을 확인 하십시오.</li>
	<li>버퍼 A 단계 3.3에서에서 준비 미리 냉각 7 l 투 양동이에 투 관을 놓습니다. 바, 그것은 감동 하는 동안 투 석 튜브를 만지지 것입니다 보장 자기 저 어를 놓습니다.</li>
	<li>500 rpm에서 교 반 계속 4 ° C에서 샘플을 dialyse 하 고 적어도 4 시간 동안 12 h의 버퍼를 변경 합니다. 마지막 버퍼 변경 후 샘플 dialyse 하룻밤을 둡니다. 참고: 투 석, 동안 요소 (3 M)의 초과 점차적으로 제거 refold를 단백질 수 변성된 단백질 해결책에서. 투 석의 끝에 무거운 단백질 강 수를 관찰할 수 있습니다.</li>
	<li>통에서 분리 튜브를 제거 하 고 500 mL 비 커에 그 내용을 전송. 달리 명시 되지 않는 한 얼음, 단백질 해결책을 유지.</li>
	<li>어떤 침전 된 단백질 제거를 500 mL 유리병에 0.43 µ m 기 공 크기 세포 막을 통해 단백질 해결책을 필터링 합니다.</li>
</ol>4. 그의6의 정화-단백질 Immobilised 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 태그
<ol><li>
충전 하 고 equilibrate 5 mL prepacked chelating 열.
	<ol>
<li>연동 펌프, 공기 연결 튜브에 갇혀 있다는 것을 보장 하는 열을 연결 합니다.</li>
		<li>DdH2오의 25-50 mL를 통해 전달 하 여 열을 씻어</li>
		<li>0.1 m M NiCl2 의 3 mL 로드 다음 25 mL ddH2오의를 통해 전달 하 여 열을 충전</li>
		<li>(로딩 버퍼, 20 mM Tris HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 이미 20 m m)의 버퍼 F 25 mL와 열 equilibrate</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 M Tris HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl의 그리고 2 M 이미 재고 솔루션의 2.5 mL 2.5 mL을 추가 하 여 버퍼 F 구성이 3.9 단계에서 얻은 refolded 단백질 견본을 조정 합니다.</li>
	<li>(언바운드 단백질) 5 mL/min의 속도 흐름을 통해 삭제에 열에 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>50-100 mL 비 특히 바인딩된 단백질을 통해 흐름 삭제 F 버퍼의 열을 씻어.</li>
	<li>그의6elute-Tlp3-버퍼 G 25 mL (차입 버퍼, 20 mM Tris HCl 500 mM NaCl, 이미 500 m m)와 LBD 풀 흐름을 통해 분수 (Bradford 시 약을 사용 하 여 결정)로 단백질을 포함 하 고.</li>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 풀링된 샘플의 단백질 농도 측정 합니다. SDS 페이지 분석 및 장소-20 ° c.에 aliquot 작은 걸릴</li>
</ol>5. 그의6-태그 TEV 프로 테아 제 (옵션)를 사용 하 여 제거
<ol><li>준비, 그리고 4 ° c, (TEV 분열 버퍼, 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) 글리세롤, 2mm DTT) 버퍼 H의 4 L 냉각.</li>
	<li>투 석 배관의 대략 5-7 cm 컷 (직경 2-3cm) ddH2오 200 mL에 젖어</li>
	<li>그의6추가-태그 TEV 프로 테아 제는 그의6-1 TEV에 마지막 어 금 니 비율 4.5 단계에서 태그 단백질 준비: 8 단백질.</li>
	<li>투 석 배관 폐쇄와 함께 튜브의 한쪽 끝을 클램프 고 단백질/TEV protease 혼합물으로 채우십시오. 다른 쪽 끝을 닫고 아무 누출 확인 합니다.</li>
	<li>장소는 투 석 (에서 단계 5.1) 버퍼 H의 사전 냉각된 4 L로 튜브 및 연속으로 4 ° C에서 그것을 품 어 2 h. 변경 된 버퍼에 대 한 교 반 하 고 TEV 중재 분열 반응은 완료 있도록 하룻밤 투를 계속 합니다.</li>
	<li>한편, 준비 하 고 멋진 (4 ° C) 4 L 버퍼의 난 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 m m NaCl, 1% (v/v) 글리세롤) 다음 날에 대 한 준비.</li>
	<li>야간 투 석 후 단계 5.6에서에서 준비 하는 버퍼를 버퍼를 교환 하 고 추가 1-2 h 4 ° c.에 대 한 dialyse</li>
	<li>투 통에서 튜브를 제거 하 고 튜브의 한쪽 끝을 unclip 50ml 팔 콘 튜브에 단백질 해결책을 전송. 달리 명시 하지 않는 한, 얼음에 계속 및 0.43 µ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>샘플의 볼륨을 측정 하 고 버퍼 F 구성이 트리 스, NaCl 및 이미 농도 조정 (예: 버퍼 J에에서 단백질 해결책의 25 ml 1 M Tris HCl pH 8.0, 5 M NaCl의 1.75 mL의 0.25 mL 및 2 M 이미 0.25 mL 추가).</li>
	<li>4.1 단계에 설명 된 대로 5 mL HiTrap 킬레이트 화 HP 열을 준비 합니다.</li>
	<li>열에 샘플을 로드 (흐름 율: 5 mL/min)는 흐름-이 통해, 포함 된 Tlp3 LBD (잔류물 42-291) 수집. Uncleaved 단백질, 쪼개진는 그의6-태그와 그의6-TEV는 열에 의해 유지 됩니다.</li>
	<li>씻어 열 5 mL 버퍼 F (로딩 버퍼)을 통과 하는 eluate 수집 모든 태그가 없는 단백질을 허용.</li>
	<li>수영장은 eluate 5.11, 5.12 단계에서 얻은 고 단백질 농도 측정 한다. 작은 aliquot 고 SDS 페이지 분석-20 ° C에서 그것을 저장.</li>
</ol>6. 크기 배제 크로마토그래피 (젤 여과) Tlp3 LBD의
<ol><li>버퍼 A의 1 L (10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl)을 준비 하 고 0.43 µ m의 멤브레인을 사용 하 여 필터링 합니다.</li>
	<li>4 mL/min의 유량에서 버퍼 A 26/60 크기 제외 열 equilibrate</li>
	<li>5.13 10 kDa 컷오프 (4 ° C, 4000 x g)와 15 mL 원심 집중 장치를 사용 하 여 3-4 mL의 볼륨에 단계에서 얻은 단백질 견본을 집중 한다.</li>
	<li>13000 x g, 어떤 침전 된 단백질 제거를 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 단백질 해결책을 명확히 합니다.</li>
	<li>미리 equilibrated 26/60 젤 여과 열에 샘플을 로드 합니다. 모니터는 UV 트레이스 4 mL/분의 유량에서 버퍼 A에에서 크로마토그래피를 수행 합니다. Tlp3 LBD 210-220 mL의 보존 볼륨에서 elutes. 피크 분수 풀.</li>
	<li>단백질 농도 측정 합니다. 받아 작은 SDS 페이지 분석을 위한 aliquot.</li>
</ol>7. 단백질 정화의 다양 한 단계에서 수집 된 샘플의 SDS 페이지 분석
<ol><li>SDS 페이지 실행 버퍼 (버퍼 J) 1 리터를 준비, 25 m m를 포함 하는 트리 스, 250mm 글리신 pH 8.3 및 0.1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 (SDS).</li>
	<li>SDS 페이지 로딩 버퍼 (버퍼 K) x 5의 10 mL를 준비, 0.25 M Tris HCl pH 6.8을 포함, 10% (w/v) SDS, 50% (v/v) 글리세롤, 1mm DTT, 그리고 0.05 %bromophenol 블루.</li>
	<li>정화의 다른 단계 동안 수집 된 aliquots를 허용 (1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6 단계) 해 동.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 SDS 페이지 로딩 버퍼, 볼륨을 조정 ddH2오 10 µ L 5 x 2 µ L로 전체 단백질의 15 µ g에 해당 하는 볼륨을 혼합</li>
	<li>5-10 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열, 30 s 및 전송에 대 한 10000 x g에서 회전 깨끗 한 관으로 샘플.</li>
	<li>SDS 페이지 젤, 15 %polyacrylamide 젤 분리를 사용 하 여 준비 (5 mL: 2.5 mL 30% (w/v) 두번째-아크릴, 1.2 mL에 대 한 1.5 M Tris HCl pH 8.8, 1.2 mL ddH2O, 50 µ L 10% (w/v) SDS, 50 µ L 20% (w/v) 암모늄 persulfate (AP), 3 µ L tetramethylethylenediamine (TEMED) 그리고 5 %polyacrylamide 젤 스태킹 (아크릴-2 mL: 340 µ L 30% (w/v) 두번째에 대 한 250 µ L 1 M Tris pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 µ L 10% (w/v) SDS, 20 µ L 20% (w/v) AP, 2 µ L TEMED).</li>
	<li>전기 기구를 조립 하 고 제조자의 권고에 따라 버퍼를 실행 하는 SDS 페이지 x 1 입력.</li>
	<li>단백질 분자량 마커 단계 7.5에서에서 준비 하는 샘플을 로드 합니다. 25의 정 전류에서 전기 영동을 수행 mA.</li>
	<li>용기에 젤을 전송 하 고 25% (v/v) 소 프로 파 놀, 10% (v/v) 초 산 및 0.03% (w/v) 화려한 블루 R-250 포함 하는 솔루션 얼룩 Coomassie 파란의 ddH2오 추가 150 mL와 함께 그것을 씻어. 실 온에서 30 분 동안 수평 회전 플랫폼에서 컨테이너를 놓습니다.</li>
	<li>DdH2O 젤 린스 고 destaining 솔루션 5% (v/v) 메탄올과 7% (v/v) 초 산을 포함 합니다. 1 시간에 대 한 수평 회전 플랫폼을 사용 하 여 혼합 하는 동안 destain.</li>
	<li>젤 이미지 그리고 분석.</li>
</ol>8. 원형이 색 성 (CD) 분광학 분석의 이차 구조 refolded 순수 단백질의
<ol><li>0.5-1mg 6.6 분리 튜브에 단계에서 얻은 refolded 단백질의 전송 및 5의 L 버퍼 L (50 m m 인산 나트륨 pH 7.4), 4 ° c precooled를 포함 하는 투 석 양동이 연속 교 반으로 4 ° C에서 샘플 dialyse 및 적어도 3-4 버퍼 변경 샘플 dialyse 하룻밤을 떠나기 전에 2-4 h 이상.</li>
	<li>0.06 밀리 그램 mL-1 10 kDa 컷오프 원심 집중 장치를 사용 하 여 dialysed 단백질 해결책 집중.</li>
	<li>13000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 솔루션을 명확히 합니다.</li>
	<li>25 ° C와 20 nm 분-1의 스캔 속도 spectropolarimeter를 사용 하 여 200-260 nm의 파장 범위에서 샘플의 멀리 UV CD 스펙트럼을 기록 합니다. 투 석 버퍼를 사용 하 여 빈 컨트롤. 3 중에 녹음을 반복 하 고 평균된 스펙트럼을 생성.</li>
	<li>계산 하는 이차 구조 콘텐츠 CD를 deconvoluting 하 여 스펙트럼은 DichroWeb에서 CDSSTR 프로그램을 사용 하 여 서버25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

식 및 세균성 chemoreceptor Tlp3의 periplasmic LBD의 포함 시체에서 refolding 간단한 절차 제공 됩니다. 순수 단백질의 준비- 대장균, 정화 및 포함 시체, solubilisation 애완 동물 플라스 미드 인코딩 유전자 표현 포함 연속 선호도 의해 변성된 단백질의 정화의 refolding 및 크기 배제 크로마토그래피 단계입니다. 촉진 하는 요소 변성 및 refolding 희석/투 석-중재 최적화는 종종 포함 시체26에 입금 하는 단백질의 적절 한 renaturation 보장 하는 데 필요한 프로토콜에서 중요 한 단계입니다.
먼저 요소를 포함 하는 버퍼에 변성된 샘플을 희석 한 다음 여 그것 없는 버퍼에 대 한 샘플을 dialysing Tlp3 LBD의 refolding 2 단계 방식으로 달성 되었다. 이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 refolded 단백질 기능 및 crystallisab...

Chemotaxis 및 운동 성 세균성 식민 및 호스트1,2,3의 내 습을 홍보 함으로써 Campylobacter jejuni 병 인에 중요 한 역할을 보여왔다. 화학 신호에 의해 유도 chemotaxis 박테리아를 성장 위한 최적의 환경으로 이동할 수 있습니다. 이 프로세스는 불린다 chemoreceptors, 단백질 또는 트랜스듀서와 같은 단백질 (Tlps)의 집합에 의해 세포내 및 환경 화학 신호의 인식 포함 됩니다. 대부분 chemoreceptors는 바인딩 도메인 (LBD), 막 횡단 도메인 및 세포질 신호 도메인, 후자는 신호를 전송 하는 신호 cytosolic 단백질 상호 작용 하는 extracytoplasmic ligand 단백질 막 포함 하는 flagellar 모터4,5,,67.
11 다른 chemoreceptors C. jejuni 게놈4,8에서 확인 되었습니다. 날짜 하려면, 이러한 chemoreceptors의 일부 특징 되어 있다 그리고 Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, Tlp1113 의 리간드 특이 알려져 있다. 이 종에서 나머지 chemoreceptors 그리고 다른 박테리아에 수많은 chemoreceptors의 자연 ligands의 접힌 및 매우 순수한 재조합 chemoreceptor LBDs14, 의 생산에 의해 크게 촉진 될 수 있다 15 , 그러나 16., heterologously 대장균 세균성 chemoreceptors의 periplasmic LBDs를 자주 표현 하려고 포함 시체17,18,19로 그들의 대상으로 발생 . 그럼에도 불구 하 고,이 현상을 수 용이 하 게 쉬운 격리 및 복구 단백질의 손에. 여기, 메서드 포함 시체에서 단백질 복구, refolding와 정화, 예를 들어 periplasmic LBD의 C. jejuni chemoreceptor Tlp3 사용 하 여 제공 됩니다. 이 예제에서는 Tlp3 LBD 풍부 하 게 2 분 히스티딘 kinases와 원핵생물20,21, chemoreceptors에 있는 감지 영역의 dCACHE 가족20 에 속하기 때문에 선정 되었다 22 , 23.
이 방법에서는, pET151/D-이동 벡터에 따라 식 구문 통합 N 맨끝 그의6설계 되었습니다-태그 뒤에 담배 엣지 후속 태그 제거19에 대 한 바이러스 (TEV) 효소 분열 사이트. 프로토콜은 단백질 overexpression을 대장균, 격리 및 포함 몸과 요소 고갈에 의해 refolding 단백질의 solubilisation 중재 하는 요소에 설명 합니다. Refolding, 다음 샘플은 선택적 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하 고 있다. 순화 된 단백질의 접힌된 상태는 원형이 색 성 분광학을 사용 하 여 확인 됩니다. 이것은 이전 복구 하 고 다른 chemoreceptor, 헬리코박터 파일로리 TlpC19의 LBD 정화 개발 된 방법의 수정 된 버전. 이 절차는 그림 1에서 요약의 단백질 순수성을 가진 세균성 문화의 1 L 당 순수 하 고, 태그 Tlp3 LBD의 10-20 밀리 그램 생성 > 90 %SDS 페이지 예상된.

<table><tbody><tr><td>트리스 베이스</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>MERK 밀리포어</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-티오갈락토시드(IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>요소</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌 일염산염</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>환원 L-글루타티온</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>산화 L-글루타티온</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염기성 (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기(NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염 탈수물(EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>염화니켈(NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>염색되지 않은 단백질 사다리, 브로드 범위 (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel 원심 농축기 (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 팔콘 튜브</td><td>FALCON</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>투석</td><td></td></tr><tr><td>뱀피부 투석 튜빙</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>사전 포장된 HiTrap 킬레이트 HP 컬럼</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C5 고압 호질화기</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - C5</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프 P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HiLoad 26/60 크기-제외 컬럼&nbsp;</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td></td><td></td></tr> 28989336 <tr><td>JASCO J-815 분광편광계</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

효율적인 refolding 및 chemoreceptor ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Chemoreceptors와 겨냥 한 ligand 특이성의 분자 기준의 구조 연구의 자연 ligands의 밀리 그램 양의 순수 하 고, 접힌 ligand 바인딩 도메인의 생산에 의해 크게 촉진 수 있습니다. Heterologously의 대장균 (대장균) 박테리아 chemoreceptors periplasmic ligand 바인딩 도메인을 자주 표현 하려고 포함 시체에 그들의 타겟팅에 발생. 여기, 메서드 포함 시체, refolding와 정화, Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3의 periplasmic dCACHE ligand 바인딩 도메인을 사용 하 여 예를 들어에서 단백질 복구를 위해 제공 됩니다. 접근 포함를 쪼갤와 관심사의 단백질의 표현을 그의6-태그, 격리 및 요소 중재 solubilisation 포함 시체, 친화성 크로마토그래피에 의하여 요소 고갈, 그리고 정화에 의해 refolding 단백질 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 따라. 원형이 색 성 분광학은 순수 단백질의 접힌된 상태를 확인 하는 데 사용 됩니다. 그것은이 프로토콜은 일반적으로 밀리 그램 양의 dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인의 가용성과 crystallisable 형태로 다른 세균성 chemoreceptors의 생산 하는 데 유용 증명 되었습니다.

그의6의 재조합 표현-Tlp3-포함 시체 증 착 단백질 귀착되 었 다 대장균 에 LBD. 세균성 문화 단계 2.13에서에서 계산의 1 l 식 수율은 약 100mg의 그의6-Tlp3-LBD 포함 시체에 있는 예금. 여기서 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 단백질 격리 절차 포함, 단백질을 refolding 몸과 정화 친화성 크로마토그래피, 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피의 solubilisation의 구성 10-20 밀리 그램의 세균성 문화 1 L 당 순수 하 고, 태그 Tlp3 LBD의 수익률.
단백질 220 mL (그림 2A)의 보존 볼륨에 해당 하나, 대칭 피크로 젤 여과 열에서 eluted....

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

이 절차의 전반적인 목표는 봉입체에서 화학수용체 리간드 결합 도메인을 다시 접고 구조 및 기능 연구에 사용하기 위해 정제하는 것입니다. 박테리아 화학수용체가 어떤 신호를 어떻게 보내는지 확인하기 위해 분리된 리간드 결합 도메인을 사용하여 소분자 라이브러리를 스크리닝하거나 리간드가 있거나 없는 구조를 결정할 수 있습니다. E.coli에서 세포외 리간드 결합 도메인의 억제는 종종 봉입체에 침착을 초래합니다.여기에서는 봉입체에서 밀리그램 양의 기능성 단백질을 회수할 수 있는 방법을 보여줍니다. 먼저 암피실린 mL당 50마이크로그램이 함유된 멸균 LB 육수 150mL에 헥사히스티딘 TIp3-LBD 발현을 위해 pET151 D-TOPO 벡터로 형질전환된 BL21-CodonPlus RIPL 세포를 접종합니다. 하룻밤 동안 200RPM과 37°C에서 배양합니다.800mL의 멸균 LB 육수와 mL당 50μg의 암피실린이 들어 있는 2L 삼각 플라스크 6개를 준비합니다. 각 플라스크에 20mL의 야간 배양액을 접종합니다. OD600이 0.6에 도달할 때까지 200RPM에서 연속 흔들면서 섭씨 37도에서 플라스크를 배양합니다.이 시점에서 각 플라스크에 1밀리몰의 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 섭씨 37도의 셰이커에서 200RPM의 셰이커로 플라스크를 추가로 4시간 동안 계속 배양합니다. 5000xg와 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.그런 다음 상층액을 버리십시오. 모든 세포 펠릿을 250mL 비커로 옮기고 100mL의 Buffer A를 추가합니다. 동결된 경우 세포를 완전히 해동시킨 다음 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 샘플을 보관하십시오.amp달리 표시되지 않는 한 얼음 위에 있습니다.다음으로, 재부유 세포를 고압 균질기에 3회 통과시켜 세포를 용해시키고 게놈 DNA의 완전한 전단을 보장합니다. 다음, 15 분 동안 10, 000 xg 및 4 섭씨 온도에 용해물을 분리기. 상층액 시료 1mL를 채취하여 후속 SDS-PAGE 분석을 위해 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.그런 다음 나머지 상등액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 20mL의 얼음처럼 차가운 완충액 B에 봉입체 펠렛을 철저히 재현탁시키면 막 및 막 단백질의 가용화를 촉진합니다. 재부유를 돕기 위해 1-2분 동안 샘플을 볼텍스합니다.샘플을 원심분리한 후, 먼저 1-2분 동안 튜브를 보텍싱하여 20mL의 얼음처럼 차가운 버퍼 B에 펠릿을 다시 철저히 재현탁합니다. 펠릿이 작은 조각으로 부서졌는지 확인하십시오. 그런 다음 샘플을 위아래로 피펫팅하여 다시 현탁합니다.이전과 같이 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 상등액이 흐리거나 착색된 경우 샘플을 다시 원심분리하고 추가로 얼음처럼 차가운 버퍼 B를 사용하여 다시 현탁시킵니다. 다시 펠릿화하기 전에 상등액이 투명하고 무색이 될 때까지 원심분리와 재현탁을 반복합니다.펠릿에 얼음처럼 차가운 Buffer C 20mL를 추가하고 튜브를 1-2분 동안 볼텍싱하여 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 회전시킨 후 25mL의 얼음 저온 변성 완충액 D를 첨가하고 1-2분 동안 또는 펠릿이 작은 조각으로 부서질 때까지 튜브를 볼텍싱하여 개재체 펠렛을 철저히 재현탁합니다. 30-120분 동안 30RPM과 4°C에서 축 회전으로 서스펜션을 혼합합니다.30 분 동안 30의, 000 xg 및 4개의 섭씨 온도에 분리기분리에 의하여 변성된 단백질 해결책을 명백하게 하십시오. 그런 다음 상등액을 얼음 위에 놓고 펠릿을 버립니다. 500RPM에서 250mL의 Buffer E를 교반하면서 hexahistadine TIp3-LBD를 함유한 변성 단백질 믹스 60mg을 추가합니다.섭씨 4도에서 24-48시간 동안 500RPM으로 계속 교반하면서 재접는 혼합물을 배양합니다. 최종 단백질 농도는 mL당 0.2mg입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 7L의 예냉각된 Buffer A와 투석 튜브를 준비한 후 투석 튜브 마개를 사용하여 투석막의 한쪽 끝을 고정하고 투석 혼합물을 튜브로 옮깁니다.그런 다음 열린 끝을 고정하고 누출이 없는지 확인합니다. 투석 튜브를 예냉각된 버퍼 A가 있는 투석 버킷에 넣고 자기 교반 막대를 추가하여 교반하는 동안 투석 튜브에 닿지 않도록 합니다. 섭씨 4도에서 500RPM으로 연속 교반하여 시료를 투석하고 12시간 동안 완충액을 최소 4회 교체합니다.마지막 완충액 교체 후 검체를 밤새 투석하도록 둡니다. 다음 날 아침, 양동이에서 투석 튜브를 꺼내 내용물을 500mL 비커에 옮깁니다. 달리 표시되지 않는 한 단백질 용액을 얼음 위에 보관하십시오.0.43미크론 기공 크기의 멤브레인을 통해 단백질 용액을 500mL 유리병에 여과하여 침전된 단백질을 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 킬레이트 컬럼을 세척, 충전 및 평형화한 후, 25mL의 5M 염화나트륨, 2.5mL의 1M 트리스-HCl, pH 8.0 및 2.5mL의 2M 이미다졸 원액을 첨가하여 얻은 다시 접힌 단백질 샘플을 버퍼 F의 조성으로 조정합니다. 분당 5mL 이하의 속도로 샘플을 컬럼에 로드하고 결합되지 않은 단백질이 포함된 플로우스루를 버립니다.그런 다음 50-100mL의 Buffer F로 컬럼을 세척하여 특이적으로 결합되지 않은 단백질을 제거하고 플로우스루를 폐기합니다. hexahistadine TIp3-LBD를 25mL의 Buffer G로 용리한 다음 단백질을 포함하는 플로우스루 분획을 풀링합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Buffer H 및 투석 튜빙을 준비한 후, 튜빙의 헥사히스타딘 태그가 지정된 단백질에 헥사히스타딘 태그가 지정된 TEV 프로테아제를 추가합니다.단백질 1 TEV에 8 TEV의 최종 몰 비율을 추가합니다. 클램프된 투석관을 예냉각된 4L의 Buffer H에 넣고 섭씨 4도에서 2시간 동안 계속 교반하면서 배양합니다. 그런 다음 완충액을 교체하고 TEV 매개 절단 반응이 완료될 때까지 밤새 투석을 계속합니다.Buffer I로 교환하고 단백질 용액을 여과하고 샘플을 다시 조정한 후 준비된 5mL HiTrap 킬레이트 HP 컬럼에 샘플을 로드합니다. 분당 5mL의 유속으로 태그가 지정되지 않은 TIp3-LBD가 포함된 플로우스루를 수집합니다. 절단된 단백질에서 절단된 헥사히스타딘 태그와 헥사히스타딘 TEV는 컬럼에 의해 유지됩니다.5mL의 Buffer F를 사용하여 태그가 지정되지 않은 단백질이 통과하여 용리액을 수집할 수 있도록 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 크기 배제 컬럼을 평형화하고 텍스트 프로토콜에 따라 단백질 샘플을 농축 및 정화한 후 사전 평형화된 26/60 겔 여과 컬럼에 샘플을 로드합니다. Buffer A를 분당 4mL의 유속으로 도포하고 단백질 용리에 대한 UV 트레이스를 모니터링합니다.TIp3-LBD는 210 - 220mL의 머무름 부피로 용리됩니다. 마지막으로, 크로마토그래피 다음, 분획을 풀링한 다음 단백질 농도를 측정하고 SDS-PAGE를 수행합니다. 이 비디오에서 시연된 단백질 분리 절차는 박테리아 배양 1L당 10-20mg의 순수한 태그가 지정되지 않은 TIp3-LBD를 산출했습니다.여기에서 볼 수 있듯이, 겔 여과 컬럼에서 용출된 단백질은 220mL의 머무름 부피에 해당하는 단일 대칭 피크를 가지며 계산된 분자량은 29kDa입니다. SDS-PAGE에 의해 여기에서 볼 수 있듯이, 봉입체는 겉보기 분자량이 28kDa인 헥사히스타딘 TIp3-LBD를 주로 함유했으며, 이는 31.8kDa의 아미노산 서열에서 계산된 값에 가깝습니다. 헥사히스타딘 태그 제거, 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과 단계를 통해 고순도 단백질을 얻을 수 있었습니다.CDSSTR을 사용한 CD 분광법은 헥사히스티딘 TIp3-LBD의 2차 구조가 31%의 알파 나선과 23%의 베타 시트 함량으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 이는 또한 JPred 3 서버를 사용한 염기서열 분석에서 각각 37%와 26%의 예측 값에 근접했습니다. 이 프로토콜은 처음부터 끝까지 최소 5일이 소요되며 필요한 경우 세 가지 단계에서 일시 중지할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때, 와류 또는 위아래로 피펫팅을 통해 변성 완충액에 있는 봉입체를 철저하고 완벽하게 재현하는 것이 이 모든 실현에 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 화학수용체 TIp3의 리간드 결합 도메인을 다시 접고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 정제된 단백질은 이 수용체에 대한 리간드의 특이성을 조사하기 위해 산을 결합하는 데 사용할 수 있습니다.또한, 우리는 이전에 이 절차에 의해 얻어진 단백질이 고도로 정렬된 결정을 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여주었으며, 이는 리간드 특이성에 대한 구조적 기초 연구를 위한 길을 열었습니다. 이 절차는 일반적으로 다른 박테리아로부터 결정화되고 용해되는 형태로 mg 양의 화학수용체를 생산하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 결정학적 연구를 위해 이러한 유형의 다른 화학수용체의 리간드 결합 도메인을 다시 접고 정제하기 위해 이 프로토콜을 원래 또는 약간 수정된 형태로 사용했습니다.각각의 개별적인 경우에서, 프로토콜의 최적화, 예를 들어, denaturing 및 refolding buffers의 조성 및 incubation 시간이 필요할 수 있음을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단백질-단백질 상호작용을 표적으로 하기 위한 REPLACE 전략의 구현을 설명합니다. REPLACE는 최적화된 펩티드 억제제를 약물과 같은 분자로 전환하기 위한 합성 및 컴퓨터 접근 방식을 포함하는 반복 전략입니다.

를 통해 교체 단백질 - 단백질 상호 작용의 억제제의 개발 : 설계 및 개발 비 ATP 경쟁 CDK 억제제에 응용

여기에서는 인간 백혈구 항원에 의해 제시되는 T-세포 수용체와 종양 항원 사이의 상호 작용의 본질이 T-세포 기능을 어떻게 지배하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 단백질 생산, X선 결정학, 생물 물리학 및 기능적 T 세포 실험이 포함됩니다.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

단백질-단백질 상호 작용(PPI)에서 다중특이적 결합 부위의 아미노산 선호도를 추정하기 위한 염기서열 다양화에 기반한 방법론을 설명합니다. 이 전략에서는 수천 개의 잠재적인 펩타이드 리간드가 생성되고 실리코로 스크리닝되어 사용 가능한 실험 방법의 일부 한계를 극복합니다.

단백질-단백질 상호작용에 관여할 수 있는 다중특이적 펩타이드 결합 도메인의 아미노산 선호도에 대한 전산 예측(Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-binding domains involved in protein-protein interactions)

여기서는 신약 개발에 필수적인 Sanglifehrin A와 Cyclophilin A/Ganoderiol-F 간의 단백질-리간드 결합 상호작용을 구조 중심으로 설계하는 프로토콜을 제시합니다. 리간드-수용체 복합체의 안정성은 분자 역학 시뮬레이션을 통해 평가되었습니다.

새로운 사이클로필린 A 억제제 및 가노데리올-F 유도체의 구조 유도 설계 및 개발: 실리코 내 접근법

단백질 설계에는 아미노산 염기서열의 구축과 기능적 변이체를 만들기 위한 특정 모티프의 통합이 포함됩니다. 이 접근 방식은 항생제 내성 병원체와 싸우기 위한 항균 펩타이드(AMP)의 개발에 매우 중요합니다. 본 논문은 다양한 생물정보학 도구를 이용한 단백질 구축 절차를 제시합니다.

De Novo 및 In Silico 단백질 설계를 위한 I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK 서버 및 HEX loria 적용

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

우리는 고순도 RNA 분리에 억제 효과가 있는 다량의 오일, 단백질 및 폴리페놀이 포함된 식물 종자에서 RNA를 분리하는 방법을 확립하는 데 성공했습니다. 우리의 방법은 종자에서 낮은 수준의 전사체를 가진 유전자의 발현을 모니터링하는 데 적합합니다.

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

학습하세요 Campylobacter jejuni Tlp3 케모수용체 리간드 결합 도메인의 효율적인 리폴딩 및 정화 방법을. 포함체에서 기능성 단백질을 회수하여 구조생물학 및 리간드 스크리닝 연구에 활용할 수 있습니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

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