효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

이 절차의 전반적인 목표는 봉입체에서 화학수용체 리간드 결합 도메인을 다시 접고 구조 및 기능 연구에 사용하기 위해 정제하는 것입니다. 박테리아 화학수용체가 어떤 신호를 어떻게 보내는지 확인하기 위해 분리된 리간드 결합 도메인을 사용하여 소분자 라이브러리를 스크리닝하거나 리간드가 있거나 없는 구조를 결정할 수 있습니다. E.coli에서 세포외 리간드 결합 도메인의 억제는 종종 봉입체에 침착을 초래합니다.

여기에서는 봉입체에서 밀리그램 양의 기능성 단백질을 회수할 수 있는 방법을 보여줍니다. 먼저 암피실린 mL당 50마이크로그램이 함유된 멸균 LB 육수 150mL에 헥사히스티딘 TIp3-LBD 발현을 위해 pET151 D-TOPO 벡터로 형질전환된 BL21-CodonPlus RIPL 세포를 접종합니다. 하룻밤 동안 200RPM과 37°C에서 배양합니다.

800mL의 멸균 LB 육수와 mL당 50μg의 암피실린이 들어 있는 2L 삼각 플라스크 6개를 준비합니다. 각 플라스크에 20mL의 야간 배양액을 접종합니다. OD600이 0.6에 도달할 때까지 200RPM에서 연속 흔들면서 섭씨 37도에서 플라스크를 배양합니다.

이 시점에서 각 플라스크에 1밀리몰의 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 섭씨 37도의 셰이커에서 200RPM의 셰이커로 플라스크를 추가로 4시간 동안 계속 배양합니다. 5000xg와 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.

그런 다음 상층액을 버리십시오. 모든 세포 펠릿을 250mL 비커로 옮기고 100mL의 Buffer A를 추가합니다. 동결된 경우 세포를 완전히 해동시킨 다음 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 샘플을 보관하십시오.amp달리 표시되지 않는 한 얼음 위에 있습니다.

다음으로, 재부유 세포를 고압 균질기에 3회 통과시켜 세포를 용해시키고 게놈 DNA의 완전한 전단을 보장합니다. 다음, 15 분 동안 10, 000 xg 및 4 섭씨 온도에 용해물을 분리기. 상층액 시료 1mL를 채취하여 후속 SDS-PAGE 분석을 위해 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

그런 다음 나머지 상등액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 20mL의 얼음처럼 차가운 완충액 B에 봉입체 펠렛을 철저히 재현탁시키면 막 및 막 단백질의 가용화를 촉진합니다. 재부유를 돕기 위해 1-2분 동안 샘플을 볼텍스합니다.

샘플을 원심분리한 후, 먼저 1-2분 동안 튜브를 보텍싱하여 20mL의 얼음처럼 차가운 버퍼 B에 펠릿을 다시 철저히 재현탁합니다. 펠릿이 작은 조각으로 부서졌는지 확인하십시오. 그런 다음 샘플을 위아래로 피펫팅하여 다시 현탁합니다.

이전과 같이 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 상등액이 흐리거나 착색된 경우 샘플을 다시 원심분리하고 추가로 얼음처럼 차가운 버퍼 B를 사용하여 다시 현탁시킵니다. 다시 펠릿화하기 전에 상등액이 투명하고 무색이 될 때까지 원심분리와 재현탁을 반복합니다.

펠릿에 얼음처럼 차가운 Buffer C 20mL를 추가하고 튜브를 1-2분 동안 볼텍싱하여 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 회전시킨 후 25mL의 얼음 저온 변성 완충액 D를 첨가하고 1-2분 동안 또는 펠릿이 작은 조각으로 부서질 때까지 튜브를 볼텍싱하여 개재체 펠렛을 철저히 재현탁합니다. 30-120분 동안 30RPM과 4°C에서 축 회전으로 서스펜션을 혼합합니다.

30 분 동안 30의, 000 xg 및 4개의 섭씨 온도에 분리기분리에 의하여 변성된 단백질 해결책을 명백하게 하십시오. 그런 다음 상등액을 얼음 위에 놓고 펠릿을 버립니다. 500RPM에서 250mL의 Buffer E를 교반하면서 hexahistadine TIp3-LBD를 함유한 변성 단백질 믹스 60mg을 추가합니다.

섭씨 4도에서 24-48시간 동안 500RPM으로 계속 교반하면서 재접는 혼합물을 배양합니다. 최종 단백질 농도는 mL당 0.2mg입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 7L의 예냉각된 Buffer A와 투석 튜브를 준비한 후 투석 튜브 마개를 사용하여 투석막의 한쪽 끝을 고정하고 투석 혼합물을 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 열린 끝을 고정하고 누출이 없는지 확인합니다. 투석 튜브를 예냉각된 버퍼 A가 있는 투석 버킷에 넣고 자기 교반 막대를 추가하여 교반하는 동안 투석 튜브에 닿지 않도록 합니다. 섭씨 4도에서 500RPM으로 연속 교반하여 시료를 투석하고 12시간 동안 완충액을 최소 4회 교체합니다.

마지막 완충액 교체 후 검체를 밤새 투석하도록 둡니다. 다음 날 아침, 양동이에서 투석 튜브를 꺼내 내용물을 500mL 비커에 옮깁니다. 달리 표시되지 않는 한 단백질 용액을 얼음 위에 보관하십시오.

0.43미크론 기공 크기의 멤브레인을 통해 단백질 용액을 500mL 유리병에 여과하여 침전된 단백질을 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 킬레이트 컬럼을 세척, 충전 및 평형화한 후, 25mL의 5M 염화나트륨, 2.5mL의 1M 트리스-HCl, pH 8.0 및 2.5mL의 2M 이미다졸 원액을 첨가하여 얻은 다시 접힌 단백질 샘플을 버퍼 F의 조성으로 조정합니다. 분당 5mL 이하의 속도로 샘플을 컬럼에 로드하고 결합되지 않은 단백질이 포함된 플로우스루를 버립니다.

그런 다음 50-100mL의 Buffer F로 컬럼을 세척하여 특이적으로 결합되지 않은 단백질을 제거하고 플로우스루를 폐기합니다. hexahistadine TIp3-LBD를 25mL의 Buffer G로 용리한 다음 단백질을 포함하는 플로우스루 분획을 풀링합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Buffer H 및 투석 튜빙을 준비한 후, 튜빙의 헥사히스타딘 태그가 지정된 단백질에 헥사히스타딘 태그가 지정된 TEV 프로테아제를 추가합니다.

단백질 1 TEV에 8 TEV의 최종 몰 비율을 추가합니다. 클램프된 투석관을 예냉각된 4L의 Buffer H에 넣고 섭씨 4도에서 2시간 동안 계속 교반하면서 배양합니다. 그런 다음 완충액을 교체하고 TEV 매개 절단 반응이 완료될 때까지 밤새 투석을 계속합니다.

Buffer I로 교환하고 단백질 용액을 여과하고 샘플을 다시 조정한 후 준비된 5mL HiTrap 킬레이트 HP 컬럼에 샘플을 로드합니다. 분당 5mL의 유속으로 태그가 지정되지 않은 TIp3-LBD가 포함된 플로우스루를 수집합니다. 절단된 단백질에서 절단된 헥사히스타딘 태그와 헥사히스타딘 TEV는 컬럼에 의해 유지됩니다.

5mL의 Buffer F를 사용하여 태그가 지정되지 않은 단백질이 통과하여 용리액을 수집할 수 있도록 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 크기 배제 컬럼을 평형화하고 텍스트 프로토콜에 따라 단백질 샘플을 농축 및 정화한 후 사전 평형화된 26/60 겔 여과 컬럼에 샘플을 로드합니다. Buffer A를 분당 4mL의 유속으로 도포하고 단백질 용리에 대한 UV 트레이스를 모니터링합니다.

TIp3-LBD는 210 - 220mL의 머무름 부피로 용리됩니다. 마지막으로, 크로마토그래피 다음, 분획을 풀링한 다음 단백질 농도를 측정하고 SDS-PAGE를 수행합니다. 이 비디오에서 시연된 단백질 분리 절차는 박테리아 배양 1L당 10-20mg의 순수한 태그가 지정되지 않은 TIp3-LBD를 산출했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 겔 여과 컬럼에서 용출된 단백질은 220mL의 머무름 부피에 해당하는 단일 대칭 피크를 가지며 계산된 분자량은 29kDa입니다. SDS-PAGE에 의해 여기에서 볼 수 있듯이, 봉입체는 겉보기 분자량이 28kDa인 헥사히스타딘 TIp3-LBD를 주로 함유했으며, 이는 31.8kDa의 아미노산 서열에서 계산된 값에 가깝습니다. 헥사히스타딘 태그 제거, 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과 단계를 통해 고순도 단백질을 얻을 수 있었습니다.

CDSSTR을 사용한 CD 분광법은 헥사히스티딘 TIp3-LBD의 2차 구조가 31%의 알파 나선과 23%의 베타 시트 함량으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 이는 또한 JPred 3 서버를 사용한 염기서열 분석에서 각각 37%와 26%의 예측 값에 근접했습니다. 이 프로토콜은 처음부터 끝까지 최소 5일이 소요되며 필요한 경우 세 가지 단계에서 일시 중지할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때, 와류 또는 위아래로 피펫팅을 통해 변성 완충액에 있는 봉입체를 철저하고 완벽하게 재현하는 것이 이 모든 실현에 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 화학수용체 TIp3의 리간드 결합 도메인을 다시 접고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 정제된 단백질은 이 수용체에 대한 리간드의 특이성을 조사하기 위해 산을 결합하는 데 사용할 수 있습니다.

또한, 우리는 이전에 이 절차에 의해 얻어진 단백질이 고도로 정렬된 결정을 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여주었으며, 이는 리간드 특이성에 대한 구조적 기초 연구를 위한 길을 열었습니다. 이 절차는 일반적으로 다른 박테리아로부터 결정화되고 용해되는 형태로 mg 양의 화학수용체를 생산하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 결정학적 연구를 위해 이러한 유형의 다른 화학수용체의 리간드 결합 도메인을 다시 접고 정제하기 위해 이 프로토콜을 원래 또는 약간 수정된 형태로 사용했습니다.

각각의 개별적인 경우에서, 프로토콜의 최적화, 예를 들어, denaturing 및 refolding buffers의 조성 및 incubation 시간이 필요할 수 있음을 기억하십시오.