양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

이 절차의 전반적인 목표는 식물 종자에서 고순도 RNA를 추출하는 것입니다. 이 방법은 씨앗의 원래 전사체를 포함하는 유전자 프로필의 이해와 같은 곡물 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자들이 스핀 컬럼 기반 방법을 약간 수정하여 고순도 RNA를 준비할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 체 앞에 있는 많은 양의 오일, 단백질, 탄수화물 및 폴리페놀이 고도로 정제된 RNA를 분리하기 어렵게 만들기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Kazumi Hikino가 맡을 것입니다. 실험을 시작하려면 RNA 추출을 위한 세포 용해 버퍼에 부피 분자 생물학 등급 PVP당 1%의 중량을 추가하고 혼합물을 격렬하게 와류화합니다. PVP를 섭씨 25도에서 20분 동안 배양하여 완전히 용해시킵니다.

20분 배양 후 거품이 생기지 않도록 튜브를 거꾸로 뒤집어 완충액을 부드럽게 혼합합니다. 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물에서 과일을 수확하여 얼음 위에 올려 놓은 두 개의 1.5mm 폴리프로필렌 튜브에 넣은 다음 과일을 섭씨 4도로 유지되는 알루미늄 판에 놓고 실체 현미경으로 과일에서 씨앗을 분리합니다. 다음으로, 약 200개의 분리된 씨앗을 이전에 얼음 위의 알루미늄 랙에 보관했던 1.5ml 폴리프로필렌 튜브에 넣고 즉시 튜브를 액체 질소에 넣습니다.

액체 질소에서 튜브를 제거하고 얼음 위의 알루미늄 랙에 다시 넣습니다. 각 튜브에 100마이크로리터의 1% PVP 버퍼를 추가하고 섭씨 4도에서 1000배 G로 1분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후 모터 그라인더를 사용하여 스테인리스 스틸 유봉으로 샘플을 균질화하면서 튜브를 얼음 위의 알루미늄 랙에 보관합니다. 다음으로, 550마이크로리터의 100%PVP 버퍼를 추가하고 튜브를 부드럽게 거꾸로 뒤집어 튜브를 혼합하고 배양합니다.

배양 후 용액을 원심 분리한 다음 550마이크로리터의 상층액을 새로운 1.5mm 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 상등액을 원심분리합니다. 450마이크로리터의 상층액을 새로운 1.5mm 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 상등액을 시판되는 키트를 사용하여 RNA 추출을 위한 세포 용해물로 사용합니다.

얼음 위에 알루미늄 랙을 준비하고 부드럽게 두드려 전체 RNA 혼합물을 해동한 다음 튜브를 랙에 놓습니다. 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다. 그런 다음 RNase가 없는 물에 총 RNA를 희석합니다.

시판 키트에서 전체 RNA와 완충액 세트를 해동하고 부드럽게 두드린 후 키트의 효소를 얼음 위에 보관하십시오. 후속 분석을 위해 멸균된 뉴클레아제가 없는 0.2밀리리터 폴리프로필렌 튜브를 준비합니다. 얼음 위에서 총 RNA 5마이크로리터, 올리고 DT 프라이머 1마이크로리터 또는 50마이크로몰, 0.2밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 1마이크로리터 또는 50마이크로몰 랜덤 6-mer를 결합합니다.

혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 표준 곡선에 대한 DNA 템플릿의 플라스미드 농도를 조정합니다. 다음으로, CDNA 용액을 증류수로 1에서 100까지 희석한 다음 2마이크로리터의 희석된 CDNA 용액과 표준 곡선을 위해 이전에 준비된 플라스미드를 정량적 realtime PCR 키트의 마스터 믹스에 추가합니다.

마지막으로 realtime PCR을 설정하고 샘플을 삽입합니다. 총 RNA는 세포 용해 완충액, PVP의 다양한 농도를 사용하여 대략 1, 000의 종자에서 고립되었다. 분리된 RNA의 양과 순도는 1.0%PVP가 종자에서 다량의 정제된 RNA를 분리하는 가장 효과적인 농도임을 보여줍니다.

200개의 종자에서 분리된 RNA의 농도, A260 및 A280 비율, A260 A230 비율은 이 방법이 개화 후 8일 및 12일 또는 DAF 종자에서 고도로 정제된 RNA를 분리하는 데 가장 적합하다는 것을 보여주었습니다. 종자 발달 시 주름진 것과 설탕 의존성 전사체의 양은 상대적으로 적지만, realtime PCR을 통해 서로 다른 발달 단계에서 종자 간의 발현 변화를 감지할 수 있었습니다. 이 방법은 이 표에서 설명한 것처럼 다른 기름 종자에도 적합합니다. 개발 후 이 기술은 식물 생물학 분야의 연구자들이 종자 및 과일과 같은 고농도의 저장된 매장량에서 유전자 발현 프로파일을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.