March 29th, 2018
이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.
이 절차의 전반적인 목표는 포함된 혈관 네트워크의 분석에 적합한 태반 융모 나무 조각의 3D 렌더링을 생성하는 것입니다. 이 방법은 왜 아이의 성장이 제한될 수 있는지, 어떤 스트레스와 얼마나 심한 스트레스가 조산으로 이어졌는지와 같은 우리 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 이제 투명한 태반 융모 나무에 면역 라벨을 부착한 다음 혈관 네트워크를 시각화하고 이러한 시각화를 사용하여 이러한 혈관 네트워크를 특성화하고 분석할 수
있다는 것입니다.이 기술의 의미는 대부분의 생명 과학이 2차원 조직학적 특성화에 의존하기 때문에 많은 진단 및 치료법으로 확장될 수 있습니다. 발레리 슈웽크(Valerie Schwenk)가 면역 표지 및 태반 조직 세척을 담당하고, 필립 네카이즈(Phillip Necaise)가 태반 조직 해부 및 조직 역세척 수술을 맡아 시연을 맡습니다. 융모 나무의 해부를 준비하려면 먼저 인산염 완충 식염수로 공식적이고 고정된 태반 조직을 헹굽니다.
그런 다음 해부 현미경의 무대에 있는 페트리 접시에 놓습니다. 융모나무를 찾으려면 메스와 가는 집게를 사용하여 태반 조직을 찢어냅니다. 그런 다음 약 5mm 길이의 융모 나무 조각을 해부하고 1ml의 인산염 완충 식염수가 들어 있는 마이크로튜브로 옮깁니다.
인산염 완충 식염수를 새 것으로 교체하고 가끔 소용돌이치면서 10분 동안 기다립니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수를 투과화 완충액으로 대체하여 조직을 투과화하고 2차 항체의 비특이적 결합을 차단합니다. 그런 다음 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 투과 완충액을 2% 염소 혈청을 함유한 인산염 완충 식염수로 마우스 단클론 항 CD31 및 토끼 항 CK7로 교체합니다. 조직을 밤새 섭씨 4도로 두십시오. 다음 날, 2%의 염소 혈청이 든 인산염 완충 식염수로 추가 세척하여 남아 있는 항체를 제거합니다.
그런 다음 2% 염소 혈청이 함유된 인산염 완충 식염수를 제거하고 녹색 형광단과 결합된 염소 항 마우스 면역 글로불린 G와 적외선 형광단과 결합된 염소 항 토끼 면역 글로불린 G를 보충한 동일한 완충액을 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS-GS로 조직을 한 번 세척하고 라벨이 붙은 조직을 투명해질 때까지 실온의 어두운 곳에 보관하십시오.
10분 간격으로 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 조직을 탈수시키려면 인산염 완충 식염수를 제거하고 조직에 50% 에탄올을 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 배양 후에는 폐기한 후 10분 간격으로 70% 에탄올로 3회 세척한 다음 15분 간격으로 100% 에탄올로 3회 세척합니다.
그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 1ml의 용액으로 채워진 마이크로튜브에 조직을 4시간 동안 옮깁니다. 4시간 후, 용액 2로 채워진 마이크로튜브에 조직을 옮기고 다시 4시간 동안 배양합니다. Sykes-Moore 챔버에 조직을 장착하려면 끝이 가는 집게를 사용하여 챔버 베이스에 25mm 원형 커버 슬립을 배치합니다.
다시 말하지만, 끝이 가는 집게를 사용하여 커버 슬립의 베이스에 고무 개스킷을 놓습니다. 용액 2에 잠긴 조직을 제거하고 커버 슬립 중앙에 놓습니다. 그런 다음 약 40마이크로리터의 용액 2 방울을 조직에 추가합니다.
그런 다음 두 번째 커버 슬립을 가져 와서 개스킷 위에 놓습니다. 그런 다음 베이스 상단에 잠금 링을 끼워 커버 슬립과 개스킷을 단단히 압축합니다. 그런 다음 개스킷을 통해 25 게이지 바늘을 베이스의 포트에 삽입합니다.
다음으로, 3 밀리리터 주사기에 1 포인트 5 밀리리터의 용액 2를 채 웁니다. 그런 다음 주사기에 25게이지 바늘을 장착하고 개스킷을 통해 반대쪽 포트에 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 챔버에 용액 2를 주입하기 시작하고 챔버 내부의 공기가 다른 25게이지 바늘을 통해 배출되는지 확인합니다.
챔버가 가득 차면 바늘과 주사기를 제거하고 Sykes-Moore 챔버 홀더를 컨포칼 현미경 스테이지에 놓습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 챔버에 배치된 조직의 초점을 맞춥니다. 다음으로, 스테이지에 대한 기준점을 설정하고 초점면을 통해 현미경 스테이지를 위아래로 이동하여 조직의 상단과 하단을 식별하고 설정합니다.
단계 크기를 2점 5마이크로미터로 설정하고 위에서 아래로 조직의 이미지 세트가 포함된 컨포칼 이미지 파일을 수집합니다. 그런 다음 100% 에탄올 부피의 20배 이상을 함유한 마이크로튜브로 조직을 옮겨 투명화를 역전시킵니다. 그런 다음 1시간 간격으로 70으로, 다음으로 50% 에탄올로 교체하고 마지막으로 인산염 완충 식염수로 교체합니다.
삽입될 때까지 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 보관하십시오. 여기에서는 태반 혈관 네트워크를 보여주기 위해 인간 태반의 현미경 및 공초점 현미경 이미지를 모두 획득했습니다. 태반의 이 현미경 이미지는 태반 실질(parenchyma)을 관통하여 방사하는 융모 나무를 보여줍니다.
이 현미경 이미지는 융모 클러스터에서 끝나는 융모 나무 조각의 원위 부분의 존재를 보여줍니다. 다음으로, 융모의 영양막층을 보여주기 위해, 융모나무의 원위 부분을 면역 표지했습니다. 이미지에서 바깥쪽 영양막층은 녹색으로 표시되고 모세혈관은 빨간색으로 표시됩니다.
그런 다음, 투명화 전후의 태반 조직을 확인하기 위해 투명하지 않은 태반 조직과 제거된 태반 조직의 컨포칼 이미지를 획득했습니다. 이미지는 투명하지 않은 조직의 경우 조직의 100마이크로미터 이하의 깊이에서 면역형광을 포착할 수 있음을 보여줍니다. 반대로, 투명해진 태반 조직의 경우 면역형광을 훨씬 더 높은 깊이에서 포착할 수 있습니다.
또한, 종래의 조직을 역전된 투명 절편과 비교하기 위해, 투명화된 조직을 에탄올과의 역공정으로 탈수시켰다. 투명화 전후에 anti CK7을 사용한 태반 조직의 면역조직화학적 염색은 투명화로 인한 조직 형태에 큰 변화가 없음을 보여줍니다. 애니메이션은 면역염색된 융모 조직이 조직 부피의 전체 깊이를 따라 분포되어 있음을 보여줍니다.
절차를 수행하는 데 익숙해지면 3일에 걸쳐 약 18시간이 소요될 것으로 예상할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 여러 가지 다른 기술 세트가 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 태반 병리학, 컨포칼 현미경 검사를 할 수 있어야 합니다.
이미징의 3D 렌더링을 생성할 수 있어야 하며 면역 처리 및 분석에 정통해야 합니다. 이 절차에 따라 기존 조직학, STS 페이지 또는 maldi와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 발전으로 이 기술은 모체 태아 의학, 신생아학 및 영양막 생물학 분야에서 전자간증, 태아 성장 불량 및 태아 고통의 근본 원인을 탐구하는 길을 열었습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 태반 융모 나무 조직을 투명화, 렌더링 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 비디오를 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 연구는 혈관 네트워크 분석에 적합한 태반 빌러스 나무 조각의 3D 렌더링을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아동 성장 제한 및 조기 출산과 관련된 주요 질문에 대응하는 것을 목표로 합니다.
This method enables detailed three-dimensional analysis of placental vascular networks, supporting mechanistic de-risking in maternal-fetal medicine by clarifying structural determinants of fetal growth restriction and preterm birth. It provides a disease-relevant system for evaluating vascular integrity under pathophysiological conditions such as diabetes, hypertension, and obesity. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking placental microstructure to clinical outcomes.
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of vascular targets, progresses to screening via standardized 3D vascular phenotyping, and supports translational research through preserved tissue integrity and biomarker-compatible labeling.