Name: 3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 태반 융모 조직의 면역표지 및 투명화를 통해 혈관 네트워크를 3차원 렌더링하고 분석하는 방법을. 이 기술은 자궁 내 성장 제한과 조산의 원인 규명에 활용됩니다.

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이 작품은 발달 장애 및 Placental 분석 LLC, 새로운 Rochelle, 뉴욕에 있는 뉴욕 주 사무실에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜 발달 장애 인간의 연구 윤리 위원회에서 기초 연구에 대 한 뉴욕 주 연구소의 지침을 따릅니다.
1. villous 트리 해 부
<ol><li>씻어 말린 고정 태 반 조직을 제거 하는 포 르 말린 고 페 트리 접시에 해 부 현미경의 스테이지에 buffed 인산 염 (PBS)14 . 메스와 미세 집게를 사용 하 여 태 반 조직을 떨어져 villous 나무 (흰 실 같은 분기 구조)를 찾으려고 애타게. 모 나무 (길이가 몇 mm)의 조각을 밖으로 dissect 그리고 조직 마이크로 튜브 포함 ~ 1 mL PBS에 전송.</li>
</ol>2. immunofluorescent 얼룩
<ol><li>피 펫, PBS를 제거 하 고 신선한 PBS를 바꿉니다. 가끔 소용돌이와 10 분 동안 서 보자. 한 번 더 반복 합니다. 참고:이 단계 및 모든 추가 단계 1 차적인 항 체 외피를 제외 하 고 실내 온도에서 수행 됩니다.</li>
	<li>제거 하 고 PBS 0.1 PBS 교체를 피 펫을 사용 하 여, 이차 항 체의 조직 및 블록 비 특정 바인딩 permeabilize 트리톤 X100% + 2% 염소 혈 청 (PBS-T-GS). 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>2% 염소 혈 청을 포함 하는 PBS PBS-T-GS 바꿉니다, 그리고 둘 다 단일 클로 널 안티-CK7 및 토끼 안티-CK7 마우스.<ol>
<li>4 ° c.에 하룻밤 조직을 품 어</li>
		<li>PBS-GS와 가끔 소용돌이와 10 분간 세척 하 여 남아 있는 항 체를 제거 합니다.</li>
		<li>PBS-GS를 제거 하 고 두 염소 반대로 마우스 IgG 녹색 발광 결합을 포함 하는 PBS GS 바꿉니다 (520 nm) fluorophore 그리고 염소-토끼 IgG는 적외선 방출 (652 nm) fluorophore.</li>
		<li>2.1 단계를 반복 하 여 항 체를 제거 합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 실 온에서 immunolabeled 조직을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 조직의 설명
<ol><li>10 분 간격 3 회 PBS와 함께 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>피 펫으로 PBS를 제거 하 고 50% 에탄올으로 대체 하 여 조직을 탈수 (메탄올 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라). 품 어 10 분에 대 한 신선한 50% 에탄올으로 대체 하 고 10 분 3 외피의 총에 대 한 이것을 한 번 더 반복 하는 동안 품 어. 70%와 외피를 반복 합니다. 그런 다음 100% 에탄올으로 대체 하 고 15 분 동안 품 어 (또는 메탄올 사용 될 수 있습니다).</li>
	<li>뾰족한 집게와 전송 조직 포함 하는 신선한 마이크로 튜브 ~ 4 h 1 mL 솔루션 1.</li>
	<li>뾰족한 집게와 신선한 마이크로 튜브 포함 솔루션-2에 대 한 조직의 전송 ~ 4 h. 참고: 어둠 속에 저장 하는 경우는 면역 형광은 실내 온도에 안정 6 개월 이상.</li>
	<li>지우고 잃은 것으로 어떤 수성 솔루션, (예: 설치 매체)와 혼용 하지 마십시오.</li>
</ol>4입니다. 장착입니다
<ol><li>부드럽고 쉽게 변형으로 조직 표준 유리 슬라이드와는 coverslip 간의 조직을 거치 하지 말라.</li>
	<li>그림 5B 를 참조 하십시오 및 다음과 같습니다; 사익스-무어 챔버에 조직 탑재<ol>
<li>뾰족한 집게 장소 25 m m 라운드 coverslip 챔버에 기본.</li>
		<li>뾰족한 집게는 coverslip에 베이스에 고무 가스 켓 장소.</li>
		<li>피 펫 드롭 (~ 40 µ L) 솔루션-2는 coverslip의 센터에 장소.</li>
		<li>뾰족한 집게 전송할 조각 조직 솔루션-2에서는 coverslip의 센터에 드롭.</li>
		<li>장소는 가스 켓 상단 두 번째 coverslip.</li>
		<li>회사까지 coverslips와 가스 켓을 압축 하는 베이스의 상단에 잠금 고리를 스레드. 참고: 조심-강화 또는 coverslip 깨지는 것 이다.</li>
		<li>기지에는 가스 켓을 통해 포트 22 게이지 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>3 mL 주사기와 함께 채우기 ~ 솔루션-2의 1.5 mL.</li>
		<li>주사기에 25 게이지 바늘을 탑재 합니다.</li>
		<li>반대 포트와 개 스를 통해 주사기 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>다른 25 게이지 바늘을 통해 약 실에 있는 공기 배기는 확인, 부드럽게 솔루션 2and 채우기 챔버를 주입.</li>
		<li>바늘과 주사기를 제거 하 고 confocal 현미경 무대에서 대형 유리 슬라이드에 챔버를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, PDMS 실리콘 시트에서 사용자 지정 웰 스 컷.<ol>
<li>가 위는 25.4 × 25.4 m m2 에서 조각을 PDMS 시트를 잘라.</li>
		<li>메스로 잘라 ~ 12.7 × 12.7 m m2 조각에서 잘.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 단단히 조각을 누릅니다.</li>
		<li>솔루션-2 상단에 잘 채워.</li>
		<li>마이크로 튜브의 조직 조각을 우물의 센터에 전송.</li>
		<li>뾰족한 집게 우물 위에 coverslip는 coverslip 하단 솔루션-2 유체는 그런 장소.</li>
		<li>Confocal 현미경 단계에 있는 조직으로 사익스 무어 챔버 어셈블리를 장착 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>10 배 목표와 초점으로 조직 챔버에 가져와.</li>
	<li>현미경 단계를 위아래로 조직 상하 간의 거리를 측정 하는 초점 비행기 이동 합니다.</li>
	<li>아래로 위에서 조직을 통해 이미지의 집합을 포함 하는 confocal 이미지 파일을 수집 하려면 2.5 µ m 단계에서 단계를 이동 합니다.</li>
</ol>6. 반전 청소
<ol><li>개간 조직 한 마이크로 튜브 포함 > 20 배 100% 에탄올의 볼륨을 전송 하 여 역방향. 1 h에서 간격은 70% 에탄올 50% 에탄올 및 PBS 바꿉니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 이제 단면화 및 조직학 표준 파라핀 포함, 조직 또는 면역 조직화 학적인 얼룩 처리 합니다.</li>
</ol>7입니다. deconvolution
참고: 다음 단계에 대 한 소프트웨어 명령, 탭 및 드롭 다운 메뉴는 이탤릭체.
<ol><li>Deconvolution 소프트웨어를 시작 하 고 이미지 파일을 엽니다.</li>
	<li>'Summary' 창에 나열 된 매개 변수를 입력 합니다.<ol>
<li>에 대 한 '간격 여 복 입력 x, y, 및 z 치수 µ m에.</li>
		<li>각 색 채널에 대 한 드롭 다운 메뉴에서 immunostaining에 대 한 사용 하는 형광 염료를 선택 합니다.</li>
		<li>에 '적임 ', Confocal 레이저 스캐닝 드롭-다운 메뉴에서 선택 합니다.</li>
		<li>에 '렌즈 ', 10 배 드롭-다운 메뉴에서 선택.</li>
		<li>에 '침수 매체 ', 드롭 다운 메뉴에서 선택 하는 공기.</li>
		<li>클릭은 '적용 ' 버튼.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'Deconvolution' 탭을 클릭 하십시오.</li>
	<li>클릭 '3D Deconvolution' 드롭-다운 메뉴에서.</li>
	<li>에 '3D-Deconvolution' 창 설정이 보험: 1) 적응형 PSF 블라인드, 2) 이론적 PSF, 3) 사용 (기본 적응형 PSF, 10 반복, 중간 잡음), 4) 기본 이름.</li>
	<li>클릭은 '녹색 체크 버튼 ' 프로그램을 시작.</li>
	<li>완료 되 면 단계를 프로그램을 다시 시작 7.3-7.6을 반복 합니다. 완료 되 면 제 3의 그리고 마지막으로 그것을 다시 시작.</li>
	<li>에 '데이터 관리자 ' 창 클릭 파일 앞에 "10-10-10-".</li>
	<li>클릭은 '파일 ' 탭을 누른 다음 '다른 이름으로 저장 '.</li>
	<li>선택 'sA 저장'창에서 '8 비트 부호 없는 정수 ' 에서 '데이터 형식 ' 드롭-다운 메뉴를 클릭 저장.</li>
</ol>8. 이미지 처리
<ol><li>피지 소프트웨어를 시작 합니다.<ol>
<li>클릭 '파일 ', 클릭 '오픈 ' 와 Deconvolved 이미지 파일을 선택 하 고 클릭는 '오픈 ' 버튼에 '오픈 ' 창.</li>
		<li>클릭 '이미지/색상/분할 채널 단 하나의 색을 포함 3 개의 새로운 파일로 변환 3 색 이미지 파일. Immunolabeled villous 모 세관 이미지 집합을 포함 하는 빨간 이미지 파일을 저장 합니다. 녹색 및 파랑 이미지 파일을 삭제 합니다.</li>
		<li>빼기와 붉은 이미지 파일에서 배경 형광: '과정/빼기 배경 '.</li>
		<li>드롭-다운 메뉴에서 10 픽셀 롤링 볼 반지름을 설정합니다.</li>
		<li>4 메뉴 옵션을 둡니다 누른 '확인 '.</li>
		<li>클릭 '예 프로세스 스택 메뉴에.</li>
		<li>열어 고유의 조직 형광 (autofluorescence)를 제거는 '이미지/조정/밝기-대비 ' 메뉴와 최소, 최대, 밝기 및 대비 설정을 조정. 수 모 세관 면역 형광 검사 중 하나를 제거 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
		<li>열어 없는 형광 남은 최소화는 '이미지/조정/임계값 ' 메뉴와 모 세관 면역 형광 강조 표시 된 슬라이더를 조정. 검사는 '어두운 배경 ' 상자와 클릭 '적용 '. 에 '변환 이진 드롭-다운 ' 메뉴 검사는 '블랙 배경 ' 상자와 클릭 '확인 '. 아래 분석에 대 한 흑인과 백인 (바이너리) 이미지 파일을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9입니다. 분석
<ol><li>개체를 계산 하 고 Skeletonization입니다.<ol>
<li>8.1.8 단계에서 생성 된 이진 이미지 파일을 선택 합니다.</li>
		<li>클릭 '분석/3D OC 옵션 ' 고 확인만 '볼륨 ' 와 '저장소 결과...' 상자에 드롭 다운 메뉴. 그는 '쇼 숫자' 확인란이 보험. 클릭은 '확인 ' 버튼.
</li>
		<li>Click에 '분석/3D 개체 카운터 '. 설정 드롭 다운 메뉴에서 '크기 필터: 분 ' 5000. 보장 하는 '가장자리에 개체 제외 상자 선택 하지 않으면. 확인 하는 '개체s통계 와 '요약 ' 상자 확인. 클릭은 '확인 ' 버튼. 참고:이 파일 크기 및 컴퓨터 구성에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
		<li>통계 표 및 개체 맵 파일을 저장 합니다.</li>
		<li>개체 맵 파일을 선택 합니다. 클릭 '플러그인/해골/Skeletonize 2D-3D' skeletonize 이진 파일에 있는 모 세관 네트워크를. 클릭 '파일/저장으로. 선택 'Tiff...' 드롭-다운 메뉴에서. TIFF 창에서 추가 "Skel-" 개체 맵 파일 이름 하 고 클릭는 '저장 ' 단추.
</li>
		<li>클릭 '분석/해골/분석 뼈대 2D-3D'. 드롭 다운 메뉴에서 기본 설정을 적용 하 고 클릭는 '확인 ' 버튼. 분기 '정보' 테이블을 저장은 '결과 테이블, 그리고 두 개의 출력 파일 (Skel 개체 표시-뼈대와 태그 골격).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

제도적 검토 보드 electively 종료 임신에서 포 르 말린 고정을 위한 placental villous 조직의 컬렉션을 승인 했다. 의료 기록의 짧은 검토 지적 모성 연령, 패리티, 및 기본 의료 (예:고혈압, 당뇨병, 루 푸 스) 또는 태아 (구조 또는 염색체 이상이의 부재를 확인 절차를 수행 하기 전에 비정상적인 성장) 수행 되었다. 데이터 시트 및 모든 수집 된 표본은 표시만 연구. 따라서, 모든 표본 운영 스위트를 출발 하기 전에 취소 확인 했다. Villi는 훈련 된 관찰자 (CMS);에 의해 수집 된 decidua chorionic 플레이트 제거 했다, 그리고 자유 부동 villous 덩어리만 수집 했다.
용 매 기반 기술로 조직 삭제 하는 경우 몇 가지 중요 한 고려 사항이 있다. 첫째, 조직 조직 100% 에탄올 (또는 메탄올)의 그라디언트를 통해 씻어 해야 합니다 그래서 취소, 충분히 건조 되어야 합니다. 에탄올을 사용 하 여, 그것은 "건조...

개발 태 반 및 그것의 병 리에 대 한 우리의 이해는, 큰 측정에서 제한 된 인접 villi 조직학 섹션에서 파생 된 포함 된 모세 혈관 사이의 공간 관계를 유추. 이 연구에서 우리 모 세관 네트워크 기능 (예: 분기, 견고)의 분석에 대 한 적합 한 인간의 태 반 모 세관 네트워크의 3 차원 (3D) 렌더링을 생성 하는 수단을 개발 하 여이 문제를 해결 했습니다. 이렇게 하려면 우리는 두 상업 조직 청소 제품, Visikol-1 및 Visikol-2 (이라고 솔루션 1과 솔루션 2) immunofluorescent 얼룩 결합.
인간의 태 반 어머니의 intervillous 혈액 및 태아를 개발 사이의 인터페이스에 위치한 혈관의 광대 한 복합물 이다. 탯 chorionic 접시에 그것의 삽입에서 밖으로 확장, 동맥과 정 맥 ramify 정교한 혈관 네트워크 chorionic 표면을 커버 하는 네트워크로 분기 한다. 그들의 끝 다음 내부 또는 placental 디스크 그들은 몇 가지 더 분기 세대를 받아야 하 고 터미널 villi 및 그들의 포함 된 모 세관 네트워크, 가스, 영양소, 교류의 사이트에서 끝의 깊이에 아래로 침투 및 대사 태아와 모성 혈액 사이 낭비.
개발 하는 동안 태 반 모 세관 네트워크에 모욕 태아, 신생아 유아 및 응급 성인 1,2,3의 건강에 대 한 지속적인 결과 했습니다. 유산, 자궁내 성장 금지 등 임신 관련 pathologies에 비추어 사전 eclampsia 및 모성 당뇨병 4,,56 은 높은 가치 측정 방법 개발에 배치 하 고 placental villous 모 세관 네트워크 특성 주요 장애물은 태 반 혈관 네트워크 규모의 광범위 한 범위를 포함. 표면 혈관 네트워크는 직경에서 4-5 m m로 대단할 수 있다. 터미널 villous 모세 혈관 지름; 10-20 µ m의 순서는 태 반 혈관 7의 300 킬로미터 이상 포함 되어 있습니다. 현재, 선박 규모의 이러한 극단을 캡처할 수 있는 몇 가지 편리 하 고 빠른 기술이 있다. 날짜 하려면, villi 수가 적은 현미경으로 렌더링할 수 있습니다. 예를 들어 Jirkovska 외 에 초점을 맞춘 태 반 모에 용어, confocal 현미경 검사 법을 직렬 광학 섹션 120 µ m 두께 섹션;에서 얻은 1 µ m 간격 결합 공부 하는 샘플도 통계의 수에 데이터 8을 제공 했다. 모 세관 구조 확인 되었다 그리고 villi과 모세 혈관의 윤곽 내보낸 이미지 분석에 대 한 경시와 손으로 그린 했다. 저자, "성장 villous 혈관 네트워크"에 대 한 그들의 발견의 의미를 논의 하는 동안 같은 결론만 "용어" (36 + 주 임신 나이) 조직 공부 때 문제가 있습니다. 마찬가지로, 마요네즈 동부 표준시는l.과 피어스 외. 혈액 흐름과 산소 전송의 그들의 시뮬레이션에 대 한 같은 나이의 조직에 의존 하지만 그들의 분석만 몇 가지 용어, 터미널 villi 9,10 로 제한 되었다 . Stereology는 또한 villous 혈관의 구조 연구에 적용 되었다. 하지만 다시, 포커스는 일반적으로 하나 이상의 임신 합병증 11,12liveborn 유아를 제공 하는 이후 임신에.
최근까지, confocal 현미경 검사 법에 국한 되었다 조직 100-200 µ m의 깊이에 영상 여기의 흡수 및 형광의 방출 overlying 조직 13 . 삭제 하는 조직과 3D 조직학 널리 설명 되었습니다 문학에는 비록 많은 삭제 하는 조직에 대 한 수많은 방법을 적합 하지 않습니다 조직 사용 일반적으로, 그들은 돌이킬 수 없는 hyperhydration 통해 세포 형태학을 손상 단백질 또는 지질 제거. 따라서, 이러한 결과 조직 자체와 우리의 조직 삭제 과정은 가역 기술은 전통적인 조직학에 대 한 유효성을 검사할 수 있는 반면 처리 하지 유물을 나타내는 확인 수는 없습니다. 조직 개간은 일반적으로 세 가지 주요 방법의 한을 포함 한다: 1) 균일 한 일치 하는 조직 구성의 굴절률 (RI)의 연속으로 렌즈에서 발생 하는 누적 빛 산란을 제거 하는 RI 일치 솔루션, 침수 낮은 리 (cytosol) 및 높은 RI (단백질/지질) 성분을;의 변동 2) 하이드로 겔에 포함 및 지질 구성 요소; 제거 하 전기 이동 법/보급을 활용 하 여 지질 구성 요소 제거 3) 확장/변성 단백질 구조를 리 13의 균일성을 장려의 증가 침투를 허용. 이러한 이미지는 조직의 속성을 나타내는 경우 결정 하는 도전으로 이러한 3D 표현은 의심 임상 가치는 이러한 접근 수 조직 투명 렌더링 biomarkers의 3D 표현에 대 한 생성 될 수 있지만 또는 조직의 프로세스를 삭제. 다른 한편으로, 우리의 조직 삭제 가역 이므로 표준 조직학 및 immunohistochemistry 변경은 임상적으로 중요 한 여부를 평가 같은 조직에 적용할 수 있습니다.
이 연구는 9 월 23 일 완료 된 주 임신 및 두 개의 전체 기간 정상 배달 사이 23 임상 정상적이 고 electively 종료 임신의 총에서 얻은 47 원심 villous 샘플의 분석을 선물 한다. 면역 형광 라벨 trophoblast 및 endothelia의 변화 villous 혈관 네트워크 그리고 그들의 복잡성의 양적 및 자동화 된 분석 수 있었습니다.
이 프로토콜, 우리는 절연 하 고 터미널 villi 이전 규모 불가능 그들의 모 세관 네트워크 분석. 임신 villous 및 모 세관 네트워크 개발에 적용 하는 경우이 방법을 건강 한 아이의 탄생에 대 한 기초는 그 속성을 식별 합니다. 복잡 한 임신의 연구에 적용 될 때 또한 때 placental pathologies villous 나무와 그들은 칼 집, 모 세관 네트워크를 수정 하는 방법 및 이러한 태아 복지에 충돌 하는 방법을 명확히 것입니다.

<table><tbody><tr><td>수성 인산염 완충액에 10% 포름알데히드 용액(w/v)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H-121-08</td><td>일반 고정제, 즉시 사용 공식, 증기는 독성이 있으므로 주의하십시오</td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-916-5B No. 11</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>78354-119</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브(1.7mL)</td><td>PGC Scientifics</td><td>505-201</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>피펫</td><td>VWR</td><td>52947-948</td><td>일회용, 3ml 전사 피펫</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Boehriner Mannheim</td><td>789 704</td><td>재고에서 0.1%로 희석</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>희석 PBS 용액에서 2%</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항-ck7 케라틴 7 Ab-2 (클론 OV-TL 12/30)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MS-1352-RQ</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티-CD31 항체</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>녹색 방출 (520 nm) 플루오로크롬&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Alexa-Fluor 488</td></tr><tr><td>적외선 발광(652nm) 형광색소</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Alexa Fluor 633</td></tr><tr><td>에탄올 알코올 200 proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>필요에 따라 PBS를 사용하여 더 낮은 농도로 희석</td></tr>합니다<tr>.<td>Solution-1</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-1</td></tr><tr><td>Solution-2</td><td>Visikol Inc. (주) 비시콜</td><td></td><td>Visikol Histo-2</td></tr><tr><td>Skyes-Moore 챔버</td><td>BellCo Glass Inc.</td><td>P/N 1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>25 게이지 바늘</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>BD Precision Glide Needes</td></tr><tr><td>3 mL 주사기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-40</td><td>BD 일회용 주사기</td></tr><tr><td>PDMS 실리콘 시트</td><td>McMaster-Carr</td><td>P/N 578T31</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon Inc.</td><td></td><td>Nikon C1 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>디콘볼루션 소프트웨어</td><td>미디어 사이버네틱스</td><td></td><td>AutoQuant X22</td></tr><tr><td>피지 이미지 처리 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>무료, 오픈 소스&nbsp; https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801570</td><td>SelecTech H&의 Component 1에서 사용 가능한 소프트웨어; E 염색 시스템</td></tr><tr><td>알콜성 Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801615</td><td>SelecTech H&의 구성 요소 2; E 염색 시스템</td></tr><tr><td>블루 버퍼</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802918</td><td>SelecTech H&의 구성 요소 3; E 염색 시스템</td></tr><tr><td>Aqua Define MCX</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803598</td><td>SelecTech H&의 Component 4; E 염색 시스템</td></tr><tr><td>면역조직화학 검출 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TL-125-QHD</td><td>UltraVision Quanto 검출 시스템 HRP DAB</td></tr></tbody></table>

3 차원 렌더링 및 immunolabeled, 분석 인간 placental villous 혈관 네트워크를 명확히

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

영양소와 가스 교환 어머니와 태아 사이 모성 intervillous 혈액 및 많은 인간의 태 반의 실질을 구성 하는 광대 한 villous 모 세관 네트워크의 인터페이스에서 발생 합니다. 원심 villous 모 세관 네트워크는 탯 줄에서 밖으로 확장 하는 혈관의 분기의 여러 세대 후 태아 혈액 공급의 종착역입니다. 이 네트워크에 인접 한 세포 칼 syncytial trophoblast 배리어 층 태아 혈액의 혼합 방지와 모성 혈액에 그것은 지속적으로 목욕을. 장애 산 모 당뇨병, 고혈압, 비만, 등에서 발생 하는 placental 모 세관 네트워크의 무결성에 모욕 그 현재의 심각한 건강 위험 태아, 유아, 및 성인에 대 한 결과 했습니다. 이러한 모욕의 구조적 효과 더 잘 정의 하는 프로토콜 순서를 1-2 m m3 점에서 하나 완전 복잡에 토폴로지 기능을 조사할 수 있다 모 세관 네트워크 구조를이 연구에 대 한 개발 되었다. 이 위해 클러스터 터미널 villi의 태는 해 부, 그리고 trophoblast 레이어 및 모 세관 endothelia immunolabeled. 이 샘플은 다음 공초점 이미지 스택을 ~ 1 m m의 z 깊이를 취득 하는 가능 하 게 하는 프로세스를 삭제 새로운 조직으로 명백 하 게. 이러한 스택 3 차원 렌더링 후 처리 및 분석을 위한이 방법의 적합성의 유효성 검사로 볼륨, 모 세관, 지점과 모 세관 분기 엔드 포인트의 수와 같은 기본 모 세관 네트워크 측정을 생성 하 모 세관 네트워크의 특성화

클러스터 용어 배달 8 주 임신 나이에서 인간 태 반에 터미널 villi의 모세 혈관의 생성 된 3 차원 렌더링 개별 클러스터로 간주 되었고 skeletonized 네트워크 분석에 대 한. 태 반 (그림 1A)의 기능 단위는 어디 그들은 태 실질 (그림 1B, 그리고에서 확대 1 C) 침투 하는 표면 혈관의 확장 모 나무입니다. 해 부 트리 (Figure1D 및 1E)의 원심 부분 조각 했다 다음 모 trophoblast 레이어와 모세 혈관 (그림 2)를 표시 하는 immunolabeled. 3D 렌더링에 대 한 중요 한 조직 비운의이 시스템을 사용 하는 기능이 ...

이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

이 절차의 전반적인 목표는 포함된 혈관 네트워크의 분석에 적합한 태반 융모 나무 조각의 3D 렌더링을 생성하는 것입니다. 이 방법은 왜 아이의 성장이 제한될 수 있는지, 어떤 스트레스와 얼마나 심한 스트레스가 조산으로 이어졌는지와 같은 우리 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 이제 투명한 태반 융모 나무에 면역 라벨을 부착한 다음 혈관 네트워크를 시각화하고 이러한 시각화를 사용하여 이러한 혈관 네트워크를 특성화하고 분석할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 대부분의 생명 과학이 2차원 조직학적 특성화에 의존하기 때문에 많은 진단 및 치료법으로 확장될 수 있습니다. 발레리 슈웽크(Valerie Schwenk)가 면역 표지 및 태반 조직 세척을 담당하고, 필립 네카이즈(Phillip Necaise)가 태반 조직 해부 및 조직 역세척 수술을 맡아 시연을 맡습니다. 융모 나무의 해부를 준비하려면 먼저 인산염 완충 식염수로 공식적이고 고정된 태반 조직을 헹굽니다.그런 다음 해부 현미경의 무대에 있는 페트리 접시에 놓습니다. 융모나무를 찾으려면 메스와 가는 집게를 사용하여 태반 조직을 찢어냅니다. 그런 다음 약 5mm 길이의 융모 나무 조각을 해부하고 1ml의 인산염 완충 식염수가 들어 있는 마이크로튜브로 옮깁니다.인산염 완충 식염수를 새 것으로 교체하고 가끔 소용돌이치면서 10분 동안 기다립니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수를 투과화 완충액으로 대체하여 조직을 투과화하고 2차 항체의 비특이적 결합을 차단합니다. 그런 다음 30분 동안 배양합니다.그런 다음 투과 완충액을 2% 염소 혈청을 함유한 인산염 완충 식염수로 마우스 단클론 항 CD31 및 토끼 항 CK7로 교체합니다. 조직을 밤새 섭씨 4도로 두십시오. 다음 날, 2%의 염소 혈청이 든 인산염 완충 식염수로 추가 세척하여 남아 있는 항체를 제거합니다.그런 다음 2% 염소 혈청이 함유된 인산염 완충 식염수를 제거하고 녹색 형광단과 결합된 염소 항 마우스 면역 글로불린 G와 적외선 형광단과 결합된 염소 항 토끼 면역 글로불린 G를 보충한 동일한 완충액을 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS-GS로 조직을 한 번 세척하고 라벨이 붙은 조직을 투명해질 때까지 실온의 어두운 곳에 보관하십시오.10분 간격으로 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 조직을 탈수시키려면 인산염 완충 식염수를 제거하고 조직에 50% 에탄올을 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 배양 후에는 폐기한 후 10분 간격으로 70% 에탄올로 3회 세척한 다음 15분 간격으로 100% 에탄올로 3회 세척합니다.그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 1ml의 용액으로 채워진 마이크로튜브에 조직을 4시간 동안 옮깁니다. 4시간 후, 용액 2로 채워진 마이크로튜브에 조직을 옮기고 다시 4시간 동안 배양합니다. Sykes-Moore 챔버에 조직을 장착하려면 끝이 가는 집게를 사용하여 챔버 베이스에 25mm 원형 커버 슬립을 배치합니다.다시 말하지만, 끝이 가는 집게를 사용하여 커버 슬립의 베이스에 고무 개스킷을 놓습니다. 용액 2에 잠긴 조직을 제거하고 커버 슬립 중앙에 놓습니다. 그런 다음 약 40마이크로리터의 용액 2 방울을 조직에 추가합니다.그런 다음 두 번째 커버 슬립을 가져 와서 개스킷 위에 놓습니다. 그런 다음 베이스 상단에 잠금 링을 끼워 커버 슬립과 개스킷을 단단히 압축합니다. 그런 다음 개스킷을 통해 25 게이지 바늘을 베이스의 포트에 삽입합니다.다음으로, 3 밀리리터 주사기에 1 포인트 5 밀리리터의 용액 2를 채 웁니다. 그런 다음 주사기에 25게이지 바늘을 장착하고 개스킷을 통해 반대쪽 포트에 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 챔버에 용액 2를 주입하기 시작하고 챔버 내부의 공기가 다른 25게이지 바늘을 통해 배출되는지 확인합니다.챔버가 가득 차면 바늘과 주사기를 제거하고 Sykes-Moore 챔버 홀더를 컨포칼 현미경 스테이지에 놓습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 챔버에 배치된 조직의 초점을 맞춥니다. 다음으로, 스테이지에 대한 기준점을 설정하고 초점면을 통해 현미경 스테이지를 위아래로 이동하여 조직의 상단과 하단을 식별하고 설정합니다.단계 크기를 2점 5마이크로미터로 설정하고 위에서 아래로 조직의 이미지 세트가 포함된 컨포칼 이미지 파일을 수집합니다. 그런 다음 100% 에탄올 부피의 20배 이상을 함유한 마이크로튜브로 조직을 옮겨 투명화를 역전시킵니다. 그런 다음 1시간 간격으로 70으로, 다음으로 50% 에탄올로 교체하고 마지막으로 인산염 완충 식염수로 교체합니다.삽입될 때까지 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 보관하십시오. 여기에서는 태반 혈관 네트워크를 보여주기 위해 인간 태반의 현미경 및 공초점 현미경 이미지를 모두 획득했습니다. 태반의 이 현미경 이미지는 태반 실질(parenchyma)을 관통하여 방사하는 융모 나무를 보여줍니다.이 현미경 이미지는 융모 클러스터에서 끝나는 융모 나무 조각의 원위 부분의 존재를 보여줍니다. 다음으로, 융모의 영양막층을 보여주기 위해, 융모나무의 원위 부분을 면역 표지했습니다. 이미지에서 바깥쪽 영양막층은 녹색으로 표시되고 모세혈관은 빨간색으로 표시됩니다.그런 다음, 투명화 전후의 태반 조직을 확인하기 위해 투명하지 않은 태반 조직과 제거된 태반 조직의 컨포칼 이미지를 획득했습니다. 이미지는 투명하지 않은 조직의 경우 조직의 100마이크로미터 이하의 깊이에서 면역형광을 포착할 수 있음을 보여줍니다. 반대로, 투명해진 태반 조직의 경우 면역형광을 훨씬 더 높은 깊이에서 포착할 수 있습니다.또한, 종래의 조직을 역전된 투명 절편과 비교하기 위해, 투명화된 조직을 에탄올과의 역공정으로 탈수시켰다. 투명화 전후에 anti CK7을 사용한 태반 조직의 면역조직화학적 염색은 투명화로 인한 조직 형태에 큰 변화가 없음을 보여줍니다. 애니메이션은 면역염색된 융모 조직이 조직 부피의 전체 깊이를 따라 분포되어 있음을 보여줍니다.절차를 수행하는 데 익숙해지면 3일에 걸쳐 약 18시간이 소요될 것으로 예상할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 여러 가지 다른 기술 세트가 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 태반 병리학, 컨포칼 현미경 검사를 할 수 있어야 합니다.이미징의 3D 렌더링을 생성할 수 있어야 하며 면역 처리 및 분석에 정통해야 합니다. 이 절차에 따라 기존 조직학, STS 페이지 또는 maldi와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 발전으로 이 기술은 모체 태아 의학, 신생아학 및 영양막 생물학 분야에서 전자간증, 태아 성장 불량 및 태아 고통의 근본 원인을 탐구하는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 태반 융모 나무 조직을 투명화, 렌더링 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 비디오를 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

다음은 일정한 흐름 조건에서 태반 외식을 배양하기 위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동적 생리학적 환경의 복제를 가능하게 하여 기존의 정적 융모 배양 시스템을 향상시킵니다.

Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

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Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

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표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

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3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

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