세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

이 절차의 전반적인 목표는 멤브레인 단백질 또는 다른 단백질 간의 세제에 민감한 상호 작용을 감지하는 것입니다. 이 절차는 하나의 단백질이 히스티딘 태그가 붙어 세포에서 과발현되어야 하는 반면, 다른 단백질은 myc 태그가 붙은 펩타이드여야 합니다. 이 방법은 생화학 중요한 단백질 상호 작용 연구 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 세제에 민감한 방식으로 멤브레인 단백질 간의 상호 작용을 감지할 수 있다는 것입니다. 절차는 빠르고 쉽습니다. 이 방법은 막 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 약한 단백질 상호 작용을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

우리는 막 단백질인 Saltilin과 GLUT4 사이의 상호 작용을 확인하고 싶었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었지만 포유류 용해에서 이들을 공동 면역침전시키려는 시도는 여전히 성공하지 못했습니다. 펩타이드를 주문하려면 상호 작용에 중요한 펩타이드의 타겟 염기서열을 선택하고 염기서열의 끝 또는 C 말단에 myc 에피토프를 추가합니다. 일단 펩티드가 도착하면, 매우 순수한 물에 있는 펩티드의 작동 해결책의 밀리리터 당 pepare 100 마이크로그램

3개의 3T3-L1 사전 지방 세포 세포를 4개의 10cm 배양 접시에 파종하고 인큐베이터에 보관합니다. 다음으로, 6X histodyn으로 태그된 타겟 단백질로 두 개의 배양 접시를 transfection하고 두 개의 대조군 플라스미드로 표시된 다른 두 개의 접시에서 HISP로 표시하고 WT로 표시합니다. transfection 후 세포를 80-90% 농도에 도달할 때까지 48시간 동안 인큐베이터에 그대로 둡니다. 세포 용해물을 준비하려면 섭씨 4도로 냉각된 1X 완충 식염수 10ml로 얼음에서 세포를 세 번 세척합니다.

그런 다음 각각에 500마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 세포를 분리하여 용해물을 준비합니다. 각 배양 접시에서 준비된 세포 용해물을 4개의 개별 1.5mm 튜브로 옮기고 모든 튜브에 라벨을 붙입니다.

그런 다음 26게이지 바늘이 있는 주사기를 통해 세포 용해물을 위아래로 5회 통과시켜 전체 세포 용해를 수행합니다. 그런 다음 세포 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 16000xg로 원심분리합니다. 상등액을 동일하게 라벨링된 4개의 새 튜브로 옮깁니다.

향후 문제 해결 및 제어 실험을 위해 20마이크로리터의 세포 용해물을 분취하고 섭씨 20도에서 보관합니다. 나중에 사용할 수 있도록 PH8에서 염산으로 세척 버퍼를 역가하여 PH6를 얻고 버퍼를 섭씨 4도에서 보관합니다. 다음으로, 코발트 비드의 균일 한 현탁액을 준비하려면 병을 조심스럽게 소용돌이칩니다.

그런 다음 40마이크로리터의 코발트 비드 현탁액을 개별적으로 표시된 4개의 튜브 모두에 옮깁니다. 코발트 비드를 첨가한 후 튜브에 1ml의 용해 완충액을 추가합니다. 그런 다음 1000xg에서 5초 동안 튜브를 원심분리합니다.

상등액과 피펫 40마이크로리터의 용해 완충액을 침전된 비드에 버립니다. 그런 다음 세포 용해물을 해당 튜브로 옮기고 튜브 회전체에서 섭씨 4도에서 90분 동안 배양합니다. 90분 후 1000xg에서 5초 동안 샘플을 원심분리합니다.

그런 다음 Flowthrough-1이라고 표시된 상등액을 수집하여 섭씨 20도에서 보관합니다. 다음으로, PH8이 포함된 세척 버퍼 500마이크로리터를 개별 튜브에 추가하고 비드를 부드럽게 다시 매달립니다. 튜브를 1000xg에서 5초 동안 원심분리하고 상층액을 배출합니다.

그런 다음 라벨에 따라 튜브에 PH8 또는 6이 있는 세척 버퍼를 추가하고 비드를 잘 다시 매달립니다. 튜브를 1000xg에서 5초 동안 원심분리하고 상층액을 배출합니다. 펩타이드와 물 완충액의 밀리리터당 1마이크로그램을 PH6 또는 8로 준비합니다.

그런 다음 100 마이크로 리터의 펩타이드 용액을 유사한 PH에 해당하는 세척 된 비드에 첨가하십시오. 그런 다음 튜브 로테이터에서 섭씨 4도의 비드를 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 4개의 마이크로 컬럼을 가져와서 라벨을 붙이고 Flowthrough-2라고 표시된 수집 튜브에 컬럼을 넣습니다. 배양이 끝난 후 배양 혼합물을 컬럼에 추가합니다.

용액이 중력에 의해 통과하도록 하고 흐름에서 샘플을 수집합니다. 컬럼을 새 수집 튜브에 넣고 섭씨 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 개별 컬럼을 통해 중력 흐름에 의해 PH6 또는 8로 500마이크로리터의 세척 버퍼를 통과시키고 흐름을 버립니다.

이 단계를 네 번 반복합니다. 튜브를 1000xg에서 5초 동안 원심분리합니다. Elution이라고 표시된 새 수집 튜브에 컬럼을 놓습니다.

결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 모든 튜브의 비드를 매우 신중하고 동등하게 세척하는 것이 중요합니다. 세척된 비드에 베타 메르캅토에탄올이 함유된 트리신 샘플 버퍼 40마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 20분 동안 그대로 두십시오.

8000xg에서 2분 동안 컬럼을 원심분리합니다. 컬럼을 버리고 수집 튜브를 섭씨 100도에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 1000xg에서 5초 동안 원심분리합니다.

또는 세척된 비드에 40마이크로리터의 Elution Imidazole 완충액을 추가하고 온화한 실에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝난 후 튜브를 8000xg에서 2분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 버리고 40마이크로리터의 트리신 샘플을 추가합니다.

수집 튜브를 섭씨 100도에서 10분 동안 가열한 다음 1000xg에서 5초 동안 원심분리합니다. 시중에서 판매되는 10-20%tricine gradient gel을 사용하십시오. Tris/Tricine/SDS 러닝 버퍼를 사용한 다음 용출된 샘플과 총 용해물을 각각 20마이크로리터씩 겔에 로드하고 전기영동 장치 실행을 시작합니다.

전기영동이 끝나면 20%메탄올이 보충된 전사 완충액을 사용하여 겔의 물질을 0.45마이크로미터 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달합니다. 멤브레인을 막은 후 수평으로 자릅니다. 다음으로, anti myc로 막의 아래쪽 절반에 Anti His P 항체가 있는 막의 상부를 조사합니다.

GLUT4에서 코발트 비드에 대한 고정화된 Sortilin 간의 상호 작용을 연구하기 위해 면역블롯 분석을 수행했습니다. 세포 용해물 및 용리액을 야생형 및 Sortilin-myc/His-tagged 형질주입된 3T3-L1 세포를 얻은 다음 SDS 페이지에 로드했습니다. 오점은 anti-myc 항체로 조사되었다.

블롯은 형질주입된 용리암에서 110킬로도틴 Sortili-myc/His-tagged 및 5킬로틴 myc-first luminal loop-GLUT4를 보여줍니다. 다음으로, PH의 중요성과 코발트 비드에 고정된 Sortilin과 GLUT4 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 면역블롯 분석을 수행했습니다. 이 분석에서, Myc-first luminal loop GLUT4는 PH6 및 8 모두에서 Sortilin-myc/His-tagged 단백질로 고정화된 비드와 함께 배양되었습니다.

이 블롯은 Sortilin-myc/His-태그가 지정된 형질주입된 3T3-L1 세포에서 얻은 용출액에서 PH6 및 8 모두에서 Sortilin-myc/His와 myc-first luminal loop GLUT4 사이의 명확한 상호 작용을 보여줍니다. 이 기술을 완전히 익히면 샘플이 서양의 혈액 분석을 위해 준비될 때까지 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가급적이면 물에 용해되는 펩타이드를 설계하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

결과를 강화하기 위해 교차결합 후 면역침전과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세제에 민감한 절차에서 멤브레인 단백질, 단백질 상호 작용을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 단백질 단편 간의 상호 작용을 탐색할 수 있습니다.

부드러운 리듬 재즈.