Name: 세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 세제에 민감한 막 단백질 상호 작용 탐지 방법을. 히스티딘 및 myc 태깅 기술을 활용하여 sortilin과 GLUT4의 결합을 분석하고, 생화학적 맥락에서 단백질 상호 작용을 연구하는 효율적인 프로토콜을 제공합니다.

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이 작품은 DK52057 및 K.V.K. X.P에 NIH에서 DK107498는 NIH에서 제도적 교육 부여 2T32DK007201에 의해 지원 되었다 연구 보조금에 의해 지원 되었다.

1. 펩 티 드의 처리
<ol><li>디자인 및 펩 티 드 순서<ol>
<li>펩 티 드, 원하는 시퀀스 선택한 myc 피토 프 (EQKLISEED)에서 그 중 N-또는 C-말단 같은 태그를 추가 합니다.</li>
		<li>펩 티 드 가용성 계산기 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php를 사용 하 여 물에 펩 티 드의 예측된 가용성을 확인 합니다. 용 해도 낮은 경우 충전 균형을 변경 하려면 다른 수용 성 태그를 추가 하십시오. 참고: 우리는 N 종점 (Myc-fll-GLUT4)에 펩 티 드에 해당 하는 첫 번째 luminal 루프 (fll) GLUT4 myc epitope (굵은 글꼴)와 태그의 사용: EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA 물에 있는 "좋은" 예측된 가용성을 .</li>
		<li>75% 이상으로 주문 펩 티 드 순서 순도 분석 결과 대 한 충분 한 이며 가용성 테스트에 대 한 공급자를 요청. 펩 티 드를 녹이는 뜻하지 않은 문제가 있을 때 두 개 이상의 aliquots에 순서를 구분 합니다. 참고: Myc fll GLUT4 두 aliquots에 명령 했다. 초순에 보고 된 그것의 가용성은 ≤ 10 mg/mL 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>펩 티 드를 녹이는 참고: 초순 최고의 용 매는. 펩 티 드 수용 성 수 나타나지 않을 경우 자세한 내용은 http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html를 참조 하십시오.<ol>
<li>초순에 또는 버퍼의 선택, 100 μ g/mL의 농도에서 펩 티 드의 작업 솔루션 x 100을 준비 합니다.</li>
		<li>50-100 µ L aliquots로 솔루션을 분리 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 셀의 처리
<ol><li>세포 배양<ol>
<li>야생 타입 (WT) 세포를 사용 하 여 부정적인 제어 및 태그 6 히스티딘 (HisP)와 대상 단백질을 표현 하는 세포로. 참고: 우리는 3T3 L1 사전 adipocytes 안정적으로 Sortilin-myc를 / 그의5페를 사용 합니다.</li>
		<li>Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 높은 설탕, 보충 10% 송아지 소 혈 청, 세포 성장 글루타민 (2mm)과 페니실린/스 (5 μ g/mL) 10% CO2에서 37 ° C에서.</li>
		<li>셀의 4 개의 10cm 요리, HisP와 그들의 두 transfect 앉아서 transfect 제어 플라스 미드 (WT)와 다른 두. transfection 후 48 h, 셀 80-90 %confluency 도달 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 Lysates의 준비<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% 글리세롤, 10mm 이미, 0.5% 트라이 톤 X-100 및 프로 테아 제 억제제 태그 그의 단백질, pH 7.4의 격리에 대 한 EDTA 없이 칵테일)를 준비 하 고 4 계속 ° c:</li>
		<li>세 번 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 4 ° c.에서 x 1의 10 mL와 함께 세포를 씻어</li>
		<li>얼음에 접시를 넣고 각 접시 500 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 세포 lysates 수확.</li>
		<li>장소 세포 lysate 각 접시에서 다른 1.5 mL 튜브에. WT-pH6, WT pH8, HisP pH6, HisP pH8 튜브 라벨.</li>
		<li>통과 세포 lysates 주사기 26 G 바늘 5 배 아래로, 완전 한 세포를.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 16000 x g에서 세포 lysates 원심</li>
		<li>새로운 동일 하 게 레이블이 지정 된 튜브는 supernatants 전송.</li>
		<li>BCA 단백질 분석 실험 키트 또는 다른 키트를 사용 하 여 단백질 농도 분석 합니다.</li>
		<li>세포의 용 해 버퍼 사용 하 여, 모든 4 개의 lysates의 단백질 농도 맞춰야.</li>
		<li>각 lysate의 작은 (ca. 20 µ L) 약 수 고 가능한 제어 실험 및 문제 해결-20 ° C에서 그것을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HisPur 코발트 구슬에 그의 태그 단백질 바인딩
<ol><li>상업적으로 이용 가능한 워시 버퍼를 사용 하 여 또는 하나 (50 m m 나2HPO4/NaH2포4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미, pH 8)을 준비 하 고 4 ° c.에 그것을 유지합니다</li>
	<li>씻어 준비 버퍼 ph 6 tittering 워시 버퍼 pH 8에 의해 HCl.와 그것은 4 ° c.에</li>
	<li>부드럽게 동종 정지 있도록 코발트 구슬의 병을 소용돌이 친다.</li>
	<li>4 개의 1.5 mL 튜브 위에서 표시 (단계 2.2.4) 코발트 구슬 서 스 펜 션의 40 µ L을 분배.</li>
	<li>각 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 5 s. Aspirate는 상쾌한에 대 한 1000 x g에서 튜브를 원심 침전된 구슬에 40 μ의 세포의 용 해 버퍼를 추가.</li>
	<li>해당 튜브에 세포 lysates를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브 회전 20 rpm에 4 ° C에서 90 분 동안 튜브를 품 어.</li>
	<li>1000에 튜브를 원심 5 s를 수집은 상쾌한 g x. 4 ° c.에는 상쾌한을 유지</li>
	<li>해당 관에 pH 8 또는 pH 6 워시 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 다시 부드럽게 구슬 일시 중단.</li>
	<li>1000 x g 5 s 및 폐기에 튜브 원심은 supernatants.</li>
	<li>4 시간 동안 3.9-3.10 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 구슬에 움직일 그의 태그 단백질을 펩 티 드의 바인딩
<ol><li>펩 티 드 (1.2.1 단계)의 100 배 작업 솔루션을 사용 하 여 준비 작업 솔루션 pH 6 또는 pH 8 워시 버퍼 (각 2 개의 100 µ L aliquots, 1 µ g/mL) x 1.</li>
	<li>해당 ph 씻어 구슬에 1 x 펩 티 드 솔루션의 100 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>20 rpm에서 튜브 회전에 4 ° C에서 30 분 동안 구슬을 품 어.</li>
	<li>1000 x g 5에서 튜브 원심 s는 상쾌한 수집 및-20 ° c.에 그것을 유지</li>
	<li>4 시간 동안 3.9-3.10 단계를 반복 합니다. 참고: 가능한 배경 감소, 다음 단계는 4.4 ~ 4.5 단계 대체할 수 있다.</li>
	<li>4 마이크로 열 30 μ m 모 공, 단계 2.2.4에서 그들을 라벨 고 열 수집 튜브에 배치.</li>
	<li>후 단계 4.3의 완료 열에 인큐베이션 혼합물을 전송, 중력에 의해 통과 솔루션을 수 있습니다. -20 ° c.에를 통해 흐름을 유지</li>
	<li>중력에 의해 워시 버퍼 pH 6 또는 해당 열 통해 pH 8의 500 µ L를 전달 합니다. 삭제를 통해 흐름.</li>
	<li>반복 단계 4.8 4 시간.</li>
	<li>마지막 세척 후 원심 1000 x g 15에서 열 s.</li>
</ol>5입니다. 코발트 구슬에서 차입
<ol><li>사용 상업 Tricine 샘플 버퍼 (200 mM Tris HCl, 40% 글리세롤, 2 %SDS, 0.04 %Coomassie 파란, pH 6.8) 2%의 최종 농도에 β-mercaptoethanol을 추가.</li>
	<li>씻어 구슬과 소용돌이 샘플을 Tricine 샘플 버퍼 (β-mercaptoethanol)의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>100 ° C에서 10 분에 대 한 샘플 열 소용돌이 다시, 샘플 1000 x g 5에서 튜브 원심 및 s. 참고: 감소는 차입에서 가능한 일반적인 바인딩, 다음 단계는 단계 5.1-5.3 대체할 수 있다.</li>
	<li>추가할 차입 이미 버퍼 (50 m m 나2HPO4/NaH2포4, 300 m NaCl, 이미 0.25 M m)의 40 μ는 씻어 비즈, 소용돌이 및 20 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어.</li>
	<li>3000 x g 30에 튜브 원심 s, 상쾌한 (eluted 샘플)를 수집 하 고 새로운 분류 관에 그것을 전송.</li>
	<li>각 튜브를 Tricine 샘플 버퍼의 40 μ를 추가, 100 ° C, 소용돌이 원심 분리기에서 10 분에 대 한 샘플 열 5 1000 x g에서 튜브 s. 참고: 마이크로 열 사용 되는 경우, 세척된 구슬, 차입 버퍼 추가 20 분 동안 품 어 고 2 분 동안 8000 x g에서 원심 분리 하 여는 차입을 수집 합니다. 참고: 샘플까지 전기 이동 법 수행-20 ° C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 전기 및 서 부 럽
참고: 샘플은 SDS 페이지와 후속 부 럽 분리에 대 한 준비. 젤 전기 이동 법 (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) 다음 수정 프로토콜을 따릅니다.
<ol><li>상업적으로 사용할 수 있는 10-20 %Tricine 그라데이션 젤을 사용 합니다.</li>
	<li>젤에 eluted 샘플 20 µ L lysates (단계 2.2.10)의 20 µ L을 로드 합니다. 문제 해결에 대 한 것이 좋습니다 언바운드 재료 (3.8 단계)의 20 µ L을 로드 하 고 10; 펩 티 드의 ng 로드 하기 전에 이러한 샘플을 Tricine 샘플 버퍼의 동일한 금액을 추가 합니다.</li>
	<li>전기 이동 법 상용 트리 스/Tricine/SDS 실행 버퍼 (100 mM Tris, 100 mM Tricine, 및 0.1 %SDS, pH 8.3)에서 실시 합니다.</li>
	<li>전송 버퍼 (25mm Tris 기지, 192 m m 글리신, pH 8.4) 20% 메탄올을 가진 보충을 사용 하 여 0.45 μ m 니트로 막에 젤에서 자료를 전송 합니다.</li>
	<li>3%를 막 차단 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온에서 1 h. 가이드로 미리 스테인드 분자량 마커를 사용 하 여, 막 가로로 잘라, HisP에 대 한 항 체와 상단 부분 얼룩과 myc 태그 펩 티 드를 식별 하기 위해 myc epitope에 대 한 항 체와 함께 하단 부분 얼룩 있습니다. 참고: 특정 경우에 막의 절단 필요 하지 않습니다 이후 HisP, Myc fll GLUT4 안티 myc 항 체를 검출 될 수 있다.</li>
</ol>7입니다. 결과의 분석
<ol><li>이미지 역 또는 ImageJ 프로그램을 사용 하 여 모든 서쪽 오 점 신호 강도 수량화 합니다.</li>
	<li>Myc 태그 모두 pH 값에서 HisP에서 신호에 대 한 펩 티 드에서 신호를 정상화.</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Sortilin는 진화 보존된 멀티 ligand 단백질 수용 체 세포내 정렬 이벤트6,7와 원형질 막에 두 신호에 관련 된 이다. 그러나, 정통 sortilin의 ligands (일부는 luminal 또는 완전 한 막 단백질)에 대 한 검색은 복잡 하다 바인딩 파트너의 일부와 함께 sortilin의 상호 작용 세제에 민감한 것 같다. 따라서, 쉽게 그리고 단백질 단백질 상호 작용, 공부에 대 한 광범위 한 접근 공동-immunoprecipitation, 쉽게 적용 될 수 없습니다. 일부 연구 그룹 sortilin와 그것의 잠재적인 ligands8,9사이의 상호 작용을 보여 공동-immunoprecipitation 사용 해 왔다. 그러나, 이러한 실험 0.1%에 밖으로 진행 되었습니다 트리톤 또는 가용 화 막의 완전성에 의...

GLUT4 지방과 골격 근육 세포 그것 후 높은가격순 혈액 포도 당 정리1에 인슐린의 효과 중재 하는 곳에 주로 표현 되는 포도 당 운송업 자 단백질 이다. 매우 안정적인 단백질 이기 때문에, GLUT4 닢 수준에 통제 된다. 인슐린의 부재에 GLUT4 크게 원형질 막 (포도 당에 대 한 따라서 낮은 기저 침투성)에서 제외 되 고 주로 셀 내부를 작은 인슐린 응답 소포 (IRVs)에서 지역화 및 trans Golgi 네트워크 (TGN) 나타낼 수 있는 어브 기증자 구획입니다. 인슐린 관리 시는 IRVs 원형질 막으로 융합 하 고 그 작동의 사이트에 GLUT4를 제공 합니다. 그래서 adipocytes 및 골격 myocytes 혈액에서 포도 당 통풍 관 그 상승 10 ~ 40이 혈당, 원형질 막의 침투성을 증가 합니다. 인슐린 철수 후 GLUT4 초기/정렬 endosomes에 내 고 검색 TGN는 IRVs는 다시 형성 하. 두 정렬 단계 GLUT4 통로, 즉 주변 초기 endosomes에서 perinuclear TGN을 검색에는 IRVs의 대형 막 Vps10p 가족, 형식을 나타내는 sortilin에 의해 활성화 되어 TGN 기증자에 나 막 횡단 단백질 그리고 정렬 수용 체입니다. Sortilin 비 계 막 횡단 단백질으로 작동 하는 하나의 모델에 따르면: 그것은 GLUT4 endosomes의 TGN, 루멘에 바인딩하고 신병은 기증자 막 통해 의 세포질 측에 retromer 또는 clathrin 어댑터의 C-터미널2, 3. 세포내 구획 사이 GLUT4 이동 기공을 사업자에 GLUT4의 배포를 용이 하 게이.
Retromer와 다양 한 접합 기 단백질 sortilin의 세포질 꼬리의 상호 작용을 잘 문서화 되었습니다. 그러나, sortilin GLUT4 (와 몇몇의 다른 단백질 ligands)의 바인딩 증명 하기 위해 도전 하고있다. 특히, 공동 immunoprecipitate sortilin 및 GLUT4 하려고가 두 단백질 사이 상호 작용의 세제에 민감한 특성상 아마 성공 되지 않았습니다. 또한 일반 운송업 자 단백질 GLUT4 12 막 횡단 도메인 및 6 luminal 루프는 조합 잠재적으로 sortilin 바인딩 사이트를 나타낼 수 있다. 동시에 효 모 2 잡종 시스템에 막 침투성 DSP와 상호 작용 cross-linking 셀에 실질적인 공동 지역화 등 간접 증거의 큰 몸 그 sortilin GLUT4 바인딩할 수 있는 것이 좋습니다. 또한, mutagenesis 스캔 알라닌과 조합에서 후자의 방식을 사용 하 여 우리는 이전 결정 sortilin의 Vps10p 도메인 주로 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 바인딩합니다. 그러나, 포유류 세포에 이러한 상호 작용의 증거는 실종 되었습니다. 여기, 우리 산 성 환경에서 유사한 transfected 3T3-L1 셀 코발트 수 지를 사용 하 여 pH 6 및 pH 8에 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 해당 하는 화학적으로 합성된 펩 티 드와 상호 작용할 수 있는 증명에서 그의 태그 sortilin 격리는 endosomal 루멘 그리고 TGN 막의 루멘에서 중립 환경. 아니 펩 티 드 바인딩 비 transfected 세포에서 준비 된 추출 물 같은 구슬에 로드 된 컨트롤 실험에서 발견 되었다.

<table><tbody><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>는 히스티딘 태그 단백질</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제에 사용됩니다&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1mL 인슐린 주사기 U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>세척 버퍼</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>His-tag 단백질 정제용</td></tr><tr><td>HisPur 코발트 수지</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Tricine 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0739</td><td>SDS와 함께, bMercaptaethanol은</td></tr><tr><td>용리를 첨가해야 합니다. </td><td>250mM Imidazole</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine 프리캐스트 젤 10-20%</td>를 사용한 His-tag 단백질 정제를 위한 버퍼 Boston BioProducts BP-236;<td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>펩타이드와 작은 단백질</td></tr><tr><td>Tris/Tricine/SDS 러닝 버퍼의 분리를 위해&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>전송 버퍼</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>20% 메탄올</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인 추가&nbsp; 0.45 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>안티 Myc 항체</td><td>세포 신호</td><td>2272</td><td>토끼</td></tr><tr><td>펩타이드</td><td>Genscipt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주문 맞춤화 Precision Plus Protein Dual color Standarts</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

단백질 단백질 상호 작용을 탐구 하는 능력은 셀에 규제 연결을 이해 하는 열쇠. 그러나, 많은 경우에 단백질-단백질 상호 작용의 중요 한 실험 과제와 연결 됩니다. 특히, 정렬 수용 체 그들의 단백질 화물이이 단백질의 공동-immunoprecipitation을 사용할 수 없게 만드는 세제에 민감한 패션에서 자주 막 구획의 루멘에서 상호 작용 합니다. 포도 당 운송업 자 GLUT4 약한 luminal 상호 막 단백질의 한 예로 봉사 수로 정렬 수용 체 sortilin의 바인딩. 여기, 우리는 sortilin 및 GLUT4 사이의 상호 작용을 확인 하기 위해, 간단한, 빠르고 저렴 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 설계 및 GLUT4 luminal 부분에 잠재적인 sortilin 바인딩 epitope를 해당 myc 태그 펩타이드를 화학적으로 합성. Sortilin 6 히스티딘 태그로 포유류 세포에 표현 되었고 세포 lysates 코발트 비즈를 사용 하 여에서 격리. Sortilin 구슬에 움직일 수 다른 pH 값, 펩 티 드 솔루션으로 알을 품는 그리고 서쪽 blotting에 의해 eluted 자료 분석. 이 분석 결과 다른 세제에 민감한 단백질-단백질 상호 작용 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다.

Lysates L1 셀 Sortilin-myc를 / 그의5 와 WT 3T3 L1 셀, 부정적인 컨트롤 사용에서 안정적으로 페 3T3에서 준비 되었다. 두 lysates pH 6 또는 pH 8에 코발트 구슬과 incubated 되었고 철저 하 게 씻어. 고정 단백질 구슬 Myc fll Glut4 솔루션에서 incubated 다음 했다. 주의 세척 후 단백질 구슬에 바인딩된 했다 eluted 0.25 M 이미와 함께. SDS-페이지 10-20% Tricine sortilin-myc를 / 그의 둘 다의 검출에 대 한 허용 반대로 Myc 항 체로 서 부 럽 그라데이션 젤 뒤에 원래 lysates 함께 샘플 복종 되었다 (110 kD) 및 Myc fll GLUT4 (5 kD) (그림 1) .
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

이 절차의 전반적인 목표는 멤브레인 단백질 또는 다른 단백질 간의 세제에 민감한 상호 작용을 감지하는 것입니다. 이 절차는 하나의 단백질이 히스티딘 태그가 붙어 세포에서 과발현되어야 하는 반면, 다른 단백질은 myc 태그가 붙은 펩타이드여야 합니다. 이 방법은 생화학 중요한 단백질 상호 작용 연구 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 세제에 민감한 방식으로 멤브레인 단백질 간의 상호 작용을 감지할 수 있다는 것입니다. 절차는 빠르고 쉽습니다. 이 방법은 막 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 약한 단백질 상호 작용을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.우리는 막 단백질인 Saltilin과 GLUT4 사이의 상호 작용을 확인하고 싶었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었지만 포유류 용해에서 이들을 공동 면역침전시키려는 시도는 여전히 성공하지 못했습니다. 펩타이드를 주문하려면 상호 작용에 중요한 펩타이드의 타겟 염기서열을 선택하고 염기서열의 끝 또는 C 말단에 myc 에피토프를 추가합니다. 일단 펩티드가 도착하면, 매우 순수한 물에 있는 펩티드의 작동 해결책의 밀리리터 당 pepare 100 마이크로그램.3개의 3T3-L1 사전 지방 세포 세포를 4개의 10cm 배양 접시에 파종하고 인큐베이터에 보관합니다. 다음으로, 6X histodyn으로 태그된 타겟 단백질로 두 개의 배양 접시를 transfection하고 두 개의 대조군 플라스미드로 표시된 다른 두 개의 접시에서 HISP로 표시하고 WT로 표시합니다. transfection 후 세포를 80-90% 농도에 도달할 때까지 48시간 동안 인큐베이터에 그대로 둡니다. 세포 용해물을 준비하려면 섭씨 4도로 냉각된 1X 완충 식염수 10ml로 얼음에서 세포를 세 번 세척합니다.그런 다음 각각에 500마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 세포를 분리하여 용해물을 준비합니다. 각 배양 접시에서 준비된 세포 용해물을 4개의 개별 1.5mm 튜브로 옮기고 모든 튜브에 라벨을 붙입니다.그런 다음 26게이지 바늘이 있는 주사기를 통해 세포 용해물을 위아래로 5회 통과시켜 전체 세포 용해를 수행합니다. 그런 다음 세포 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 16000xg로 원심분리합니다. 상등액을 동일하게 라벨링된 4개의 새 튜브로 옮깁니다.향후 문제 해결 및 제어 실험을 위해 20마이크로리터의 세포 용해물을 분취하고 섭씨 20도에서 보관합니다. 나중에 사용할 수 있도록 PH8에서 염산으로 세척 버퍼를 역가하여 PH6를 얻고 버퍼를 섭씨 4도에서 보관합니다. 다음으로, 코발트 비드의 균일 한 현탁액을 준비하려면 병을 조심스럽게 소용돌이칩니다.그런 다음 40마이크로리터의 코발트 비드 현탁액을 개별적으로 표시된 4개의 튜브 모두에 옮깁니다. 코발트 비드를 첨가한 후 튜브에 1ml의 용해 완충액을 추가합니다. 그런 다음 1000xg에서 5초 동안 튜브를 원심분리합니다.상등액과 피펫 40마이크로리터의 용해 완충액을 침전된 비드에 버립니다. 그런 다음 세포 용해물을 해당 튜브로 옮기고 튜브 회전체에서 섭씨 4도에서 90분 동안 배양합니다. 90분 후 1000xg에서 5초 동안 샘플을 원심분리합니다.그런 다음 Flowthrough-1이라고 표시된 상등액을 수집하여 섭씨 20도에서 보관합니다. 다음으로, PH8이 포함된 세척 버퍼 500마이크로리터를 개별 튜브에 추가하고 비드를 부드럽게 다시 매달립니다. 튜브를 1000xg에서 5초 동안 원심분리하고 상층액을 배출합니다.그런 다음 라벨에 따라 튜브에 PH8 또는 6이 있는 세척 버퍼를 추가하고 비드를 잘 다시 매달립니다. 튜브를 1000xg에서 5초 동안 원심분리하고 상층액을 배출합니다. 펩타이드와 물 완충액의 밀리리터당 1마이크로그램을 PH6 또는 8로 준비합니다.그런 다음 100 마이크로 리터의 펩타이드 용액을 유사한 PH에 해당하는 세척 된 비드에 첨가하십시오. 그런 다음 튜브 로테이터에서 섭씨 4도의 비드를 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 4개의 마이크로 컬럼을 가져와서 라벨을 붙이고 Flowthrough-2라고 표시된 수집 튜브에 컬럼을 넣습니다. 배양이 끝난 후 배양 혼합물을 컬럼에 추가합니다.용액이 중력에 의해 통과하도록 하고 흐름에서 샘플을 수집합니다. 컬럼을 새 수집 튜브에 넣고 섭씨 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 개별 컬럼을 통해 중력 흐름에 의해 PH6 또는 8로 500마이크로리터의 세척 버퍼를 통과시키고 흐름을 버립니다.이 단계를 네 번 반복합니다. 튜브를 1000xg에서 5초 동안 원심분리합니다. Elution이라고 표시된 새 수집 튜브에 컬럼을 놓습니다.결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 모든 튜브의 비드를 매우 신중하고 동등하게 세척하는 것이 중요합니다. 세척된 비드에 베타 메르캅토에탄올이 함유된 트리신 샘플 버퍼 40마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 20분 동안 그대로 두십시오.8000xg에서 2분 동안 컬럼을 원심분리합니다. 컬럼을 버리고 수집 튜브를 섭씨 100도에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 1000xg에서 5초 동안 원심분리합니다.또는 세척된 비드에 40마이크로리터의 Elution Imidazole 완충액을 추가하고 온화한 실에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝난 후 튜브를 8000xg에서 2분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 버리고 40마이크로리터의 트리신 샘플을 추가합니다.수집 튜브를 섭씨 100도에서 10분 동안 가열한 다음 1000xg에서 5초 동안 원심분리합니다. 시중에서 판매되는 10-20%tricine gradient gel을 사용하십시오. Tris/Tricine/SDS 러닝 버퍼를 사용한 다음 용출된 샘플과 총 용해물을 각각 20마이크로리터씩 겔에 로드하고 전기영동 장치 실행을 시작합니다.전기영동이 끝나면 20%메탄올이 보충된 전사 완충액을 사용하여 겔의 물질을 0.45마이크로미터 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달합니다. 멤브레인을 막은 후 수평으로 자릅니다. 다음으로, anti myc로 막의 아래쪽 절반에 Anti His P 항체가 있는 막의 상부를 조사합니다.GLUT4에서 코발트 비드에 대한 고정화된 Sortilin 간의 상호 작용을 연구하기 위해 면역블롯 분석을 수행했습니다. 세포 용해물 및 용리액을 야생형 및 Sortilin-myc/His-tagged 형질주입된 3T3-L1 세포를 얻은 다음 SDS 페이지에 로드했습니다. 오점은 anti-myc 항체로 조사되었다.블롯은 형질주입된 용리암에서 110킬로도틴 Sortili-myc/His-tagged 및 5킬로틴 myc-first luminal loop-GLUT4를 보여줍니다. 다음으로, PH의 중요성과 코발트 비드에 고정된 Sortilin과 GLUT4 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 면역블롯 분석을 수행했습니다. 이 분석에서, Myc-first luminal loop GLUT4는 PH6 및 8 모두에서 Sortilin-myc/His-tagged 단백질로 고정화된 비드와 함께 배양되었습니다.이 블롯은 Sortilin-myc/His-태그가 지정된 형질주입된 3T3-L1 세포에서 얻은 용출액에서 PH6 및 8 모두에서 Sortilin-myc/His와 myc-first luminal loop GLUT4 사이의 명확한 상호 작용을 보여줍니다. 이 기술을 완전히 익히면 샘플이 서양의 혈액 분석을 위해 준비될 때까지 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가급적이면 물에 용해되는 펩타이드를 설계하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.결과를 강화하기 위해 교차결합 후 면역침전과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세제에 민감한 절차에서 멤브레인 단백질, 단백질 상호 작용을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 단백질 단편 간의 상호 작용을 탐색할 수 있습니다.부드러운 리듬 재즈.

detection-detergent-sensitive-interactions-between-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 세제 가용화 후 대장균에서 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 막 단백질 안정성을 스크리닝하기 위한 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 기술을 시연합니다. 유리 GFP가 거의 또는 전혀 없는 크기 배제 프로파일에서 대칭적인 피크를 나타내는 단백질은 분해 및 응집이 최소화된 정제된 단백질을 나타내며, 이는 이후에 구조 기능 분석을 위해 선택될 수 있습니다.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.

막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

마이크로스케일 열영동은 낮은 재료 비용으로 결합 상수를 신속하게 획득한다. 표지 또는 라벨이 없는 마이크로스케일 열영동이 상업적으로 입수가능하거나; 그러나, 라벨 없는 열영동은 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있는 상호작용 측정의 다양성을 할 수 없다. 우리는 라벨이 붙은 열영동 측정을위한 프로토콜을 제공합니다.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

우리는 막 단백질 정제 및 재구성을 단일 크로마토그래피 단계에서 펩티디스크로 결합하는 방법을 제시합니다. 생체 측량 스캐폴드는 생체층 간섭측정을 통해 단백질-리간드 상호 작용의 직접 표면 부착 및 측정에 사용됩니다.

PeptiQuick, 간소화 된 단백질 결합 검정을 위한 생체 면역 펩티디스크에 막 단백질의 한 단계 통합

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

배우세요 세제에 민감한 막 단백질 상호 작용 탐지 방법을. 히스티딘 및 myc 태깅 기술을 활용하여 sortilin과 GLUT4의 결합을 분석하고, 생화학적 맥락에서 단백질 상호 작용을 연구하는 효율적인 프로토콜을 제공합니다.

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

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