Name: 높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 고전압 냉동 전자 단층 촬영을 이용한 시아노박테리아 DNA 압축 시각화 방법입니다. 형광 현미경과 냉동 전자 단층 촬영으로 세포 주기 동안 DNA 구조 변화를 관찰할 수 있습니다.

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저자는 원고, 고 마 코 하 야 시와의 사유리 하기와 라 주의 재배에 대 한 중요 한 독서와 남조류, 요시타카 Kimori 이미지 처리를 위해, Chihong 노래, 미야자키 나 오 유키, 그리고 님의 Tammo Reisewitz 감사 나가요시는 구조의 세분화와 도움에 대 한입니다. 이 작품 국립 연구소의 공동 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 생리 적인 과학 (일본군)에 영 규 과장

1. 동기 문화 박테리아의
<ol><li>S. elongatus 한 천 1.5% (w/v) 및 0.3% (w/v) 나트륨 thiosulfate8(에 9 cm 살 균 플라스틱 페 트리 접시) 소독된 BG 11 접시에 PCC 7942 문화.</li>
	<li>12 h 빛/12 h 어두운 주기 및 50 µE/m2/s의 광도와 23 ° C에서 성장 챔버에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>일주일에 한 번 신선한 BG11 한 천 배지 위에 셀을 전송 합니다. 참고:는 agar에 문화의 녹색 띠로 표시 됩니다이 문화 조건 1 주일 후 셀 적극적으로 확산.</li>
	<li>신선한 BG11 한 천 격판덮개에 셀 셀 화 염 멸 균된 와이어 루프와 행진의 녹색 덩어리를 가져가 라. 이렇게 깨끗 한 벤치에.</li>
</ol>2. 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링
<ol><li>6 일에 대 한 천 배지에서 배양 세포를 사용 하 여 DNA 압축을 관찰. 셀에서에서 수집 접시 빛 기간의 끝에서 0.2 M 자당 솔루션의 따르는 1 mL에 의해 셀에. 셀의 대부분을 수집할 셀에 솔루션을 붓는 반복 합니다. DNA 얼룩에 대 한 마이크로 튜브로 중단 셀 솔루션을 전송 합니다.</li>
	<li>DNA 얼룩 염료 (예: Hoechst 33342) 솔루션 1 µ g/mL의 최종 농도에 마이크로 튜브에서 일시 중단 된 셀 솔루션의 500 µ L 추가 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 어둠 속에서 튜브를 유지.</li>
	<li>2000 x g 침전 물에 1 분 동안 원심 셀. 삭제는 상쾌한 고 고밀도 세포 현 탁 액을 얻기 위해 0.2 M 자당 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>슬라이드 유리에 얼룩진된 셀을 포함 하는 솔루션의 1 µ L를 전송, 커버 슬립 넣고 100 X 및 침수 기름의 확대와 함께 대물 렌즈를 사용 하 여 UV 필터 장착 형광 현미경으로 관찰.</li>
	<li>DNA 압축은 대부분의 세포에서이 시점에서 관찰 확인 다음 다음 동결 단계에 대 한 샘플을 준비 합니다.</li>
</ol>3입니다. 샘플 곳을 알아내는-HVET에 대 한 동결
<ol><li>식이-냉동 장치를 설정 합니다. 액체 질소 탱크를 테 플 론 튜브 탱크와 챔버를 연결한 후 cryo 약 실 냉각 시작.</li>
	<li>액체 질소 온도 챔버를 냉각 후 챔버 내부에 작은 cupper 냄비에 액체 탄을 입력 합니다. 액체 탄 폭발 때문에 작업 중 안경 착용.</li>
	<li>글로우 방전 홀리 탄소 코팅 그들의 탄소 쪽 그리드 (홀리 그리드) 30 50 s mA 플라즈마 이온 bombarder를 사용 하 여.</li>
	<li>1 µ L BSA 금 추적 프로그램의 적용 (15 nm) 표준 표식으로 홀리 눈금.</li>
	<li>DNA 압축 단계에서 홀리 그리드 셀의 2.5 µ L 약 수를 적용 됩니다. 필터 종이 초과 솔루션에서 오 점. 즉시 식이 냉동 장치에 플런저를 사용 하 여 액체 탄으로 그리드를 급락.</li>
	<li>그들은 검사 때까지 냉동된 격자 액체 질소 저장소에 저장 합니다.</li>
</ol>4. 곳을 알아내는-HVET
<ol><li>1의 높은 전압에서 HVEM 설정 MV.</li>
	<li>탑재 cryo-견본 홀더 HVEM cryo-워크스테이션, 내부 액체 질소로-150 ° C에 precooled에 대 한 언된 표는 HVEM에 로드 합니다. 얼음으로 오염을 피하기 위하여 주의 해야 합니다.</li>
	<li>1, 낮은 확대율에서 이미징 영역 선택 000 X. Eucentric z 축 높이 조정 합니다.</li>
	<li>-60 °에 견본 단계 기울기와 기울기 회전의 반발을 제거.</li>
	<li>10, 확대 대상 위치 근처 초점 조정 000 X. 설정 된 초점된 이미지에서 편차에 의해 6 ~ 10 µ m의 초점에서. 이미지 설정 복용량 2 e-/Å-2 미리 견본에서.</li>
	<li>HVEM에 이미지 화면에 전류 밀도 의해 전자 복용량을 측정 합니다. 전자 필름 또는 디지털 카메라 초점 프로세스에서 동일한 배율에서 이미지를 가져가 라.</li>
	<li>수집 기울기 이미지 수동으로 (4.5)와 같은 절차에 의해-60 °에서 60 °에 2 ° ~ 4 °의 기울기 각도 증가 합니다. 참고: 많은 현대 전자 현미경, 기울기 시리즈의 수집 디지털 카메라의 조합에 의해 자동화입니다. 이 경우, 설명서를 따르십시오. 네거티브 필름에 대 한 전체 강도 개발자를 사용 하 여 개발자 탱크에 20 ° C에서 12 분에 대 한 영화를 개발 하 고 10 분 디지털화 4000 dpi (0.635 nm/픽셀 이미지)의 해상도에서 영화에 대 한 해결사 수정 평판 스캐너를 사용 하 여. 디지털 카메라의 경우 다음 이미지 처리 단계에 직접 수집 된 이미지를 제목. 필요한 경우, 중간 필터 2 ~ 4 범주화 (크기 줄이는 요소) 및 적절 한 소프트웨어 (예: ImageJ)를 사용 하 여 이미지 크기를 줄입니다.</li>
</ol>5. 단층 촬영 재구성
<ol><li>스택 이미지 파일을 개별에서 기울기 아이 모드 소프트웨어9명령 "tif2mrc" 또는 "newstack"를 사용 하 여 이미지를 확인 합니다.</li>
	<li>아이 모드에서 eTomo GUI 소프트웨어를 시작 하 고 이미지 매개 변수 설정: 픽셀 크기, 표준 직경, 이미지 회전, 등등. 그런 다음 스크립트를 만듭니다.</li>
	<li>자료의 테이블에 나열 된 소프트웨어에 따라 개별 프로그램 실행 어디 기울기 시리즈 (오류와 함께 평균 잔여 0.5 미만) 표준 마커를 사용 하 여 정렬 됩니다. 마지막으로, 3D tomogram 아이 모드에서 SIRT 알고리즘을 사용 하 여 재구성 합니다.</li>
	<li>tomogram에서 관심 (ROI) 영역을 추출 하 고 denoise 필터를 사용 하 여 denoise: 아이 모드, EMAN10, 양자 필터 또는 수학 형태학에 비 등방성 확산 필터 필터11, 등, 적절 한 매개 변수 대비를 향상 시킵니다.</li>
</ol>6입니다. 관심의 기능 세분화
참고: 아래 설명 된 절차는 소프트웨어 사용 (참조 자료 테이블) 특정 하지만 다른 소프트웨어 패키지를 대신 사용할 수 있습니다. 그들의 사용자 가이드를 참조 하십시오.
<ol><li>3D 뷰어 창에서 Amira 소프트웨어에 tomogram 파일을 열고 생성 한 OrthoSlice.</li>
	<li>세그먼트화 편집기 창에서 새로운 "레이블 필드"를 선택 하 여 분할 파일을 만듭니다.</li>
	<li>수동으로 추적 관심 (아버지)의 기능의 테두리. 모든 tomogram 슬라이스를 통해 법을 따릅니다. 두 번째 아버지에 대 한 새로운 "물자" 만들고 동일한 작업을 반복 합니다.</li>
	<li>"SurfaceGen" 메뉴를 선택 하 여 표면 렌더링을 생성 합니다. 세그먼트 볼륨 시각화 "SurfaceView" 메뉴를 선택 합니다. 이동, 회전 하 고 3D 볼륨 확대, 3D 뷰어 창에는 도구를 사용 합니다.</li>
	<li>자동 분할에 대 한 마법 지팡이 도구를 사용 합니다. 개체를 클릭 하 고 개체의 기능에 의해 완전히 선택 되도록 값의 범위를 커버 하는 디스플레이와 마스킹 슬라이더를 조정.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

우리는 박테리아에 과도 DNA 압축을 시각화에 대 한 프로토콜의 순서를 제시 했습니다. 기본 개념은 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)12의 비슷합니다. 또한,이 방법에서는, 살아있는 박테리아 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링, EM 격자에 급속 하 게 동결 되었고 직접 높은 전압 cryo 전자 단층 촬영으로 시각. 첫 번째 응용 프로그램, DNA의 상세한 구조 압축 세균 세포로 성공적으로 3d에서 시각화 했다. 현재,이 절차는이 주제에, 하지만 경우에 따라 수정 된 방법론으로 더 광범위 하 게 적용 됩니다. 여기, 장점, 한계, 그리고이 방법의 미래 가능성 설명 되어 있습니다.
이 방법의 장점 중 하나는 전체 셀의 3 차원 시각화 이다. 1 MV HVEM 성공적으로 동적 시각 subcellular 세포에서 DNA의 구조 압축 셀. 그러나, 정상 세포 내부의 미세 구조 때문에 낮은 이미지 대비 구분할 수 없습니다. 탄력 증가 및 두꺼운 표본에서 여러 분산13이미지 흐리게 합니다. 에너지 필터에 의해 필터링 하는 0-대부분 추정 손실 및 이미지는 inelastic 산란14,15, 줄여 이미지 대비를 향상 시킬 수 있습니다 하지만 iMFP 보다 두꺼운 표본에 대 한 작동 하지 않습니다. 0-가장 가능성이 손실 및 봉우리 견본 두께 대폭 감소. 그것은 특히 전자 민감한 얼음 포함 된 표본에 대 한 충분 한 신호 대 잡음 비율을 얻기 어렵다입니다. 무라 타 외. 나타났습니다 그 1MV 스캐닝 전송 플라스틱에서 밝은 필드 이미지 보다 높은 이미지 대비 5 µ m 두께, 효 모 세포를 포함 하는 현미경 (줄기) 제공 이미지 대비 진폭 대비13에 의해 주어진 주로 . 그러나, 높은 가속된 전자에 효과 연쇄 피해의 또 다른 한계 손상에 민감한 곳을 알아내는-표본16에 대 한 방사선 조사 복용량을 만듭니다 예상 된다. HVEM 볼타 Zernike 단계 격판덮개17,18 의 적용은 미래에 총 복용량을 줄여 연쇄 피해를 줄이기 위해 수 있습니다. HVEM 두꺼운 표본에 대 한 사용 하 여 또 다른 한계는 사용자 시설 HVEM을 제공 하는 세계적으로 부족 한는 사실에서 온다.
두꺼운 표본, 300 곳을 알아내는-줄기 단층을 관찰 하는 다른 방법론을 사용 하 여 kV 몇 백 나노미터19이상의 두께와 냉동 화 표본에 높은 콘트라스트 이미지를 설명 했다. 곳을 알아내는-줄기에 단계 대조를 검색 하려면 전자 pthychographic 현미경 검사 법 또한 도입 되었습니다, 있는 단계 접시 콘덴서 렌즈에 transposes pixelated 2D 탐지기20위상 변조 회절. 이미지는 여러 diffractions에서 계산에 의해 검색 됩니다. 큰 기본 냉동 샘플, cryo-거짓말-SEM의 직접적이 고 빠른 3D cryo 이미징 또한 사용된21, 어디에 집중 된 이온 빔을 단면 직렬 고 수 얼굴 이미지 차단에 대 한 이미징 완전히 수 화 냉동된 표본에 적용 됩니다. 비록 이러한 기술은 생물 표본 보기 범위를 확장, 박테리아의 대상 위치를 찾을 수 어렵습니다 예: 대상과 완전히 얼음은 자르기 전에 확인할 수 수 없습니다 때문에 박테리아를 표시.
DNA 압축 박테리아에 고유한 구조를 생성합니다. DNA는 세포를 압축 때문에 정상 세포에 존재 하지 않는 셀 내에서 큰 밀도 바이어스 얼룩이 되 고 없이 쉽게 구별 됩니다. 그러나, 세포 내의 더 많은 지역 이벤트를 시각화 하기 위해 그것은 전자 현미경에 붙일 레이블된 ROI를 전송 하는 데 필요한. 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)에 대 한 가벼운 현미경 이미지와 전자 현미경 이미지는 일반적으로 상관 EM 파인더 격자12형광 라텍스 구슬 또는 양자 도트를 사용 하 여. 라벨 입자 형광 뿐만 아니라 높은 전자 밀도의 해야 합니다. 그들은 수 있는 정확 하 고 안정적으로 상관 두 이미지 사이의 위치. 또한, cryo-가벼운 현미경 검사 법으로 레이블이 지정 된 영역을 확인 하 여 두 현미경 사이 완전 한 중복 투자 수익의를 얻을 수 있습니다. 더 자세한 구조 이벤트 DNA 압축 특성화 때이 입자 및 곳을 알아내는-가벼운 현미경 보다 강력 하 고 정확한 상관 관계를 미래에 대 한 필수적인 도구 있을 것입니다.
이 문서에서는 동기 문화, 형광 현미경 검사 법 및 높은 전압 cryo 전자 단층 촬영의 조합에 의해 박테리아의 DNA 압축의 일시적인 구조를 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 압축 된 DNA의 관찰에 중점을 둡니다. 위에서 언급 한 다른 새로운 기술로이 메서드를 결합 하 여 더 자세히, DNA 압축 하는 과정을 조사할 수 있을 것입니다 하 고 적절 한 수정된 방법을 널리 박테리아에서 다른 동적 구조 이벤트에 적용 되는.

DNA 압축 일부 박테리아에서 확인 된 극적인 세포질 이벤트입니다. 때 Synechococcus elongatus 는 교양 12 h 아래 각 명암 주기, 압축 된 다른 시간에 그것의 외관에서 명확 하 게 다른 빛 기간의 끝에 등장 하는 DNA1포인트. 그것은 제안 되었습니다이 프로세스 카이 단백질2에 따라 circadian 시계에 의해 제어 됩니다. 세 키 외 DNA Hoechst 33342 물 빛 기간의 끝으로 S. elongatus 세포에 압축 되었고 형광 현미경 물결 막대 모양을 보여주었다 보고 했다. 다음 압축된 DNA 셀 분할 그리고 마지막으로3각 딸 세포는 정상적인 균일 한 분포에 반환으로 막대의 센터에서 두 가지로 구분. 그러나, 일시적인 자연과 전자 현미경 검사 법에 대 한 큰 크기 구조 분석을 방해. 무라 타 외. 동기 문화, 형광 현미경 검사 법, 급속 동결, 및 높은 포함 여러 방법을 결합 전압 전자 cryo-단층 촬영 (cryo-HVET), 그리고 일시적인 DNA 압축의 구조 확인에 성공 polyphosphate 시체 (PPBs)4의 활동을 포함 하 여. 원고 실험 절차를 결합 하 여 자세히 이러한 어려운 자료의 시각적 설명을 제공 합니다.
S. elongatus 는 캡슐 모양, 길이 2 ~ 5 µ m, 너비 0.5 µ m에 대 한 완벽 한 DNA 압축의 아주 짧은 시간 동안만 생활 셀에 나타납니다. 따라서, cyanobacterial DNA 압축에서 발생 하는 구조적인 변화 자세히 알려지지 않은 됐다. 전자 현미경 검사 법에 의해 이러한 구조를 조사 하기 위하여 그것은 두 가지 주요 기술적 문제를 극복 하는 데 필요한입니다. 하나는 기본 조건, 근처에 전체 박테리아 같은 두꺼운 표본 관찰 이며 다른 동적 구조의 급속 한 고정. 첫 번째 문제에 관해서는 전자의 탄성이 평균 자유 경로 (iMFP) 전자 현미경5의 가속 전압에 따라 달라 집니다. 전송 전자 현미경 (TEM) 300에서 kV, 그것은 보다 350 nm. 예를 들어, 얼음 포함 cyanobacterium (견본 간격 ≈ 600 nm)는 200kV TEM에서 관찰 (iMFP ≈ 250 nm), 셀 내부 구조는 관찰 하기 어려운. 1 MV 가장 대조적 (iMFP ≈ 500 nm) 줄 수 있고 이미지 셀 (그림 1)에 걸쳐 세포질 구조. 솔루션 1의 가속 전압에 고전압 전자 현미경 (HVEM)의 한 부분으로,이 프로토콜에 MV 고용 했다. 그러나, 시설 HVEM을 구현 하는 세계적으로 제한 됩니다. 가능한 대체 솔루션을 또한 토론 섹션에 설명 되어 있습니다. 두 번째 문제는 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)에 의해 해결 되었다. 이 기본 조건, 표본을 급속 냉동 장치를 사용 하 여 액체 탄에 급속 하 게 얼 고 냉동된 순간 수정6의 최소와 함께 직접 관찰은 근처에 동적 구조를 시각화를 위한 강력한 도구입니다. 단층 촬영을 결합, 3 차원 (3D) 구조의 스냅숏으로 기울기 시리즈7에서 개축 될 수 있다. 이 실험에서 DNA 압축 S. elongatus 미만 12 h 각 명암 주기, 동기 문화를 사용 하 여 재현 했다 그리고는 시료의 동결의 타이밍 형광 현미경 모니터링에 의해 결정 되었다.
여기에 설명 된 방법 세균성 세포, 예를 들어 세포 분열, 염색체 분리 및 살 균 소 감염에 동적 구조 연구에 광범위 하 게 적용 되며 미생물 연구에 새로운 길을 열 가능성이 있다.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342 용액</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>H2O</td></tr><tr><td>한천 분말(식물 배양용)</td>에 1mg/mL <td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>염화망간 테트라하이드레이트</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>99%</td></tr><tr><td>황산아연 헵타하이드레이트</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>몰리브덴</td>산나트륨 <td>Wako</td><td>196-02472</td><td>99%</td></tr><tr><td>황산구리 수화물</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>질산코발트 육수화물</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>질산나트륨</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>99%</td></tr>황<tr><td>산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>Wako</td><td>131-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>칼슘 염화물 탈수</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>구연산</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>98%</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>동진도</td><td>343-01861</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>99%</td></tr><tr><td>TES (좋음) s buffer)</td><td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td>1등급</td></tr><tr><td>sodium thiosulfate pentahydrate</td><td>Wako</td><td>197-03585</td><td>99%</td></tr><tr><td>BSA gold tracer 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil EM grid</td><td>Quantifoil MicroTools</td><td>R3.5/1 Copper grid</td><td></td></tr><tr><td>Electron films</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>개발자</td><td>코닥</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>정착사</td><td>코닥</td><td>신속한 정착액</td><td></td></tr><tr><td>솔루션 여과지</td><td>Whatman</td><td>1 학년 성장</td><td></td></tr><tr><td>챔버</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>니콘</td><td>이클립스 50i</td><td></td></tr><tr><td>고전압 TEM</td><td>HItachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr><td>HVEM용 극저온 표본 홀더</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr>, 급강하 <tr><td>동결 장치</td>, <td>Leica</td><td>EM CPC,</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 이온 폭격기</td>, <td>진공 장치</td>, <td>PIB-10</td><td></td></tr>, <tr><td>액체 질소 저장</td><td>, Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td>, <td></td></tr><tr><td>개발 탱크</td><td>, Dosaka EM</td>, <td>TB-3-75</td><td></td></tr>, <tr><td>평판 스캐너</td>, <td>Nikon</td><td>Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td>세분화 소프트웨어</td><td>FEI</td><td>Amira https://www.fei.com/software/amira</td><td></td></tr><tr><td>단층 촬영 재구성 소프트웨어</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

높은 전압 cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 dna 압축의 시각화

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. DNA 압축 최근 일부 남조류 세포 분열의 앞에 발견 하는 극적인 세포질 이벤트입니다. 그러나, 큰 셀 크기와 과도 문자, 그것은 자세히 구조 조사 어렵다입니다. 어려움을 극복 하기 위해 먼저, DNA 압축 reproducibly에서 생산 됩니다 cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 각 명암 주기 12 h를 사용 하 여 동기 문화. 둘째, DNA 압축 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링 이며 급속 동결에 의해 점령. 셋째, DNA의 상세한 구조 압축 셀 고전압 cryo 전자 단층 촬영 하 여 3 차원 (3D)에 시각 이다. 방법의이 세트는 박테리아, 예를들면 세포 분열, 염색체 분리, 살 균 소 감염 등에서 일시적인 구조 조사를 광범위 하 게 적용., 형광 현미경 검사 법에서 모니터링 하 고 직접에 의해 시각 적절 한 시간 점에서 cryo 전자 tomography

정확한 동기 문화 각 명암 주기 12 h 미만, Hoechst 표시 DNA 어두운 상태 (그림 2a)에서 정상적인 균일 한 분포를 보여줍니다. 그러나, 그것은 점차적으로 빛 기간 동안 셀 내에 압축 하 고 가벼운 기간의 끝에 물결 막대 모양의 구조 (그림 2b)으로 나타납니다. 마지막으로, 막대 ( 그림 2c에서 화살표) 센터에서 분할 그리고 그 두 부분 딸 세포 (그림 2d)로 배포 됩니다. 세포 분열 후 압축된 DNA 사라집니다 즉시, 그리고 DNA는 정상적인 균일 한 분포를 반환 합니다.
때 DNA 압축의 최종 단계에 있는 셀을 포함 하는 셀의 약 수 했다 즉시 전송 홀리 그리드와 빠른 냉동 액체 탄, 그리고 냉동된 그리드 1 MV cryo-HVEM, 남조류 등의 내부 구조에 의해 관찰 되었다 DNA, thylakoid 막, 세포 벽, 레이어와 PPBs, 동결 (그림 3a)의 순간에 스냅숏으로로 나타났다. 많은 셀 셀 ( 그림 3a에서 흰색 화살표)에 고유한 DNA 압축 그리고 정상 세포 ( 그림 3b에서 흰색 화살표)에서 쉽게 구별 될 수 있습니다. 일부 전시 세포의 중심에 수축 세포 분열 (노란색 화살표 그림 3a에서) 전에 예상 대로.
3D tomograms에서 셀의 주요 세포를 세그먼트 수 있습니다; 세포 벽, thylakoid 막, DNA, 레이어와 PPBs 수 구별 (그림 4). 특히, 압축 된 DNA는 세포질 DNA 저밀도 물자에 의해 포위 되었다 고 thylakoid 막 레이어 압축된 DNA의 물결 막대 따라 왜곡 됐다에서 뚜렷한 간격에 의해 분리 되었다. PPBs의 동적 동작을 새롭게 관찰 되었다: DNA에 압축 셀, 그들은 큰 반면 많은 작은 PPBs DNA에 보인 적은 정상 세포에서. 또한, 대부분은 PPBs의 쌍으로 등장 하 고 일부 DNA는 PPBs에서 분리의 과정에 있을 것으로 보인다. 이 DNA 합성에 대 한 인산의 공급 업체로 스스로 PPBs DNA 복제 및 기능으로 2로 분할 된다 제안 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg"> 그림 1입니다. 곳을 알아내는-EM 얼음 포함 정상적인 박테리아, S. elongatus PCC 7942 다른 가속 전압에서의 이미지. a) 200kV 및 b) 1000kV. 눈금 막대 = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg"> Cyanobacterium S. elongatus 셀의 그림 2: 형광 현미경 검사 법. 동기 문화 12 시간 미만 각 명암 주기, 후 셀 Hoechst 33342와 얼룩이 있었다. (a) 어두운 상태의 발병의 2 시간 후 셀 표시 동일한 DNA 라벨. 많은 세포에서 DNA는 점차적으로 가벼운 기간 동안 집 광. 그것은 궁극적으로 두꺼운 물결 막대 (b) DNA 압축의 전형적인 형성. 이 단계 후에 신속 하 게 세포 분열 (c), 그리고 2 개의 파편 중 그들의 센터 (화살촉)에서 분할 압축된 DNA 구조 딸 세포로 분리 된 (d). 딸 세포는 균일 한 DNA 라벨 어두운 기간에 다시 돌아갑니다. 눈금 막대 = 2 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg"> 그림 3: 곳을 알아내는-HVEM 이미지 남조류의 무 조직 얼음에 포함 된 (a)은 raw 이미지 0 ° 기울기입니다. 이미지 조명 기간의 끝에서 찍은 사진. 일부 셀 표시 물결 막대 모양의 DNA 시체 핵 압축 된 염색체 (흰색 화살표)와 비슷합니다. 정상 세포에 박테리아 (흰색 화살표) 세포질 내에서 뚜렷한 DNA 구조를 전시 한다. 일부 전시 세포 분열 (노란색 화살표) 전에 예상 대로 셀의 중심에 수축. (b) xy, xz, yz-3D tomogram의 조각. 노란색 점선을 조각의 교차점 표시. 눈금 막대 = 2 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg"> 그림 4: 포함 된 셀의 열 대권 외 압축 DNA. 주요 구성 요소는 세그먼트: 세포 벽 (밝은 노란색), thylakoid 막 (빨간색), 그리고 DNA (파란색). 3D tomogram의 z 슬라이스 (a) 보여준다. (b) 모든 세그먼트. 세포 분리를 나타내는 수축 (화살표) 셀의 가운데에 나타납니다. PPBs 노란색 또는 주황색 분야;으로 모델링 됩니다. 각 주황색 구체 가까운 노란색 영역에의 대응을 나타냅니다. 눈금 막대 = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

이 방법은 박테리아의 세포주기 동안 DNA 구조가 어떻게 변화하는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 추가 처리 없이 적절한 시점에서 살아있는 상태에 가까운 전체 박테리아 세포의 미세 구조를 시각화할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 박사후 연구원인 Chihong Song과 Dr.Kaneko 연구실의 대학원생인 Mako Hayashi가 절차를 시연할 것입니다.1.5%의 한천과 0.3%의 티오황산나트륨을 함유한 9cm의 멸균된 BG-11 플레이트에서 시아노박테리아를 배양하는 것으로 시작합니다. 섭씨 23도에서 12-12 광주기로 플레이트를 초당 평방 미터당 50 마이크로 E의 빛으로 배양합니다. 세포를 유지하려면 매주 새로운 BG-11 한천 플레이트로 옮기십시오.일주일 이내에 문화권이 녹색 띠로 나타납니다. 화염 멸균 루프를 사용하여 세포의 녹색 덩어리를 옮기고 새 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. DNA 압축을 관찰하려면 광주기가 끝날 때 6일 동안 배양된 세포를 수집합니다.플레이트에서 세포를 분리하려면 0.2몰 자당 1ml를 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 용액이 녹색으로 변할 때까지 자당 첨가 및 제거를 반복합니다. 색상 변화는 대부분의 셀이 해제되었음을 나타냅니다.이제 500마이크로리터의 부유 세포 용액을 마이크로분리 튜브로 옮기고 Hoechst 염색을 추가하여 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 세포를 어두운 곳에서 10분 동안 배양한다. 다음으로, 세포를 스핀 다운하고 상층액을 버리고 10 마이크로 리터의 0.2 몰 자당에 재현탁시킵니다.다음으로, 현탁액 1마이크로리터를 유리 슬라이드로 옮기고 커버 슬립을 착용한 다음 UV 필터가 장착된 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 100배 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 대부분의 세포에서 관찰할 수 있는 DNA 압축의 증거를 찾습니다. 먼저 급강하 냉동 장치를 준비합니다.그런 다음 에탄 용기와 냉각봉 부착물을 삽입하여 액체 질소 용기를 설정합니다. 다음으로 용기에 액체 질소를 채우고 액체 질소 온도로 냉각합니다. 그런 다음 용기에 에탄 가스를 적재하십시오.액체 에탄은 폭발성이 있으므로 보안경을 착용하십시오. 마지막으로 냉각 막대 부착물을 제거하고 용기를 플라스틱 뚜껑으로 덮어 서리가 끼지 않도록 합니다. 계속 진행하려면 플라즈마 이온 장벽을 사용하여 50밀리암페어에서 30초 동안 탄소 코팅된 EM 그리드의 탄소 측을 글로우 방전합니다.그런 다음 테스트 프로토콜에 따라 Vitrobot을 준비합니다. 핀셋을 사용하여 전처리된 EM 그리드를 챔버로 설정합니다. 샘플을 적용하기 전에 1마이크로리터, 15나노미터 BSA 금 추적자로 EM 그리드를 처리하여 기준 마커 역할을 합니다.이제 2.5마이크로리터의 세포 현탁액을 그리드에 분취합니다. 여과지를 사용하여 과도한 용액을 닦아내고 즉시 그리드를 액체 에탄으로 동결합니다. 검사할 수 있을 때까지 동결된 그리드를 액체 질소에 보관하십시오.그런 다음 HVEM을 시작하고 1메가볼트의 고전압으로 설정합니다. 그런 다음 액체 질소를 사용하여 시편 그리드 홀더를 섭씨 영하 150도까지 냉각합니다. 냉각이 완료되면 동결된 그리드를 냉각된 극저온 표본 홀더에 장착하고 HVEM에 로드합니다.설정이 얼음으로 오염되지 않도록 주의하십시오. 이제, 1, 000 배의 낮은 배율에서 이미징 영역을 선택하십시오. 그런 다음 유센트릭 Z축 높이를 조정하고 시편 스테이지를 음의 60도로 기울입니다.그런 다음 틸팅 회전의 백래시를 제거합니다. 이제 10, 000 배의 배율로 대상 위치 근처에 초점을 맞춥니다. 초점이 맞춰진 이미지로부터의 편차에 따라 6-10미크론의 언더 포커스를 설정합니다.이미징의 경우 선량을 초당 제곱 옹스트롬당 2개의 전자 또는 그 이하로 설정합니다. 전류 밀도에 의해 반사되는 전자 선량을 주시하고 디지털 카메라나 전자 필름으로 이미지를 촬영합니다. 다음으로, 2도에서 4도씩 음의 60도에서 양의 60도까지 기울기 이미지를 수집합니다.가능하면 현미경의 자동화된 기능을 사용하십시오. 상용 소프트웨어 패키지를 열고 단층 촬영 복원을 위한 틸트 이미지를 로드합니다. 그런 다음, 명령 tif2mrc 또는 newstack을 사용하여 개별 이미지에서 이미지 스택 파일을 만듭니다.그런 다음 eTomo GUI 소프트웨어를 시작하고 픽셀 크기, 기준 직경, 이미지 회전 등에 대한 이미지 매개변수를 입력합니다. 따라서 편집 스크립트를 만듭니다. 이제 제안된 소프트웨어를 사용하여 기준 마커를 사용하여 정렬되고 평균 잔류 오차가 0.5 미만인 기울기 시리즈를 생성합니다.마지막으로, SIRT 알고리즘을 사용하여 3차원 단층촬영을 복원합니다. 이제 단층촬영에서 관심 영역을 추출하고 비등방성 확산 필터, 양측 필터 또는 수학적 형태학 필터와 같은 잡음 제거 필터를 적용합니다. 이미지 대비를 향상시키는 파라미터를 사용하여 필터링을 수행합니다.다음으로, 관심 있는 기능을 분류합니다. 슬라이싱 기능을 사용하여 단층 촬영을 엽니다. 그런 다음 Segmentation Editor 창으로 이동하여 새 레이블 필드를 선택하여 세분화 파일을 만듭니다.그런 다음 첫 번째 슬라이스에서 관심 있는 기능의 테두리를 수동으로 추적한 다음 다른 슬라이스 각각을 추적합니다. 동일한 작업을 사용하여 관심 있는 추가 기능을 추가할 수 있습니다. 이제 SurfaceGen 메뉴의 옵션을 사용하여 세그먼트화된 볼륨을 시각화하는 표면 렌더링을 생성하려면 SurfaceView 메뉴를 선택합니다.3D 볼륨을 이동, 회전 및 확대/축소하려면 3D 뷰어 창의 도구를 사용합니다. 자동 분할은 Magic Wand Tool을 사용하여 수행할 수 있습니다. 개체를 클릭하고 디스플레이 및 마스킹에서 슬라이더를 조정하여 개체의 기능이 완전히 선택되도록 합니다.정밀한 동기 배양에서 Hoechst로 표지된 DNA는 어두운 상태에서 정상적인 균일한 분포를 보인 다음 광기 동안 세포 내에서 점진적으로 압축되어 광기가 끝날 때까지 물결 모양의 막대 같은 구조를 취합니다. 마지막으로, 간상체는 중앙에서 분열하고 두 부분은 딸세포로 분포합니다. 세포 분열 후 압축된 DNA는 즉시 사라지고 DNA는 정상적인 균일한 분포로 돌아갑니다.DNA 압축의 마지막 단계에 있는 세포를 고전압 전자 현미경으로 동결하고 관찰했을 때, 많은 세포가 정상 세포와 쉽게 구별되는 뚜렷한 DNA 압축(DNA compaction)을 보여주었습니다. 일부는 세포 분열 전에 예상했던 대로 세포 중심에서 수축을 보였습니다. 3D 단층촬영(tomograms)을 통해 소형 DNA는 세포질에서 눈에 띄게 분리되어 있으며 저밀도 물질로 둘러싸여 있습니다.틸라코이드 막층은 압축된 DNA의 물결 모양 막대를 따라 왜곡되어 있습니다. 흥미롭게도, 많은 작은 인산염체가 압축된 DNA에 달라붙어 보통 쌍으로 나타납니다. 이러한 폴리인산염체는 DNA 합성을 위한 인산염의 공급자일 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 염색과 같은 추가 처리 없이 초저온 고전압 전자 현미경을 통해 적절한 시점에 살아있는 상태에 가까운 전체 박테리아 세포의 미세 구조를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 DNA 압축 상태는 광 주기가 끝날 때 매분마다 변한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 샘플을 동결하기에 가장 좋은 타이밍을 놓치지 않도록 하십시오.이 절차에 따라 압축된 DNA에서 특정 단백질 또는 뉴클레오티드의 국소화에 대한 추가 질문에 답하기 위해 CLEM과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 미생물학 분야의 연구자들이 박테리아 또는 작은 진핵생물의 세포 분열, DNA 분리 및 바이러스 감염을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

출처: Biller, SJ, et al. 시아노박테리아 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 음성 염색을 통해 투과 전자 현미경을 위한 시아노박테리아 세포외 소포를 준비하여 구조 및 비교 분석을 위해 소포 형태, 크기 및 순도를 고해상도로 시각화하는 방법을 보여줍니다.

투과전자현미경을 이용한 시아노박테리아 세포외소포의 시각화

출처: Murata, K. et. al., 고전압 극저온 전자 단층 촬영에 의한 시아노박테리아의 DNA 압축 시각화. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 일주기 조절 DNA 압축을 연구하기 위해 명암 주기 하에서 시아노박테리아의 동시 배양을 보여줍니다. 형광 현미경은 정의된 시점에서 응축된 DNA를 밝혀 집단 전체의 세포 주기 정렬을 확인합니다.

시아노박테리아 배양 동기화 및 명암 주기에 의해 구동되는 DNA 압축

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

배우세요 고전압 냉동 전자 단층 촬영을 이용한 시아노박테리아 DNA 압축 시각화 방법입니다. 형광 현미경과 냉동 전자 단층 촬영으로 세포 주기 동안 DNA 구조 변화를 관찰할 수 있습니다.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

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