높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

이 방법은 박테리아의 세포주기 동안 DNA 구조가 어떻게 변화하는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 추가 처리 없이 적절한 시점에서 살아있는 상태에 가까운 전체 박테리아 세포의 미세 구조를 시각화할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 박사후 연구원인 Chihong Song과 Dr.Kaneko 연구실의 대학원생인 Mako Hayashi가 절차를 시연할 것입니다.

1.5%의 한천과 0.3%의 티오황산나트륨을 함유한 9cm의 멸균된 BG-11 플레이트에서 시아노박테리아를 배양하는 것으로 시작합니다. 섭씨 23도에서 12-12 광주기로 플레이트를 초당 평방 미터당 50 마이크로 E의 빛으로 배양합니다. 세포를 유지하려면 매주 새로운 BG-11 한천 플레이트로 옮기십시오.

일주일 이내에 문화권이 녹색 띠로 나타납니다. 화염 멸균 루프를 사용하여 세포의 녹색 덩어리를 옮기고 새 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. DNA 압축을 관찰하려면 광주기가 끝날 때 6일 동안 배양된 세포를 수집합니다.

플레이트에서 세포를 분리하려면 0.2몰 자당 1ml를 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 용액이 녹색으로 변할 때까지 자당 첨가 및 제거를 반복합니다. 색상 변화는 대부분의 셀이 해제되었음을 나타냅니다.

이제 500마이크로리터의 부유 세포 용액을 마이크로분리 튜브로 옮기고 Hoechst 염색을 추가하여 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 세포를 어두운 곳에서 10분 동안 배양한다. 다음으로, 세포를 스핀 다운하고 상층액을 버리고 10 마이크로 리터의 0.2 몰 자당에 재현탁시킵니다.

다음으로, 현탁액 1마이크로리터를 유리 슬라이드로 옮기고 커버 슬립을 착용한 다음 UV 필터가 장착된 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 100배 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 대부분의 세포에서 관찰할 수 있는 DNA 압축의 증거를 찾습니다. 먼저 급강하 냉동 장치를 준비합니다.

그런 다음 에탄 용기와 냉각봉 부착물을 삽입하여 액체 질소 용기를 설정합니다. 다음으로 용기에 액체 질소를 채우고 액체 질소 온도로 냉각합니다. 그런 다음 용기에 에탄 가스를 적재하십시오.

액체 에탄은 폭발성이 있으므로 보안경을 착용하십시오. 마지막으로 냉각 막대 부착물을 제거하고 용기를 플라스틱 뚜껑으로 덮어 서리가 끼지 않도록 합니다. 계속 진행하려면 플라즈마 이온 장벽을 사용하여 50밀리암페어에서 30초 동안 탄소 코팅된 EM 그리드의 탄소 측을 글로우 방전합니다.

그런 다음 테스트 프로토콜에 따라 Vitrobot을 준비합니다. 핀셋을 사용하여 전처리된 EM 그리드를 챔버로 설정합니다. 샘플을 적용하기 전에 1마이크로리터, 15나노미터 BSA 금 추적자로 EM 그리드를 처리하여 기준 마커 역할을 합니다.

이제 2.5마이크로리터의 세포 현탁액을 그리드에 분취합니다. 여과지를 사용하여 과도한 용액을 닦아내고 즉시 그리드를 액체 에탄으로 동결합니다. 검사할 수 있을 때까지 동결된 그리드를 액체 질소에 보관하십시오.

그런 다음 HVEM을 시작하고 1메가볼트의 고전압으로 설정합니다. 그런 다음 액체 질소를 사용하여 시편 그리드 홀더를 섭씨 영하 150도까지 냉각합니다. 냉각이 완료되면 동결된 그리드를 냉각된 극저온 표본 홀더에 장착하고 HVEM에 로드합니다.

설정이 얼음으로 오염되지 않도록 주의하십시오. 이제, 1, 000 배의 낮은 배율에서 이미징 영역을 선택하십시오. 그런 다음 유센트릭 Z축 높이를 조정하고 시편 스테이지를 음의 60도로 기울입니다.

그런 다음 틸팅 회전의 백래시를 제거합니다. 이제 10, 000 배의 배율로 대상 위치 근처에 초점을 맞춥니다. 초점이 맞춰진 이미지로부터의 편차에 따라 6-10미크론의 언더 포커스를 설정합니다.

이미징의 경우 선량을 초당 제곱 옹스트롬당 2개의 전자 또는 그 이하로 설정합니다. 전류 밀도에 의해 반사되는 전자 선량을 주시하고 디지털 카메라나 전자 필름으로 이미지를 촬영합니다. 다음으로, 2도에서 4도씩 음의 60도에서 양의 60도까지 기울기 이미지를 수집합니다.

가능하면 현미경의 자동화된 기능을 사용하십시오. 상용 소프트웨어 패키지를 열고 단층 촬영 복원을 위한 틸트 이미지를 로드합니다. 그런 다음, 명령 tif2mrc 또는 newstack을 사용하여 개별 이미지에서 이미지 스택 파일을 만듭니다.

그런 다음 eTomo GUI 소프트웨어를 시작하고 픽셀 크기, 기준 직경, 이미지 회전 등에 대한 이미지 매개변수를 입력합니다. 따라서 편집 스크립트를 만듭니다. 이제 제안된 소프트웨어를 사용하여 기준 마커를 사용하여 정렬되고 평균 잔류 오차가 0.5 미만인 기울기 시리즈를 생성합니다.

마지막으로, SIRT 알고리즘을 사용하여 3차원 단층촬영을 복원합니다. 이제 단층촬영에서 관심 영역을 추출하고 비등방성 확산 필터, 양측 필터 또는 수학적 형태학 필터와 같은 잡음 제거 필터를 적용합니다. 이미지 대비를 향상시키는 파라미터를 사용하여 필터링을 수행합니다.

다음으로, 관심 있는 기능을 분류합니다. 슬라이싱 기능을 사용하여 단층 촬영을 엽니다. 그런 다음 Segmentation Editor 창으로 이동하여 새 레이블 필드를 선택하여 세분화 파일을 만듭니다.

그런 다음 첫 번째 슬라이스에서 관심 있는 기능의 테두리를 수동으로 추적한 다음 다른 슬라이스 각각을 추적합니다. 동일한 작업을 사용하여 관심 있는 추가 기능을 추가할 수 있습니다. 이제 SurfaceGen 메뉴의 옵션을 사용하여 세그먼트화된 볼륨을 시각화하는 표면 렌더링을 생성하려면 SurfaceView 메뉴를 선택합니다.

3D 볼륨을 이동, 회전 및 확대/축소하려면 3D 뷰어 창의 도구를 사용합니다. 자동 분할은 Magic Wand Tool을 사용하여 수행할 수 있습니다. 개체를 클릭하고 디스플레이 및 마스킹에서 슬라이더를 조정하여 개체의 기능이 완전히 선택되도록 합니다.

정밀한 동기 배양에서 Hoechst로 표지된 DNA는 어두운 상태에서 정상적인 균일한 분포를 보인 다음 광기 동안 세포 내에서 점진적으로 압축되어 광기가 끝날 때까지 물결 모양의 막대 같은 구조를 취합니다. 마지막으로, 간상체는 중앙에서 분열하고 두 부분은 딸세포로 분포합니다. 세포 분열 후 압축된 DNA는 즉시 사라지고 DNA는 정상적인 균일한 분포로 돌아갑니다.

DNA 압축의 마지막 단계에 있는 세포를 고전압 전자 현미경으로 동결하고 관찰했을 때, 많은 세포가 정상 세포와 쉽게 구별되는 뚜렷한 DNA 압축(DNA compaction)을 보여주었습니다. 일부는 세포 분열 전에 예상했던 대로 세포 중심에서 수축을 보였습니다. 3D 단층촬영(tomograms)을 통해 소형 DNA는 세포질에서 눈에 띄게 분리되어 있으며 저밀도 물질로 둘러싸여 있습니다.

틸라코이드 막층은 압축된 DNA의 물결 모양 막대를 따라 왜곡되어 있습니다. 흥미롭게도, 많은 작은 인산염체가 압축된 DNA에 달라붙어 보통 쌍으로 나타납니다. 이러한 폴리인산염체는 DNA 합성을 위한 인산염의 공급자일 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 염색과 같은 추가 처리 없이 초저온 고전압 전자 현미경을 통해 적절한 시점에 살아있는 상태에 가까운 전체 박테리아 세포의 미세 구조를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 DNA 압축 상태는 광 주기가 끝날 때 매분마다 변한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 샘플을 동결하기에 가장 좋은 타이밍을 놓치지 않도록 하십시오.

이 절차에 따라 압축된 DNA에서 특정 단백질 또는 뉴클레오티드의 국소화에 대한 추가 질문에 답하기 위해 CLEM과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 미생물학 분야의 연구자들이 박테리아 또는 작은 진핵생물의 세포 분열, DNA 분리 및 바이러스 감염을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.