마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

이 절차의 전반적인 목표는 투과성 촉진제의 피내 주입에 의해 유도되는 마우스 진피의 혈관 누출을 측정하는 것입니다. 이 절차는 어떤 분자가 혈관 누출을 자극하거나 억제할 수 있는지, 관련된 신호 경로는 무엇인지와 같은 생체 내 혈관 투과성 조절에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 빠르고 비교적 간단하며 주로 일반적인 실험실 시약과 재료를 사용한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 병리학적 부종이 있는 질병 치료로 확장됩니다. 특히, 연구자들은 이 분석을 사용하여 새로운 분자 표적을 식별하고 비교적 빠르고 간단한 방식으로 혈관 투과성을 억제하는 능력에 대해 관련 약물을 테스트할 수 있습니다. 히스타민 억제제인 피릴아민 말레산염과 에반스 블루 염료를 모두 0.9% 식염수에 넣어 별도의 용액을 준비합니다.

그런 다음 층류 캐비닛에서 작업하고 0.22 마이크로미터 필터를 통과하여 용액을 살균합니다. 30게이지 바늘이 장착된 별도의 1밀리리터 주사기에 두 용액을 로드합니다. 다음으로 마우스를 긁습니다.

그런 다음 머리가 지면을 향하고 복부가 위쪽을 향하도록 마우스를 기울입니다. 마우스의 위치를 잡은 후 복강 내 주사로 체중 1g당 10마이크로리터의 피릴아민 말레산염 용액을 투여합니다. 다음으로, 혈관 확장을 촉진하기 위해 마우스를 섭씨 37도의 가열 챔버에 10분 동안 놓습니다.

그런 다음 마우스를 마우스 고정 장치로 이동합니다. 다음으로, 추가 혈관 확장을 위해 70% 에탄올로 꼬리를 문지릅니다. 100마이크로리터의 Evans Blue Dye 용액을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사합니다.

출혈을 방지하기 위해 손가락과 엄지 손가락 사이의 꼬리를 빠르게 잡고 주사 부위에 압력을 가합니다. 마우스의 꼬리 정맥에 Evans Blue Dye를 정맥 주사하는 것은 이 절차에서 어렵고 중요한 단계입니다. 따라서 연구자는 나머지 절차를 진행하기 전에 이 주사를 수행할 수 있는 능력이 있어야 합니다.

역량을 확립하려면 사전 연습이 필요합니다. 인산염 완충 식염수의 멸균 용액을 사용하여 VEGF 시약을 희석하여 최종 투여 부피가 20마이크로리터가 되도록 합니다. 그런 다음 VEGF 투과성 유도 시약과 차량 제어 장치를 31게이지 바늘이 장착된 두 개의 별도 300마이크로리터 주사기에 로드합니다.

바늘을 피부와 15도 각도로 유지하고 VEGF 20마이크로리터를 마우스 측면에 피내 주입합니다. 성공적인 주입을 확인하기 위해 피부 내에서 융기된 거품을 찾습니다. 최소 1cm 떨어진 두 개의 추가 부위에 피내 주사를 수행합니다.

그런 다음 마우스를 돌려 두 번째 측면을 노출시키고 차량 용액으로 삼중 분사를 반복합니다. 종이에 각 주입 부위와 주입 절차가 종료된 시간에 대한 기록을 유지하십시오. 그런 다음 마우스를 홈 케이지로 옮깁니다.

마우스가 의식을 되찾고 케이지 주위를 움직이기 시작할 때까지 계속 모니터링합니다. VEGF 솔루션이 마우스를 호출하기 전에 20분 동안 작동하도록 합니다. 이 단계에서 동일한 절차에 따라 모든 마우스에 VEGFA와 비히클을 순차적으로 주입합니다.

20분 후, 안락사된 쥐를 각각 등에 눕히고 깨끗한 티슈로 감싼 코르크 판자에 발을 고정합니다. 다음으로, 뭉툭한 가위를 사용하여 하복부에서 죽은 쥐의 가슴까지 3-4cm 길이의 수직 절개를 만듭니다. 그런 다음 집게와 메스를 사용하여 옆구리 양쪽의 피부를 놀립니다.

메스를 사용하여 누출 부위 주변 영역에 존재하는 지방을 제거하십시오. 그런 다음 집게와 메스를 사용하여 누출된 Evans Blue Dye로 피부 부위를 절제합니다. 절제된 피부 부위는 비슷한 크기여야 합니다.

피부 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 그에 따라 라벨을 붙입니다. 열린 튜브를 열 블록에 밤새 넣어 샘플을 건조시킵니다. 건조가 완료된 후 250마이크로리터의 탈이온화 포름아미드를 흄 후드의 샘플에 추가합니다.

튜브의 뚜껑을 닫고 밤새 열 블록에 넣어 Evans Dye를 추출합니다. 벤치탑 원심분리기에서 10, 000g 이상의 샘플을 40분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 원심분리된 샘플에서 각 염료 함유 상등액 100마이크로리터를 흄 후드에서 작동하는 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.

분광 광도계를 사용하여 Evans Blue 흡광도를 읽습니다. VEGF에 의해 유도된 혈관 누출을 연구하기 위해 마우스는 인산염 완충 식염수에 50나노그램의 VEGFA를 주입하거나 비히클로 인산염 완충 식염수만 주입합니다. 이 이미지는 차량 현장 제어와 비교하여 VEGFA를 주입한 피부 샘플에서 누출된 Evans Blue Dye의 축적이 증가한 것을 보여줍니다.

이 96웰 플레이트 이미지는 피부 샘플에서 포름아미드로 추출된 로드된 Evans Blue Dye를 보여줍니다. 이 그래픽 플롯은 쌍을 이룬 VEGFA 및 차량 전용 제어 샘플의 정규화된 흡광도 값을 표시합니다. 이 그래프는 50나노그램의 VEGFA를 주입하면 차량에만 비해 Evans Dye의 누출이 크게 증가한다는 것을 보여줍니다.

이 그래프는 차량 샘플에 대한 VEGFA의 광학 밀도의 접힘 변화를 정량화한 후 얻은 것입니다. 이 그래프는 VEGFA를 투여한 후 차량만 투여한 것과 비교하여 혈관 누출이 평균 3배 증가했음을 보여줍니다. 일단 숙달되면이 기술의 주요 부분은 적절하게 수행하면 2 시간 안에 완료 할 수 있습니다.

이 절차를 수행하는 동안 비특이적 혈관 누출 및 마우스 간의 변동을 설명하기 위해 제제 유도 혈관 누출을 차량 유도 혈관 누출로 정규화하는 것이 중요합니다. 이 절차는 단백질이 혈관 투과성을 억제하기 위해 표적이 될 수 있는지 여부와 같은 질문에 답하기 위해 약물 투여와 같은 다른 방법과 결합할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈관 생물학 분야의 연구자들이 혈관 누출에 필요한 주요 신호 구성 요소를 식별하는 유전자 변형 마우스에서 혈관 과투과성의 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마우스 진피에서 혈관 누출을 유도하고 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.