Name: 마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 쥐 피부 혈관 투과성 측정 방법을 통한 혈관생물학 연구. Evans Blue 염료와 분광광도계를 활용하여 혈관 누출을 정량 분석하고 치료 표적을 식별합니다.

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우리는 라 Denti 감사, 발 렌 세와 직원에 대 한 안과의 UCL 학회에 생물 자원 단위의 기술 지원에 대 한 마우스 축산와 카밀 Charoy 도움이. 이 작품은 의료 연구 위원회 그랜트 (미스터/N011511/1) C. Ruhrberg와 jt는 가슴 앓이 (FS/13/59/30649)에 영국 심장 재단 박사 재학에 지원 됩니다.

모든 동물 작품 영국 홈 오피스 및 기관 동물 복지와 윤리적 검토 바디 (AWERB) 지침에 따라 수행 되었다.
1. 마우스 준비
참고: 6 개월 최대 최소 8 주 나이의 성인 쥐에 실험을 수행 합니다. 기술 재현성 및 다른 동물 사이이 절차의 각 단계에 대 한 일관 된 타이밍을 설명 하기 위하여 각 실험 세션 6 쥐의 2의 최소값 및 최대값을 사용 합니다. 유전자 변형된 마우스에 침투성 유도 물질에 돌연변이의 효과 평가 하려면 이상적으로, 2 돌연변이 생쥐 및 실험 당 2 littermate 제어를 사용 합니다.
<ol><li>자극 혈관 hyperpermeability, 전에 24 h anesthetize 적합 한 흡입 isoflurane 등 마 취를 사용 하 여 마우스. 마 취 유도 3 %isoflurane 사용 하 여 righting 반사 손실 되 고 마우스 외부 자극에 응답 하지 않는 때까지. 1.5 %isoflurane 마 취 유지 보수에 대 한 사용 (마우스 지속적인 호흡 속도 보장). 마 취, 신중 하 게 두 측면 각 마우스의 피부에 상해를 피하는 전기 면도기, 쉐이브. 참고: 마 취 동물에 스트레스를 초래 하지 않도록 하 고 면도, 피부 손상 될 수 있습니다 동안 움직임을 최소화 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>그것의 집 감 금 소를 면도 마우스를 반환 합니다. 남성 쥐에 대 한 각 남자에 배치는 개별 케이지 방지 하기 위해 마 취 회복 후 싸움 하 고, 따라서, 피부 손상. 여성 쥐에 대 한 반환 그들 그룹에 그들의 집에 감 금 소에. 참고: 싸우는 행동 장에, 남성 쥐 사이에서 관찰 되는 경우 절차를 하기 전에 그들을 분리 개별 연습장으로 피부 손상이 치유 수 있도록 실험 하기 전에 3 일 동안.</li>
	<li>그들은 (일반적으로 몇 초 이내)의 식을 복구할 때까지 이동 (1 분) 이내 케이지 쥐를 모니터링 합니다.</li>
</ol>2. 에반스의 주사 파랑 염료
<ol><li>층 류 캐비닛, 히 스타 민 억제제 pyrilamine maleate (4 µ g / µ L 0.9% 식 염 수에) 그리고 에반스 블루 염료 (0.9% 식 염 수에 1 %w / v)의 별도 살 균 솔루션을 준비 합니다. 22 µ m 필터를 통해 솔루션을 전달 하 여 소독.</li>
	<li>30g 바늘으로 살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 intraperitoneally 10 µ L pyrilamine maleate 솔루션/그램의 몸 무게 (그림 1A)와 각 마우스를 주입. 수행 하 주입, 첫 번째, 아저씨는 마우스 고 머리는 땅으로 감독 하 고 복 부 위쪽으로 지시 된다 다음 그것을 기울이기. 방광을 타격을 피하기 위해 중간에서 복 부의 더 낮은 사분면에 주사. 참고: 8 주 및 6 개월의 나이 사이 마우스의 무게 보통 15와 30 g. Pyrilamine maleate 사이의 범위 것입니다 억제 혈관 누설 테스트 에이전트에 독립적으로 추진 그렇지 않으면 것 내 인 성 히 스타 민 방출.</li>
	<li>혈관 확장을 촉진 10 분 동안 37 ° C 열 챔버에 마우스를 놓습니다. 또는 열 램프의 사용은 로컬 윤리 지침에서 허용 하는 경우 혈관 확장을 촉진 하는 꼬리에 초점을 맞춘 적당 한 열 램프를 사용 합니다.</li>
	<li>마우스 restrainer를 한 번에 한 마우스를 이동 하 고 70% 에탄올 주입 영역을 청소 하 고 혈관을 더욱 촉진에 꼬리를 문 지 르 세요.</li>
	<li>30g 바늘으로 살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 100 µ L를 관리할 에반스 블루 염료 (그림 1B) 꼬리 정 맥을 통해 정 맥. 출혈을 방지 하기 위해 엄지 손가락 사이 꼬리를 눌러 압력 사출 사이트에 즉시 적용 됩니다. 참고: 시각화의 꼬리 정 맥 주입 영역에 등불을 연출 하 여 개선할 수 있습니다. 마우스 꼬리 정 맥에 정 맥 주사를 수행에 더 세부 사항 게시 프로토콜18에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>30 분 순환 하는 염료를 허용 합니다.</li>
</ol>3. 자극 관 Hyperpermeability
<ol><li>층 류 캐비닛에 살 균 솔루션을 사용 하 여, 마지막 복용량 20 µ L의 볼륨에 전달 될 수 있는 농도에 대 한 관심의 침투성 유도 에이전트 희석. 참고: VEGFA에 PBS, µ 2.5 ng/L의 농도에서 혈관 hyperpermeability를 자극 하는 그림 1-그림 2에 표시 된 예제에서는 실험에서 저조한 50 ng, 그리고 PBS의 총 복용량 사용 됩니다 차량 제어로.</li>
	<li>31 G 바늘으로 2 별도 살 균 300 µ L 주사기를 관심 및 차량 제어의 침투성 유도 에이전트를 로드 합니다. 로드를 3 중에서 솔루션의 20 µ L 각 마우스 주입 충분 한 솔루션 (즉, 바늘의 죽은 볼륨에 대 한 계정에 에이전트와 마우스, 플러스 추가 볼륨 당 차량 60 µ L 준비).</li>
	<li>Isoflurane (마 취 유도 righting 반사 손실 되 고 마우스 외부 자극에 응답 하지 않는 때까지 3%와 1.5% 마우스 지속적인 호흡 속도 확인 하 고 마 취 유지 보수에 대 한) 테스트를 첫 번째 마우스 anesthetize</li>
	<li>Intradermally 마우스 (그림 1C)의 측면에 침투성 홍보 에이전트의 20 µ L를 삽입할. 바늘을 피부에 15 °의 각도에서 인지 확인 합니다. 성공적인 주입을 나타내는 피부 내 제기 거품의 형성에 대 한 확인 하십시오. 2 추가 사이트는 최소 1 c m 간격에 피부 주입을 반복 합니다.</li>
	<li>2 측면을 노출 하 고 반복 제어 차량 솔루션 triplicate 주사 마우스를 설정 합니다. 피부 샘플의 후속 컬렉션에 대 한 그들의 id를 촉진 하기 위하여 각 사출 사이트의 위치 종이에 기록 합니다. 참고:이 단계; 주의 마우스 피부 처리 예를 들어 피부 피부 주사를 수행할 때 곤란 하 게 하지 마십시오.</li>
	<li>주입 된 마우스의 홈 케이지를 반환 하 고 의식 (일반적으로 몇 초 이내) 복구 하 고 감 금 소의 주위에 이동 될 때까지 마우스를 모니터링.</li>
	<li>최초의 마우스, 복구 하는 동안 즉시 단계 3.3 두 번째 마우스와 함께 3.5에 (최대 세션 당 극대로 6 쥐)를 반복 합니다. 다음 단계를 진행 하는 시간을 조정 하려면 각 마우스 주입 했다 시간의 기록을 유지.</li>
</ol>4. 진 피 내에서 축적 된 에반스 블루의 정량화
<ol><li>쥐 주입 했다 순서 관찰 피부 주사 받은 후 자 궁 경부 전위 20 분 여 각 마우스를 컬링 합니다. 참고: 혈관 누설의 기간 사용 하 고, 침투성 유도 에이전트에 따라 다를 수 있습니다 그리고, 그러므로, 피부 주입 및 학살 사이의 시간 최적화 할 수 있습니다.</li>
	<li>각 장소는 그것의 뒤에 코르크 보드에 그것의 발 (그림 1D) 깨끗 한 휴지로 싸서 핀 마우스를 잡아가고.</li>
	<li>무딘가 위를 사용 하 여, 죽은 마우스의 가슴까지 아랫에서 약 3-4 cm의 수직 절 개를 확인 합니다. 포 셉, 메스 피부 안쪽의 진 피와 에반스 블루 축적 (그림 1E)의 사이트에 두 측면에서 멀리 애타게. 그리고 느슨한 피부 아래 핀 메스와 누설 사이트 주위 지역에서 지방을 제거. 필요한 경우 피부에 에반스 블루 누설의 크기를 설명 하는 대표적인 사진을 찍어.</li>
	<li>포 셉, 메스를 사용 하 여 구성 된 각 사이트에 대 한 유출된 에반스 블루 염료 소비 세 피부 지역 침투성 유도 에이전트 또는 차량 주입. 참고: 비슷한 크기, 후속 단계 4.7에 formamide 볼륨의 유사한 부분 이다 흡착 될 나머지 formamide의 비슷한 볼륨에 희석 추출 된 염료를 수 있도록 각 피부 샘플 되도록 피부 영역을 삭제할 주의 . 3.5 단계에서 기록 된 주입 지도 excised 될 영역을 정의 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 각 샘플을 배치 하 고 튜브의 하단에 달려있다 각 샘플 확인 하 고 그에 따라 분류. 추가 사용까지 20 ° C에서-샘플을 저장 합니다. 즉시 처리 하는 경우 아래 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>오븐에서 또는 55 ° c.에가 열 블록의 우물에 오픈 튜브를 배치 하 여 피부 샘플을 밤새 껏 말리</li>
	<li>에반스 파란색 염료를 추출 하는 증기 두건에서 샘플을 이온된 formamide의 250 µ L를 추가, 튜브. 피부 샘플 들은 모두는 formamide 고 오븐 또는 55 ° c.에가 열 블록에서 밤새 품 어 다는 것을 확인합니다</li>
	<li>샘플 최대 속도로 벤치탑 원심 분리기에 원심 (> 10000 x g) 40 분.</li>
	<li>증기 두건에서 투명 하 고, 평평한 바닥 96 잘 접시 (그림 2A)의 별도 우물에 염료를 포함 하는 상쾌한의 100 µ L 각 샘플에서 전송.</li>
	<li>측정 최대 620에서 흡 광도 에반스 블루 nm 740의 참조 독서는 분 광 광도 계에 nm. 참고: 620 nm는 피크의 에반스 블루 흡 광도, 동안 740 nm 에반스 블루 흡수 되지 및 참조 파장 역할.</li>
	<li>기술 변화 (그림 2B)에 대 한 계정에 동일한 에이전트 또는 각 마우스에 대 한 차량 triplicate 주사의 흡 광도 신호 평균.</li>
	<li>차량 제어 (그림 2C) 대 침투성 유도 에이전트에서 판독의 배 차이 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언에 전혀 상반 되는 관심사를 있다.

195217에 그것의 첫 번째 설명, 이후 마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 분자 메커니즘을 공부에 대 한 비교적 간단, 신속 하 고 안정적인 방법으로 연구자를 제공 하고있다. 예를 들어 마일 분석 결과 능력 또는 다른 대리인의 힘 hyperpermeability19,20,21 을 유도 하거나 hyperpermeability 차단 에이전트8 의 효능을 테스트 하려면 테스트를 사용 되었습니다. ,2223. 또 다른 예로 혈관 침투성을 유발 하는 에이전트 테스트 유전자 변형된 생쥐와 그들의 littermate 컨트롤의 특정 수용 체와 신호 ligand 유도 된 hyperpermeability에 대 한 단백질 시험 요구 사항을 결정 하 응답10,11,12,13,,1415,20,23. 마일 분석 결과의 여러 수정된 버전 이후 사용 되고있다, 예를 들어 추적 프로그램 사용에 관하여. 따라서, 에반스 블루는 되었습니다 대체 다른 크기 또는 스피어11,13dextrans 형광 표시와 일부 연구.
조사 관 hyperpermeability 메커니즘에 대 한 다른 분석을 통해 마일 분석 결과의 주요 이점은 이다 그것은 비교적 쉽게 수행 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 또한, 기술로 vivo에서 , 그대로 혈관의 맥락에서이 분석 결과 모델 혈관 누설 통해 누설 측정으로 체 외에 분석 실험 같은 뿐만 아니라 트랜스 유량 분석 실험 또는 트랜스 내 피 전기 저항 ( 내 피 단층에, 전적으로, 초점 TEER) 분석 분석 실험 대체 vivo에서 혈관 hyperpermeability의 hyperpermeability 유도 에이전트에 대 한 다른 배달 경로 사용 하 여 또는 다른 사이트에서 혈관 누설에 대 한 분석 하 여 여기에 설명 된 마일 분석 결과에서 다를 수 있습니다. 폐 나 기관지11,,1315혈관 누설 시험 뒤 꼬리 정 맥을 통해 에이전트의 체계적 전달에 의해 예. 마일 분석 결과의 한 가지 한계는 특정 에이전트의 피부 주입 수 있습니다, 원칙적으로, 또한 혈압과 내 피 장벽 파괴 뿐만 아니라 흐름에 영향을, 따라서, 영향 하지 혈관 침투성도 직접. 그럼에도 불구 하 고,이 분석 결과 최근 표시 되었습니다 측정 혈관 침투성에 의해 유도 된 VEGF-A15조직 혈압 영향을 독립적으로. 마일 분석 결과의 또 다른 한계는 다른 조직에서 혈관 침대 응답 수 있습니다 다르게에 침투성 홍보 요원, 그리고 피부에 마일 분석 결과 함께 결과 않을 수 있습니다, 따라서, 대표, 예를 들어에서 발생의 이다는 폐 또는 두뇌입니다.
동물의 나 이와 체중 누설 마일 분석 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 변수들의 효과 최소화 하기 위해 연구원 littermates를 사용 해야 합니다 또는 마찬가지로 크기 고 컨트롤로 마우스를 세. 관심사의 특정 유전자에 대 한 마우스 돌연변이 평가할 때는 heterozygous heterozygous 번 식 전략 및 wildtype littermates 컨트롤로 사용 대 통해 쥐를 생성 합니다. 또한, 그것은 비 경구 주입24,25통해 관리 일부 마 취 약물에 대 한 설명 하고있다 vasoconstriction을 피하기 위해 isoflurane, 등 신속 하 게 되돌릴 수 가스 마 취약을 사용 하는 것이 좋습니다. 마우스 측면 꼬리 정 맥으로 에반스 블루 염료의 주입이이 프로토콜에서 중요 한 단계 이며, 실험 및 데이터의 품질에 크게 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 연구원은 꼬리 정 맥 주사를 수행할 유능한 이어야 하며 것입니다 가능성이 필요 마일 시험 시작 하기 전에 이전 경험 또는 실험. 또는, 연구원은 에반스 블루, 복고풍 궤도 주입 그들은 그것을 경험 하는 경우 등을 제공 하 다른 정 맥 경로 사용할 수 있습니다. 침투성 추진의 피부 주입 솔루션 에이전트 독립 손상 피부에 발생할 수 있습니다. 따라서, 피부 주사 볼륨에서 20 µ l를 초과 하지 않아야 합니다, 해야 항상 히 스타 민 억제제의 실시 되며 차량 제어 주사 정규화.
마일 분석 결과 사용 되었습니다 많은 연구자에 의해 VEGF A 신호 통로의 예를 들어 구성 요소를 평가 하 VEGF A 유도 혈관 침투성 복수 암 환자16 및 여러 신생의 비전 방해 부 종 때문에 눈 질병7. 따라서, 우리와 다른 사용 마일 분석 결과는 VEGF A 신호 폭포12,13,14, 의 특정 구성 요소 부족 유전자 조작 된 생쥐에서 VEGF A 유도 혈관 누설을 비교 하 15 , 20 , 23.이 방법을 사용 하 여 우리의 최근 연구 결과 밝혀 주요 병 적인 VEGF A isoform, VEGF165, VEGFR2 및 NRP1, NRP1 세포질 도메인 SRC 가족 kinases의 ABL 중재 하는 키 니 아 제 활성화를 촉진 하는의 복잡 한을 통해 신호 14hyperpermeability 응답 보여주고 있습니다. 또한 VEGFA 혈관 성장을 촉진 하 고 따라서 치료 hyperpermeability 활동 특히 저해 될 수 있는 경우 허 혈 성 조직에 혈액 흐름을 복원 하는 데 사용할 수. Elucidating 혈관 hyperpermeability로 혈관 내 피 세포의 VEGF A 응답을 조 타 하는 분자 메커니즘 연구 따라서 병 적인 VEGF A 유도 부 종 억제 하기 위해 선택적으로 조작 될 수 있습니다 경로 식별할 수 있습니다, 에 질병, 암 등 허 혈 성 안과 질환. 마일 분석 결과 의심할 여 지 없이 이들과 많은 다른 유형의 기능 연구 분자 레 귤 레이 터 및 혈관 hyperpermeability의 이펙터를 명료 하 게를 근간에 유용한 방법으로 계속 됩니다.

심장 혈관 시스템의 주요 기능은 순환 및 모든 장기에서 조직 사이의 가스, 영양소, 및 폐기물의 전송을 활성화 하는 것입니다. 혈관 같은 교류1허용 기저 침투성의 기관 특정 수준이 있다. 예를 들어, 신장에 혈관은 혈액 뇌 장벽, 높은 꿰 뚫을 수 없는 인터페이스2,,34를 형성 하는 동안 높은 투과성, 있습니다. 혈관의 내벽을 형성 하는 내 피 세포 순환 및 기본 조직 사이 물리적 방 벽을 제공 하 고 기관 특정 방식으로 혈관 침투성을 조절. 그러나, 특정 자극 기저 레벨1위에 interstitium에 순환에서 액체 넘쳐 흐름을 증가 하는 내 피 방 벽의 부분적인 붕괴를 일으킬. 그런 hyperpermeability는, 예를 들어 조직 외상, 염증, 종양에 사이트에서 동안 관찰 패 혈 증, 신생 질병 또는 뇌와 심장, 눈에 조직 허 혈 뇌졸중 또는 심근 경색, 각각 발생 하는 경우 5 , 6 , 7 , 8. 만성 상승 하는 때 hyperpermeability를 차례로 눈 질환9시력의 손실 등 조직 손상, 부 종, 리드. 따라서, 혈관 hyperpermeability 응답 모델링은 내 피 침투성을 증가 하는 메커니즘을 이해 하 고 이것을 억제 하도록 설계 된 에이전트의 효능을 테스트 하는 것이 좋습니다.
마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 대리 측정으로 혈관 누설에 vivo에서 측정 하는 잘 설립 하 고, 일반적으로 사용 되 고 비교적 간단한 기술입니다. 합성 내 피 장벽 규제, 혈압 이나 혈액의 흐름, 별도로 혈관 누설을 증가 시킬 수 있습니다 요소 계정 고려 하지 않습니다 비록 마일 분석 결과 일반적으로 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공 생각은 물질의 침투성 변조 활동 그들의 활동을 홍보 하는 신호 중재자를 식별. 따라서, 마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 중재자와 행동10,,1112,13, 의 그들의 메커니즘을 식별 하는 다 수의 연구에 필수적인 되었습니다 14,15, 등 혈관 내 피 성장 인자 VEGF A는 VPF16혈관 침투성 요소로 식별 원래 이었다.
원래 마일이 고 기니 피그17혈관 침투성을 공부 하 여 개발 된, 그들의 분석 결과 혈관 침투성의 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 선택의 모델 유기 체 이제는 마우스를 사용 하 여 이후에 적응 했다 유전자 조작의 절묘 한 적합성으로 인해 규정. 간단히, 에반스 블루 염료는 정 맥 성인 쥐에 주입 하 고 30 분 (그림 1)에 대 한 순환 허용. 차량 제어 대 침투성 유도 요원은 intradermally 유도 혈관 누출 (그림 1) 마우스의 측면에 반대에 여러 사이트에 주입 됩니다. 따라서, 알 부 민-바운드 에반스 블루 염료 extravasates 하 고 (그림 1) 진 피에 축적. 마우스를 학살 하는 고통 없이, 후 에반스 블루 진 피에서 추출 되 고 혈관 누출의 레벨 테스트 물질을 차량-유도의 비율로 계산 광학 밀도 (그림 2).

<table><tbody><tr><td>피릴아민 말레산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>PBS에서 재사용</td></tr><tr>탈<td>이온화된 포름아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>연기 찬장에서 사용</td></tr><tr><td>Microlance 바늘 30g x 0.5"</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305106</tr><tr><td>Sterile Plastipak 1ml Luer</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>멸균 MicroFine 시링즈 0.3 ml - 8 mm - 30G&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>324826</tr><tr><td>Evans 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>마우스 억제</td><td></td><td></td><td></td></tr>기 <tr><td>히트 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>헤어 클리퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>메리알</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>무딘 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>코르크 보드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 냉장 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 혈관 내피 성장 인자 165</td><td>릴리아텍</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 hyperpermeability 유도 요원 평가

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

등뼈 동물 유기 체에 있는 혈관 피의 주요 기능은 혈액 세포, 플라즈마 고분자와 물에는 피 내 막의 침투성에 따라 적용할 수 있습니다 그것에 의하여 신체의 각 조직과 혈액 사이 방 벽으로 봉사 하는 생리 적인 필요 합니다. 특정 질병에서 cytokines 및 성장 요인 출시 대상으로 뚜렷이 증가 혈관 침투성; 내 피 장벽 그러나, 그들의 장기간된 존재 만성 혈관 hyperpermeability 그리고 그로 인하여 조직 손상 부 종이 발생할 수 있습니다. 마일 분석 결과 혈관 누설의 프록시 측정을 통해 혈관 hyperpermeability를 공부 하는 연구자를 허용 하는 비보에 기법 이다. 여기, 우리는 포유류 생리학과 병리학 공부에 가장 널리 사용 되는 모델 생물 마우스에서이 절차를 수행 하는 방법에 자세한 프로토콜을 제공 합니다. 절차는 반대 하는 마우스의 옆구리에 침투성 유도 요원 및 차량 제어 솔루션의 여러 피부 주사 뒤 순환 알 부 민을 에반스 블루 염료의 정 맥 주입을 포함 한다. 따라서, 에반스 블루 염료는 점차 진 피로, 그것은 축적 하 고 차량 기준으로 유도 하는 침투성 에이전트에 의해 유도 된 누설으로 정량화에 대 한 추출 될 수 있다 누출. 마일 분석 결과 야생 타입에서 수행할 수 또는 유전자 마우스 모델을 수정 및 약국 혈관 침투성 규제 요원 대상 유도 또는 차단 수 있는 식별 하는 분자 메커니즘 연구와 결합 될 수 있습니다. hyperpermeability입니다.

우리 사용 마일 분석 결과 wildtype C57/Bl6 마우스에서 차량 제어 (PBS)를 기준으로 혈관 누설 유도 VEGF A의 능력을 평가 합니다. 자, 우리 대표 실험 50를 포함 하는 20 µ L 솔루션의 피부 주입으로 자극된 wildtype 마우스를 사용 하 여 보여 VEGF-A PBS 또는 차량 PBS만의 ng. VEGF A 주사 피부 샘플에서 에반스 블루 염료 누설에 명확한 증가 명백한 제자리에 (그림 1E)는 PBS에 비해 formamide (그림 2A)에 염료의 추출 후. 여러 실험의 정량화를 보여줍니다 50 ng VEGF의 크게 더 에반스 PBS 혼자 (그림 2B), 평균 보다 블루 누설 3-fold 혈관 누설 차량 (그림 2C)에 비해 증가 유도.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> 그림 1: 마일 분석 결과에서 혈관 누설 유도. 도식 표현 (상단 패널) 및 해당 이미지 (하단 패널)의 순차적 단계는 마우스에서 마일 시험을 수행할 때. (A) Pyrilamine maleate intraperitoneally (B) 100 µ l 1% 에반스 블루를 꼬리에는 마우스의 정 맥의 정 맥 주입 전에 10 ~ 30 분 내 인 성 히 스타 민의 릴리스를 방지 하기 위해 주입. (C) 30 분 후, 혈관 누설 에이전트의 피부 주입에 의해 유도 된다 (50 ng VEGF-A;의 동그라미를 그린) 차량 제어 (PBS, 흰 동그라미) 대. (D, E) 에반스 블루 축적의 사이트에 액세스 하려면 마우스 피부 주사 후 학살된 20 분 이며 두 측면의 피부를 해 부하 고 쌓. i.p.: 복; i.v.: 정 맥; 아이디: 피부; 스케일 바, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> 그림 2: 혈관 누설 마일 분석 결과에서 정량화. (A) 에반스 블루 염료 흡 광도 분 광 광도 계 독서에 대 한 96 잘 접시에 로드 및 그림 1 에서 각 피부 주입에서 가져온 피부 샘플에서 formamide에서 추출 됩니다. (B, C) 두 유도 하는 침투성 에이전트의 중 (B) 정규화 된 흡 광도 값 (광 밀도, OD) 그려서 여러 실험에서 흡 광도 판독의 그래픽 표현 (VEGF A; 어두운 동그라미를 그린) 및 차량 (PBS; 회색 서클), 또는 (C) 배 세에 차량 대 에이전트에 대 한 변경 (오차 막대: sem의). Triplicate PBS와 (A)에 표시 된 VEGF A 샘플의 흡 광도 수치는 평균 하 고 흰색 또는 녹색 원으로 각각 (B, C)에 표시 된. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

이 절차의 전반적인 목표는 투과성 촉진제의 피내 주입에 의해 유도되는 마우스 진피의 혈관 누출을 측정하는 것입니다. 이 절차는 어떤 분자가 혈관 누출을 자극하거나 억제할 수 있는지, 관련된 신호 경로는 무엇인지와 같은 생체 내 혈관 투과성 조절에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 빠르고 비교적 간단하며 주로 일반적인 실험실 시약과 재료를 사용한다는 것입니다.이 기술의 의미는 병리학적 부종이 있는 질병 치료로 확장됩니다. 특히, 연구자들은 이 분석을 사용하여 새로운 분자 표적을 식별하고 비교적 빠르고 간단한 방식으로 혈관 투과성을 억제하는 능력에 대해 관련 약물을 테스트할 수 있습니다. 히스타민 억제제인 피릴아민 말레산염과 에반스 블루 염료를 모두 0.9% 식염수에 넣어 별도의 용액을 준비합니다.그런 다음 층류 캐비닛에서 작업하고 0.22 마이크로미터 필터를 통과하여 용액을 살균합니다. 30게이지 바늘이 장착된 별도의 1밀리리터 주사기에 두 용액을 로드합니다. 다음으로 마우스를 긁습니다.그런 다음 머리가 지면을 향하고 복부가 위쪽을 향하도록 마우스를 기울입니다. 마우스의 위치를 잡은 후 복강 내 주사로 체중 1g당 10마이크로리터의 피릴아민 말레산염 용액을 투여합니다. 다음으로, 혈관 확장을 촉진하기 위해 마우스를 섭씨 37도의 가열 챔버에 10분 동안 놓습니다.그런 다음 마우스를 마우스 고정 장치로 이동합니다. 다음으로, 추가 혈관 확장을 위해 70% 에탄올로 꼬리를 문지릅니다. 100마이크로리터의 Evans Blue Dye 용액을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사합니다.출혈을 방지하기 위해 손가락과 엄지 손가락 사이의 꼬리를 빠르게 잡고 주사 부위에 압력을 가합니다. 마우스의 꼬리 정맥에 Evans Blue Dye를 정맥 주사하는 것은 이 절차에서 어렵고 중요한 단계입니다. 따라서 연구자는 나머지 절차를 진행하기 전에 이 주사를 수행할 수 있는 능력이 있어야 합니다.역량을 확립하려면 사전 연습이 필요합니다. 인산염 완충 식염수의 멸균 용액을 사용하여 VEGF 시약을 희석하여 최종 투여 부피가 20마이크로리터가 되도록 합니다. 그런 다음 VEGF 투과성 유도 시약과 차량 제어 장치를 31게이지 바늘이 장착된 두 개의 별도 300마이크로리터 주사기에 로드합니다.바늘을 피부와 15도 각도로 유지하고 VEGF 20마이크로리터를 마우스 측면에 피내 주입합니다. 성공적인 주입을 확인하기 위해 피부 내에서 융기된 거품을 찾습니다. 최소 1cm 떨어진 두 개의 추가 부위에 피내 주사를 수행합니다.그런 다음 마우스를 돌려 두 번째 측면을 노출시키고 차량 용액으로 삼중 분사를 반복합니다. 종이에 각 주입 부위와 주입 절차가 종료된 시간에 대한 기록을 유지하십시오. 그런 다음 마우스를 홈 케이지로 옮깁니다.마우스가 의식을 되찾고 케이지 주위를 움직이기 시작할 때까지 계속 모니터링합니다. VEGF 솔루션이 마우스를 호출하기 전에 20분 동안 작동하도록 합니다. 이 단계에서 동일한 절차에 따라 모든 마우스에 VEGFA와 비히클을 순차적으로 주입합니다.20분 후, 안락사된 쥐를 각각 등에 눕히고 깨끗한 티슈로 감싼 코르크 판자에 발을 고정합니다. 다음으로, 뭉툭한 가위를 사용하여 하복부에서 죽은 쥐의 가슴까지 3-4cm 길이의 수직 절개를 만듭니다. 그런 다음 집게와 메스를 사용하여 옆구리 양쪽의 피부를 놀립니다.메스를 사용하여 누출 부위 주변 영역에 존재하는 지방을 제거하십시오. 그런 다음 집게와 메스를 사용하여 누출된 Evans Blue Dye로 피부 부위를 절제합니다. 절제된 피부 부위는 비슷한 크기여야 합니다.피부 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 그에 따라 라벨을 붙입니다. 열린 튜브를 열 블록에 밤새 넣어 샘플을 건조시킵니다. 건조가 완료된 후 250마이크로리터의 탈이온화 포름아미드를 흄 후드의 샘플에 추가합니다.튜브의 뚜껑을 닫고 밤새 열 블록에 넣어 Evans Dye를 추출합니다. 벤치탑 원심분리기에서 10, 000g 이상의 샘플을 40분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 원심분리된 샘플에서 각 염료 함유 상등액 100마이크로리터를 흄 후드에서 작동하는 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.분광 광도계를 사용하여 Evans Blue 흡광도를 읽습니다. VEGF에 의해 유도된 혈관 누출을 연구하기 위해 마우스는 인산염 완충 식염수에 50나노그램의 VEGFA를 주입하거나 비히클로 인산염 완충 식염수만 주입합니다. 이 이미지는 차량 현장 제어와 비교하여 VEGFA를 주입한 피부 샘플에서 누출된 Evans Blue Dye의 축적이 증가한 것을 보여줍니다.이 96웰 플레이트 이미지는 피부 샘플에서 포름아미드로 추출된 로드된 Evans Blue Dye를 보여줍니다. 이 그래픽 플롯은 쌍을 이룬 VEGFA 및 차량 전용 제어 샘플의 정규화된 흡광도 값을 표시합니다. 이 그래프는 50나노그램의 VEGFA를 주입하면 차량에만 비해 Evans Dye의 누출이 크게 증가한다는 것을 보여줍니다.이 그래프는 차량 샘플에 대한 VEGFA의 광학 밀도의 접힘 변화를 정량화한 후 얻은 것입니다. 이 그래프는 VEGFA를 투여한 후 차량만 투여한 것과 비교하여 혈관 누출이 평균 3배 증가했음을 보여줍니다. 일단 숙달되면이 기술의 주요 부분은 적절하게 수행하면 2 시간 안에 완료 할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안 비특이적 혈관 누출 및 마우스 간의 변동을 설명하기 위해 제제 유도 혈관 누출을 차량 유도 혈관 누출로 정규화하는 것이 중요합니다. 이 절차는 단백질이 혈관 투과성을 억제하기 위해 표적이 될 수 있는지 여부와 같은 질문에 답하기 위해 약물 투여와 같은 다른 방법과 결합할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈관 생물학 분야의 연구자들이 혈관 누출에 필요한 주요 신호 구성 요소를 식별하는 유전자 변형 마우스에서 혈관 과투과성의 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 마우스 진피에서 혈관 누출을 유도하고 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Capillaroscopy 직접 microcirculation을 시각화를위한 비 침습적 상대적으로 저렴한 방법입니다. 팔 혈액의 흐름 기술은 내피 기능의 인정 비 침습적 조치를 제공합니다.

Microvascular 및 내피 기능의 비 침습적 평가

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

본 논문은 죽상동맥경화증의 여러 단계를 평가하기 위해 의학 연구에서 일반적으로 사용되는 혈관 기능 및 형태에 대한 몇 가지 비침습적 평가에 대한 방법론적 고려 사항을 설명합니다.

혈관 기능 및 형태의 비 침습적 평가에 대한 방법 론적 접근

modified Landis 기법은 미세관류 기법을 사용하여 통제 및 테스트 조건에서 정상 및 유전자 변형 쥐의 장간막에서 개별 미세혈관의 수압 전도도를 쌍으로 측정할 수 있습니다. 생리학적 조건에서 미세혈관 투과성과 경혈관 교환을 조절하는 메커니즘을 평가하는 편리한 방법을 제공합니다.

Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

이 프로토콜은 마우스에서 분리 된 장 간 막 동맥의 경 벽 등각 장력을 평가 하는 와이어 묘 조 그래피의 사용을 설명 하며, 내 피 세포 및 혈관 주위 지방 조직에서 방출 되는 요인에의 한 변조를 특별히 고려 합니다.

혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

본 프로토콜에서, 턱밑샘(SMG)의 내피 장벽 기능은 이광자 레이저 스캐닝 현미경 하에 생체 내에서 시험 동물 모델의 각 정맥에 상이한 분자 가중 형광 추적자를 주입함으로써 평가되었다.

생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

여기에 제시된 방법은 염색 없이 생체 내에서 혈관신생 또는 혈관 투과성에 대한 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입을 사용하여 신생 혈관 또는 혈관 누출을 시각화합니다.

혈관신생 연구를 위한 수정된 In Vivo Matrix Gel Plug Assay

피내 미세투석은 건강과 질병의 미세혈관 기능을 조사하는 데 사용되는 최소 침습 기술입니다. 용량 반응 및 국소 가열 프로토콜은 모두 피부 순환에서 혈관 확장 및 혈관 수축의 메커니즘을 탐구하기 위해 이 기술에 활용될 수 있습니다.

피내 미세투석: 인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘을 조사하기 위한 접근 방식

본 연구는 연구자들이 마이크로몰딩이라고도 불리는 용매 주조법을 사용해 자체 DMAP 장치를 준비하고 기본적인 특성 분석을 수행할 수 있도록 실용적인 가이드 역할을 하는 것을 목표로 합니다.

용매 주조 기법으로 제조된 용해형 마이크로니들 어레이 패치와 마이크로니들 기반 생체의학적 장치의 필수 특성 분석

배우세요 쥐 피부 혈관 투과성 측정 방법을 통한 혈관생물학 연구. Evans Blue 염료와 분광광도계를 활용하여 혈관 누출을 정량 분석하고 치료 표적을 식별합니다.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

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