살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

이 기술은 단백질 역학 및 조직이 기능적 적응에서 어떤 역할을 하는지와 같은 조절 과정의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 살아있는 세포에서 행해질 수 있다 이다, 그로 인하여 단 하나 분자 수준에 단백질 역동성을 계시하. 이 방법은 원래 미토콘드리아 막 단백질의 시공간 조직에 대한 통찰력을 제공하기 위해 구현되었지만 다른 세포 기관 및 다른 막 단백질에도 적용할 수 있습니다.

이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Timo Appelhans입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포 샘플과 현미경을 transfection하고 준비한 후, PTFE 링과 빨간색 고무 링 사이의 샘플 홀더에 형광 비드가 있는 준비된 샘플을 장착합니다. 현미경, 모든 하드웨어 구성 요소 및 현미경 검사에 필요한 모든 소프트웨어를 시작합니다.

이소프로판올을 뿌린 보푸라기가 없는 새 티슈를 사용하여 대물 렌즈와 커버 슬립 바닥을 청소합니다. 그런 다음 대물 렌즈의 동공에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 다음으로, 비드 샘플이 있는 샘플 홀더를 현미경 스테이지에 놓아 커버 슬립의 바닥이 오일에 닿도록 합니다.

그런 다음 투과광이나 레이저 라인을 사용하여 비드에 초점을 맞춥니다. 두 개의 excitation lasers의 출력을 조정하여 두 형광 채널에서 유사한 신호 밀도를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 뚜렷한 형광 신호가 많은 영역을 검색합니다.

카메라 제어 소프트웨어를 사용하여 형광 채널의 병합된 보기를 생성합니다. 그런 다음 이미지 스플리터의 나사를 사용하여 내부 광학 이미지 스플리터를 수동으로 기울여 두 형광 채널의 신호를 최상의 오버레이로 얻을 수 있습니다. TIRF 현미경 제어 소프트웨어를 시작하고 라이브 스트림 모드에서 개별 채널을 표시하도록 선택합니다.

스냅샷 이미지를 촬영하여 모든 채널에서 형광등을 흥미롭게 만듭니다. 그런 다음 이 이미지를 사용하여 변환 행렬을 생성합니다. 소프트웨어 분석 플러그인을 시작하고 이전에 기록된 형광 비드의 이중 색상 이미지를 소프트웨어에 로드합니다.

형광 채널의 사용된 방향을 선택합니다. 이미지 보정을 요청하면 Yes(예)를 클릭하고 이전에 촬영한 스냅샷을 선택합니다. 단위 관리자를 열어 단위 변환 계수를 정의한 다음 지역화 관리자를 엽니다.

점 확산 함수 또는 PSF를 확인하려면 PSF 반경 버튼을 누릅니다. PSF Estimator 창이 열리면 개구수와 방출 최대값을 정의합니다. 그런 다음 PSF 반경 추정을 클릭합니다.

다음으로, 얻어진 실험적 PSF를 수락합니다. 평가 상자, 디플레이션 루프의 수, 계산에 사용되는 컴퓨터의 코어 수를 정의합니다. 그런 다음 Localize를 눌러 2D 대칭 가우스 함수를 사용하여 단일 입자의 강도 분포를 피팅하기 시작합니다.

캘리브레이션 매니저를 엽니다. 두 채널의 렌더링되고 병합된 이미지에는 원래 신호와 지역화된 중심이 표시됩니다. 아핀 모드를 선택합니다.

그런 다음 동일한 형광 비드에서 유래한 두 채널의 해당 국부적 중심 쌍을 연결 선을 그려서 수동으로 연결합니다. 시야에 분산된 해당 신호를 연결합니다. 그런 다음 Accept를 누르고 변환 행렬을 저장합니다.

미토콘드리아 막 단백질의 단일 분자 이미징을 수행하려면 고무와 PTFE 링 사이에 표본 커버 슬립을 장착합니다. 그런 다음 챔버를 0.5-0.8밀리리터의 이미징 매체로 채웁니다. 대물렌즈와 커버 슬립 바닥을 청소합니다.

그런 다음 투과광이나 레이저 라인을 사용하여 렌즈에 오일 한 방울을 추가한 후 세포에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 두 여기 레이저의 출력을 조정하여 유사한 강도를 달성하고 형광 신호가 많은 영역을 검색합니다. TIRF 현미경 제어 소프트웨어에서 조명 각도를 조정하여 임계각 또는 TIR 모드보다 작은 입사각을 생성하여 HILO 시트를 통해 특정 관심 영역을 자극합니다.

HILO 조명을 사용하여 세포 소기관을 여기시키도록 TIRF 현미경의 조명을 조정하려면 신호 대 배경 비율에 대한 빠른 판단과 TIRF 현미경 검사에 대한 경험, 세포 형태학에 대한 지식이 필요합니다. EM 게인을 설정하고 프레임당 충분한 광자를 수집하는 실험에 적합한 노출 시간을 선택합니다. 그런 다음 높은 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 레이저 출력을 조정하는데, 이 비율은 국소화 정밀도와 직접적으로 일치하기 때문입니다.

세포 주변부에서 겹치지 않는 길쭉한 미토콘드리아 및 단일분자 신호가 있는 영역을 찾습니다. 한 채널 또는 두 채널 모두에서 단일 신호가 보이지 않으면 표백으로 인해 단일 분자 신호가 나타날 때까지 기다립니다. 한 채널만 표백해야 하는 경우 이 채널을 기록하기 전에 표백을 방지하기 위해 다른 채널의 레이저를 끄십시오.

신호 수가 너무 적어 합리적인 연속성을 유지할 수 없을 때까지 기록합니다. 이미징 처리 소프트웨어를 시작하고 최소 1, 000개의 기록된 프레임에 대한 누적 렌더링 합계 이미지를 생성하여 미토콘드리아 구조를 확인합니다. 소프트웨어 분석 플러그인을 시작합니다.

위치추정 및 추적을 위한 데이터 처리를 수행하려면 원시 데이터를 불러옵니다. 여러 가지 색상을 선택합니다. 두 채널의 올바른 방향을 선택합니다.

Calibrate images를 요청하면 변환 행렬을 로드합니다. 채널은 별도로 표시됩니다. Show를 클릭하여 이미지 컨테이너에서 원시 데이터를 엽니다.

그런 다음 상단 탭에서 단위 관리자를 열고 각 채널에서 단위 변환 계수를 정의합니다. 상단 탭에서 현지화 관리자를 열고 평가 상자와 디플레이션 루프 수를 정의합니다. PSF Radius를 클릭하여 PSF 추정기를 엽니다.

개구수와 방출 최대값을 설정하여 이론적인 PSF 값을 구합니다. 수락을 누릅니다. 모든 채널에 대해 이 작업을 반복합니다.

그런 다음 Localize를 눌러 두 채널에서 기록된 신호에 대한 단일 입자 국소화를 시작합니다. 소프트웨어가 완료될 때까지 기다립니다. 이제 각 채널에 대한 초고해상도 이미지가 소프트웨어 분석 플러그인의 이미지 컨테이너에서 얻어집니다.

PINK1은 미토콘드리아 기능을 보장하는 중요한 요소입니다. 기능적 미토콘드리아와 역기능 미토콘드리아에서 Tom20에 대한 PINK1의 국소화를 결정하기 위해 1, 000 프레임의 시계열을 기록했습니다. 한 채널에서 시간이 지남에 따라 모든 신호의 누적 이미지는 PINK1이 정상적인 조건에서는 세포질, 외막 및 미토콘드리아 내부에 국한되어 있지만 우선적으로 탈분극된 미토콘드리아의 외막에 국한되어 있음을 보여주었습니다.

국소화된 입자의 합산 이미지에서 볼 수 있듯이 PINK1은 주로 편광된 미토콘드리아 내부에 분포하는 반면 Tom20은 외부 미토콘드리아 막에 국한되어 있습니다. 이것은 국소화된 Tom20 및 PINK1 입자의 병합 이미지에서 더욱 명확해지며, 이는 외막 단백질 Tom20의 분포가 훨씬 더 광범위함을 보여줍니다. 미토콘드리아 내부의 PINK1 국소화를 확인하기 위해 호흡기 복합체의 30킬로달톤 소단위체를 광활성성 GFP에 융합하고 형광 광활성화 국소화 현미경으로 기록했습니다.

누적 삼색 이미지와 단면 분포는 복합 1과 PINK1의 오버레이를 보여주며, 전체 길이 PINK1의 가져오기를 확인합니다. 이러한 데이터는 PINK1의 하위 집단이 여러 미토콘드리아 미세 구획을 차지한다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 데이터 기록 및 후처리를 포함하여 20시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 소기관 움직임을 테스트하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 단백질의 상대적 국소화를 측정할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 미토콘드리아 단백질의 단일 입자 추적 분야의 연구자들이 Z2 및 다양한 대사 조건 및 스트레스 하에서 미토콘드리아 단백질의 거동을 관찰할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 미토콘드리아 단백질의 이중 컬럼 현미경 검사를 수행하여 미토콘드리아 단백질의 하위 소기관 위치와 이동을 밝히는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.