Name: 살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 배우세요 살아있는 포유류 세포에서 단일 막 단백질의 다색 지역화 현미경 기법을 활용한 방법입니다. 자가표지 단백질을 이용해 약 18nm 해상도로 세포 소기관 내 단백질 역학을 정밀 분석할 수 있습니다.

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저자 생물 물리학 그룹 및 Jacob Piehler Wladislaw 콜 기술 지원 및 자료의 준비에 대 한 지속적인 지원과 사용 하기 위해 현미경을 제공 하기 위한 CellNanOs 보드 나 브루 크의 대학에 감사 하 고 싶습니다. 프로젝트는 SFB 944에 의해 투자 되었다.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
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<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
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<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
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<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
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<li>Elmokadem, A., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drift+Correction+for+Superresolution+Localization+Microscopy+with+Bayesian+Inference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference.</a> Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).</li>
<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 듀얼 컬러 단일 분자 지역화 모바일 막 단백질의 기술을 제시 했다. 다음 프로토콜, 막 단백질 자체 라벨 TMR 및 그들의 각각 기판에 활용 된 선생님 rhodamine 염료와 반응 하는 단백질에 융합 된다. Rhodamine 밝은 photostable 염색 하 고 반복적인 이미징1따라서 허용 합니다. 성공적인 성능에 대 한 여러 조건 및 중요 한 주제 마음에 보관 해야 합니다.
첫째, 그것은 적절 한 필터와 스플리터 TMR 및 각 신호를 명확 하 게 구분을 선택 하는 것이 중요입니다. 배경에서 셀 외부를 줄이기 위해, precleaning 및 PLL-말뚝-RGD와 coverslip의 코팅은 도움이 되었다. 염료-기판의 최종 농도 기판에 대 한 자체 라벨 효소의 선호도 셀 내부 효소의 접근성을 고려 하 여 테스트 되어야 한다. 나노-picomolar 농도에 미토 콘 드리 아 단백질17 및...

이 프로토콜의 목표는 지역화 하 고 단일 막 단백질 라이브 셀 내부를 추적 하는 이미징 방법 제공. 추적 및 지 방화 현미경 검사 법 (TALM)1,2이 메서드를 호출 하 고. 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)3 와 같이 형광 Photoactivation 지역화 현미경 검사 법 ((F) 팜)4,5, TALM 단일 분자 기반 형광 지역화 기술 이다. 그러나, 그것은 동일의 반복적인 이미지와 함께 조합에 있는 막 단백질의 이동성 표시 계시 한다 다른 위치에 분자 microcompartment 모바일 단백질에 대 한 액세스할 수 있는 방식으로 구분 됩니다. 즉, 단백질의 가능한 국부 세포 기관이의 건축 및 단백질1의 이동성에 의해 설정 됩니다. 메서드는 지역화 및 탄도 이미징 모바일 단백질에 의해 지도 계시 한다 때문에 다양 한 다른 슈퍼 해상도 기법6,,78 보완. 라벨은 se 당 비 형광은 유전자 조작된 융해 단백질을 사용 하 여 기반으로 합니다. 이 융해 단백질은 자체 효소 반응 covalently 염료에 활용 된 기판 레이블이 지정 됩니다. 이 절차는 라벨도 될 수 있는 이점이 있다 추가 된 기판의 크기에 의해 제어. 또한, 그것은 선택한 활용된 염료에 따라 형광의 색상을 다양 하 게 있습니다. 여러 자체 라벨 효소-태그는 사용할 수9. 또 다른 장점은, 사용 하는 자체 효소 태그 라벨 활용된 염료를 일반적으로 더 안정적이 고 밝은 형광 단백질1 와 개별 단백질 따라서 기록 될 수 있습니다 더 이상 보다는 더 정확 하 게 때까지 그들은 표백. 모바일 단백질의 궤적의 녹음 및 확산 계수10,11의 추출에 대 한 수 있습니다.
여기, 우리는 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, TALM의 타당성 입증 하지만 그것은 또한 다른 세포 유형12,13를 포함 하 여 다른 내부 및 여분 cellular 막 단백질에 적용할 수 있습니다. 우리 다 색 TALM 추가 기존 슈퍼 해상도 형광 현미경 검사 법 기술14,15, 보완성에 다른 subcompartments에 있는 단백질의 동시 구별에 대 한 허용 표시 16. TALM 라이브 셀 이미징17와 호환 됩니다. 사진-물리학 선택한 rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR)와 실리콘-Rhodamien (선생님)의 특히 그들의 밝기와 안정성, 수 있게 기록 단일 막 단백질 지역화 (및 궤적) 지도 제공 하는 여러 프레임에 걸쳐. 그러나 모션 블러는 너무 높은 때문에 프레임 마다 수집 된 광자는 적절 한 지역화를 위해 너무 낮은, TALM 높은 확산 계수와 수용 성 단백질의 지역화에 대 한 제한 됩니다. 게다가, TALM phototoxic 효과 감소 예 폭풍 또는 자극 방출 소모 (호텔 위치) 현미경6,7, 보다 전원을 적게 필요 합니다. 이것은 phototoxic 스트레스는 종종 organellar 형태학18 및 따라서 이동성 분석19영향을 때문에 중요 한. 합계에서는, 선물이 살아있는 세포에 다 색 TALM 지역화 현미경 방법 폭풍/호텔 위치 사이의 간격을 채우는 기술 (F) 팜 및 photobleaching 후 단백질 이동성 형광 복구 등을 분석 하는 기법 (졸라)20 / ,21, 형광 상관 분광학 (FCS)22, 그리고 형광 상관 분광학 (FCCS)11,23크로스.

<table><tbody><tr><td>(2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐)-에탄술폰산, 1 M) (HEPES)</td><td>바이오크롬</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1: 이색성 빔 스플리터&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2: Polychroic Mirror, 빔스플리터</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>단종</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 인산염 완충 식염수(PBS) 1x(Ca 및 Ca 제외) Mg)</td><td>시그마-알드리치 & Co.</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>얼&급성; 페놀 레드가 없는 MEM, L-글루타민이 없는 및 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% 알라닐-L-글루타민 및 34.78% 탄산수소나트륨(NaHCO3 0.75g/l)</td><td></td><td></td>을 포함하는 NaHCO3가 없는 MEM 이미징 <td>매체</td></tr><tr><td>Earle&acute; 1% Fetal Bovine Serum Superior(FBS), 0.1% HEPES(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) 및 0.1% 비필수 아미노산(NEAA)</td><td></td><td></td>을 포함하는 페놀이 레드가 포함된 최소 필수 배지(MEM)<td>성장 배지</td></tr><tr><td>EF: 방출 필터 쿼드밴드 패스</td><td>AHF 분석기sentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor Andor</td><td>iXON 897</td><td>EMCCD 카메라</td></tr><tr><td>방출 필터 QuadView 필터 큐브, 주황색</td><td>AHF 분석기technik</td><td>F39-637</td><td>밴드패스 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>방출 필터 QuadView 필터 큐브, 빨간색</td><td>크로마</td><td></td><td>밴드패스 655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (태아 소 혈청) 우수한</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>형광 비드: TetraSpeck&trade; 마이크로스피어, 0.1 &마이크로; m, 형광 블루/그린/오렌지/다크 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>형광 마이크로스피어</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>환자의 경추 암종 세포 Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Hela 세포 CI::p aGFP, stable</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image splitter</td><td>Photometrics</td><td>Dual-View QV2</td><td>이미지 스플리터 방출</td></tr><tr><td>이미징 처리 소프트웨어&nbsp;</td><td>ImageJ2 / 피지</td><td>프리웨어</td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일 - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>561 nm 방출</td></tr><tr><td>레이저 642 nm, 140 mW</td><td>오미크론</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm 방출</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>버전 R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM과 Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, 안정적인 글루타민(PR 없음</td>) <td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM과 Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, 안정 글루타민, Phenolred</td><td>Biochrom</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; 딥 레드 FM</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>M22426</td><td>염료</td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; 그린 FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>염료</td></tr><tr><td>멀티모드-광학 편광 유지 모노모드 섬유</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp 폴리머&nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&uuml; bingen</td><td></td><td>coverslip 코팅</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (NEAA)</td> <td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (폴리에틸렌 글리콜) 10 %</td> <td>Carl Roth GmbH</td><td>Art No. 0263.1</td><td>coverslip coating</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>PINK1-Halo7-Tag 발현을위한 플라스미드</td><td>Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신(1.2mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td>고양이. No.P9155</td><td>커버슬립 코팅</td></tr><tr><td>RGD 펩타이드(Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>코어링 시스템 Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td></td><td>커버슬립 코팅 / 인터그린 수용체 모티프</td></tr><tr><td>실리콘 로다민 HaloTag&reg;-리간드(SiRHTL)&nbsp;</td><td>카이 존슨</td><td></td>의 개인 선물 <td>염료</td></tr><tr><td>소프트웨어 분석 플러그인</td><td>자체 작성 C. P. Richter, Biophysik Osnabr&uuml; ck</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸로다만인 / SNAP-Cell&reg; SNAP-Ligand(TMRstar)에 연결된 TMR-Star&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 Biolab&reg;</td><td>S9105S</td><td>염료</td></tr><tr><td>테트라메틸로다민은 HaloTag&reg;-리간드(TMRHTL)와 연결되어 있습니다.</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td>염료</td></tr><tr><td>TIRF 응축기</td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO 시스템</td><td>TIRF 응축기</td></tr><tr><td>TIRF 현미경 제어 소프트웨어</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>150x 오일 대물렌즈(N.A. 1.45; Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>물 H2O 99,5 % Rotipuran&reg; 낮은 유기농&nbsp;</td><td>칼 로스 GmbH</td><td>Art. 아니요. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Subcompartments 세포에 있는 단백질의 지역화에 대 한 지식을 그들의 특정 한 기능을 이해 하는 것이 결정적 이다. 여기, 우리는 지역화를 생성 하 고이 단백질의 지도 추적 하 여 단백질을 위해 액세스할 수 있는 microcompartments의 결정에 대 한 수 있도록 슈퍼 해상도 기법 제시. 또한, 멀티 컬러 지역화 현미경으로 지역화 및 추적 프로필 다른 subcompartments에 있는 단백질의 얻을 수 있습니다 동시에. 기술은 살아있는 세포에 대 한 특정 이며 단일 모바일 막 단백질의 반복적인 이미지에 기반. 관심사의 단백질 유전자 특정, 소위 자체 라벨 태그와 융합 된다. 이 태그는 기판 공유 방식으로 반응 하는 효소. 이러한 기판에 활용 된 형광 염료입니다. 형광과 효소 태그 단백질의 반응 레이블이 단백질에 기판 결과 표시. 여기, Tetramethylrhodamine (TMR)와 실리콘 Rhodamine (선생님)는 효소의 기질에 부착 된 형광 염료로 사용 됩니다. NM 범위에 오후에 기질 농도 사용 하 여 하위 화학 량 론 라벨 이루어집니다 뚜렷한 신호 귀착되는. 이러한 신호 ~ 15-27와 지역화는 nm 정밀도. 기술을은 사용할 수 막 투과성 염료와 효소 레이블이 자체적으로 지정 하는 것이 레 퍼 토리에 의해 색상 수는 제한 하는 의하여 단일 분자의 멀티 컬러 이미징 할 수 있습니다. 우리 품질 관리 효소 (Pten)의 지역화를 결정 하 여 기술의 타당성을 보여줍니다-다른 막 단백질에 관하여 처리 하는 동안 다른 미토 콘 드 리아 구획에 니 1 (PINK1)을 유발. 단일 분자 무서 워 또는 공동 추적에 의해 다르게 레이블이 단일 단백질 간의 진정한 실제 상호 작용에 대 한 테스트는 제한 하지만, 낮은 라벨도 두 개의 인접 한 단백질을 동시에 표시 하는 데에 대 한 확률 감소 때문입니다. 기술은 단백질 막 구획에 이미징에 대 한 강한 동안, 대부분의 경우 높은 모바일 수용 성 단백질의 지역화가 결정 적합 하지 않다.

멀티 컬러 이미징 및 colocalization 분석은 단백질의 하위 organellar 지역화가 결정을 도울 수 있다. 우리가 시연이 이전 cytosolic 인산 가수분해 효소와 tensin homologue, PINK1, 미토 콘 드 리아 프로 테아 제17에 의해 그것의 처리로 인해 다른 하위-미토 콘 드리 아 위치는. PINK1 미토 콘 드 리아 기능34,35보장 하는 중요 한 요소 이다. 처리 (그림 4A), 라이브 셀과 멀티 컬러 슈퍼 해상도 현미경 동안 다른 미토 콘 드 리아 구획에 PINK1 지역화 수행한 결정 합니다. 따라서, PINK1 유전자 자체 라벨 태그 (HaloTag)에 융합 했다. 확인 하려면 그 지역화 기능 및 역 기능 mitochondria에서...

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

이 기술은 단백질 역학 및 조직이 기능적 적응에서 어떤 역할을 하는지와 같은 조절 과정의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 살아있는 세포에서 행해질 수 있다 이다, 그로 인하여 단 하나 분자 수준에 단백질 역동성을 계시하. 이 방법은 원래 미토콘드리아 막 단백질의 시공간 조직에 대한 통찰력을 제공하기 위해 구현되었지만 다른 세포 기관 및 다른 막 단백질에도 적용할 수 있습니다.이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Timo Appelhans입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포 샘플과 현미경을 transfection하고 준비한 후, PTFE 링과 빨간색 고무 링 사이의 샘플 홀더에 형광 비드가 있는 준비된 샘플을 장착합니다. 현미경, 모든 하드웨어 구성 요소 및 현미경 검사에 필요한 모든 소프트웨어를 시작합니다.이소프로판올을 뿌린 보푸라기가 없는 새 티슈를 사용하여 대물 렌즈와 커버 슬립 바닥을 청소합니다. 그런 다음 대물 렌즈의 동공에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 다음으로, 비드 샘플이 있는 샘플 홀더를 현미경 스테이지에 놓아 커버 슬립의 바닥이 오일에 닿도록 합니다.그런 다음 투과광이나 레이저 라인을 사용하여 비드에 초점을 맞춥니다. 두 개의 excitation lasers의 출력을 조정하여 두 형광 채널에서 유사한 신호 밀도를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 뚜렷한 형광 신호가 많은 영역을 검색합니다.카메라 제어 소프트웨어를 사용하여 형광 채널의 병합된 보기를 생성합니다. 그런 다음 이미지 스플리터의 나사를 사용하여 내부 광학 이미지 스플리터를 수동으로 기울여 두 형광 채널의 신호를 최상의 오버레이로 얻을 수 있습니다. TIRF 현미경 제어 소프트웨어를 시작하고 라이브 스트림 모드에서 개별 채널을 표시하도록 선택합니다.스냅샷 이미지를 촬영하여 모든 채널에서 형광등을 흥미롭게 만듭니다. 그런 다음 이 이미지를 사용하여 변환 행렬을 생성합니다. 소프트웨어 분석 플러그인을 시작하고 이전에 기록된 형광 비드의 이중 색상 이미지를 소프트웨어에 로드합니다.형광 채널의 사용된 방향을 선택합니다. 이미지 보정을 요청하면 Yes(예)를 클릭하고 이전에 촬영한 스냅샷을 선택합니다. 단위 관리자를 열어 단위 변환 계수를 정의한 다음 지역화 관리자를 엽니다.점 확산 함수 또는 PSF를 확인하려면 PSF 반경 버튼을 누릅니다. PSF Estimator 창이 열리면 개구수와 방출 최대값을 정의합니다. 그런 다음 PSF 반경 추정을 클릭합니다.다음으로, 얻어진 실험적 PSF를 수락합니다. 평가 상자, 디플레이션 루프의 수, 계산에 사용되는 컴퓨터의 코어 수를 정의합니다. 그런 다음 Localize를 눌러 2D 대칭 가우스 함수를 사용하여 단일 입자의 강도 분포를 피팅하기 시작합니다.캘리브레이션 매니저를 엽니다. 두 채널의 렌더링되고 병합된 이미지에는 원래 신호와 지역화된 중심이 표시됩니다. 아핀 모드를 선택합니다.그런 다음 동일한 형광 비드에서 유래한 두 채널의 해당 국부적 중심 쌍을 연결 선을 그려서 수동으로 연결합니다. 시야에 분산된 해당 신호를 연결합니다. 그런 다음 Accept를 누르고 변환 행렬을 저장합니다.미토콘드리아 막 단백질의 단일 분자 이미징을 수행하려면 고무와 PTFE 링 사이에 표본 커버 슬립을 장착합니다. 그런 다음 챔버를 0.5-0.8밀리리터의 이미징 매체로 채웁니다. 대물렌즈와 커버 슬립 바닥을 청소합니다.그런 다음 투과광이나 레이저 라인을 사용하여 렌즈에 오일 한 방울을 추가한 후 세포에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 두 여기 레이저의 출력을 조정하여 유사한 강도를 달성하고 형광 신호가 많은 영역을 검색합니다. TIRF 현미경 제어 소프트웨어에서 조명 각도를 조정하여 임계각 또는 TIR 모드보다 작은 입사각을 생성하여 HILO 시트를 통해 특정 관심 영역을 자극합니다.HILO 조명을 사용하여 세포 소기관을 여기시키도록 TIRF 현미경의 조명을 조정하려면 신호 대 배경 비율에 대한 빠른 판단과 TIRF 현미경 검사에 대한 경험, 세포 형태학에 대한 지식이 필요합니다. EM 게인을 설정하고 프레임당 충분한 광자를 수집하는 실험에 적합한 노출 시간을 선택합니다. 그런 다음 높은 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 레이저 출력을 조정하는데, 이 비율은 국소화 정밀도와 직접적으로 일치하기 때문입니다.세포 주변부에서 겹치지 않는 길쭉한 미토콘드리아 및 단일분자 신호가 있는 영역을 찾습니다. 한 채널 또는 두 채널 모두에서 단일 신호가 보이지 않으면 표백으로 인해 단일 분자 신호가 나타날 때까지 기다립니다. 한 채널만 표백해야 하는 경우 이 채널을 기록하기 전에 표백을 방지하기 위해 다른 채널의 레이저를 끄십시오.신호 수가 너무 적어 합리적인 연속성을 유지할 수 없을 때까지 기록합니다. 이미징 처리 소프트웨어를 시작하고 최소 1, 000개의 기록된 프레임에 대한 누적 렌더링 합계 이미지를 생성하여 미토콘드리아 구조를 확인합니다. 소프트웨어 분석 플러그인을 시작합니다.위치추정 및 추적을 위한 데이터 처리를 수행하려면 원시 데이터를 불러옵니다. 여러 가지 색상을 선택합니다. 두 채널의 올바른 방향을 선택합니다.Calibrate images를 요청하면 변환 행렬을 로드합니다. 채널은 별도로 표시됩니다. Show를 클릭하여 이미지 컨테이너에서 원시 데이터를 엽니다.그런 다음 상단 탭에서 단위 관리자를 열고 각 채널에서 단위 변환 계수를 정의합니다. 상단 탭에서 현지화 관리자를 열고 평가 상자와 디플레이션 루프 수를 정의합니다. PSF Radius를 클릭하여 PSF 추정기를 엽니다.개구수와 방출 최대값을 설정하여 이론적인 PSF 값을 구합니다. 수락을 누릅니다. 모든 채널에 대해 이 작업을 반복합니다.그런 다음 Localize를 눌러 두 채널에서 기록된 신호에 대한 단일 입자 국소화를 시작합니다. 소프트웨어가 완료될 때까지 기다립니다. 이제 각 채널에 대한 초고해상도 이미지가 소프트웨어 분석 플러그인의 이미지 컨테이너에서 얻어집니다.PINK1은 미토콘드리아 기능을 보장하는 중요한 요소입니다. 기능적 미토콘드리아와 역기능 미토콘드리아에서 Tom20에 대한 PINK1의 국소화를 결정하기 위해 1, 000 프레임의 시계열을 기록했습니다. 한 채널에서 시간이 지남에 따라 모든 신호의 누적 이미지는 PINK1이 정상적인 조건에서는 세포질, 외막 및 미토콘드리아 내부에 국한되어 있지만 우선적으로 탈분극된 미토콘드리아의 외막에 국한되어 있음을 보여주었습니다.국소화된 입자의 합산 이미지에서 볼 수 있듯이 PINK1은 주로 편광된 미토콘드리아 내부에 분포하는 반면 Tom20은 외부 미토콘드리아 막에 국한되어 있습니다. 이것은 국소화된 Tom20 및 PINK1 입자의 병합 이미지에서 더욱 명확해지며, 이는 외막 단백질 Tom20의 분포가 훨씬 더 광범위함을 보여줍니다. 미토콘드리아 내부의 PINK1 국소화를 확인하기 위해 호흡기 복합체의 30킬로달톤 소단위체를 광활성성 GFP에 융합하고 형광 광활성화 국소화 현미경으로 기록했습니다.누적 삼색 이미지와 단면 분포는 복합 1과 PINK1의 오버레이를 보여주며, 전체 길이 PINK1의 가져오기를 확인합니다. 이러한 데이터는 PINK1의 하위 집단이 여러 미토콘드리아 미세 구획을 차지한다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 데이터 기록 및 후처리를 포함하여 20시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 소기관 움직임을 테스트하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 단백질의 상대적 국소화를 측정할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 미토콘드리아 단백질의 단일 입자 추적 분야의 연구자들이 Z2 및 다양한 대사 조건 및 스트레스 하에서 미토콘드리아 단백질의 거동을 관찰할 수 있는 길을 열었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 미토콘드리아 단백질의 이중 컬럼 현미경 검사를 수행하여 미토콘드리아 단백질의 하위 소기관 위치와 이동을 밝히는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

multi-color-localization-microscopy-single-membrane-proteins

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

기존의 BODIPY 접합체는 일시성형, 적색 이동 접지 상태 이량체의 착취를 통해 살아있는 세포 단분자 국소화 현미경 검사법(SMLM)에 사용될 수 있습니다. 우리는 나노스코프 길이 척도에서 살아있는 포유류 및 효모 세포에서 세포내 중성 지질과 지방산을 추적하고 해결하기 위해 최적화된 SMLM 프로토콜을 제시합니다.

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

이 프로토콜은 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용한 미토콘드리아 초미세 구조 시각화 및 분석을 위해 배양된 SH-SY5Y 세포 및 일차 쥐 해마 뉴런의 증식, 분화 및 염색을 위한 워크플로우를 제시합니다.

신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

배우세요 살아있는 포유류 세포에서 단일 막 단백질의 다색 지역화 현미경 기법을 활용한 방법입니다. 자가표지 단백질을 이용해 약 18nm 해상도로 세포 소기관 내 단백질 역학을 정밀 분석할 수 있습니다.

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