단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

저의 연구는 T 세포의 막에 초점을 맞추고 있으며, 치료적 표적 지정과 관련된 새로운 나노스케일 통찰을 밝히는 것을 목표로 합니다. 기존 영상 기법은 일반적으로 세포 내 나노스케일 항체-에피토프 상호작용을 직접 시각화하지 않습니다. 이 프로토콜은 세포 환경 내에서 직접 관찰할 수 있게 하여 이러한 한계를 극복합니다.

샘플을 현미경에 장착하고 금 콜로이드를 표면에 증착한 후, 밝은 필드 조명을 사용해 관심 영역에 충분한 콜로이드가 침착되었는지 확인합니다. 진행 전에 관심 영역 내에 이상적인 밀도인 5개에서 10개의 금 콜로이드가 존재하는지 확인하세요. 항체 프로브 형광체의 광학 구성을 위해 영상 소프트웨어를 열고 광학 구성 설정에 접근하세요.

적절한 이색성 미러를 선택하고 레이저 여기 파장과 출력 밀도를 설정하세요. 카메라 통합 시간을 조정하고 방출 필터를 선택하세요. 그 다음 카메라 픽셀 비닝을 150에서 160 나노미터 사이의 픽셀 크기로 설정하세요.

이제 영상 소프트웨어에서 사진 표백 모드를 선택하여 광 표백 단계의 광학 구성을 만듭니다. 레이저 출력을 100%로 설정하고 카메라 통합 시간을 1초로 조정하세요. 이미지 획득 소프트웨어에서 비조명 간격, 프레임 수, 사진 표백 단계의 빈도를 정의하여 영상 파라미터를 설정하세요.

다음으로, DPBS에서 만들어진 5% BSA 200마이크로리터에 CD81 항체를 1마이크로그램/밀리리터 농도로 희석하여 영상 버퍼를 준비합니다. 최종 권장 항체 농도는 Jurkat T 세포의 경우 0.5 나노몰, U-2 OS 세포의 경우 2 나노몰입니다. 준비된 영상 버퍼를 세포가 포함된 웰에 추가하고, 소프트웨어에서 이미지 수집을 시작하여 데이터 수집을 시작합니다.

막 단일 항체 표지용으로 설정된 영상 소프트웨어의 라이브 뷰 기능을 사용하여 항체 결합을 실시간으로 모니터링하세요. 이미지 획득 소프트웨어에서 최소 10프레임 획득을 위해 영상 파라미터를 설정하고, 비조명 간격을 5초로 설정하세요. 획득을 시작하고 녹화된 영상에서 단일 분자 국소화의 희소성을 평가합니다.

영상 버퍼를 추가한 직후 여러 겹치는 항체 결합 이벤트가 관찰되거나 단일 분자 위치가 시간이 지남에 따라 누적되면 획득을 중단합니다. 항체 농도를 두 배로 줄이고 새로운 샘플에서 채취를 반복합니다. 항체 농도를 두 배로 줄이고, 단위 면적당 사건 수를 재평가하여 원하는 단일 분자 위치 밀도를 달성합니다.

이벤트 밀도가 희소할 경우, 영상 버퍼 내 항체 농도를 두 배로 늘립니다. 새로운 샘플에서 채취를 반복하고, 원하는 단일 분자 위치 밀도에 도달할 때까지 항체 농도를 두 배로 증가시키면서 단위 면적당 결합 이벤트 수를 재평가합니다. 비조명 간격 최적화를 위해서는 이미지 획득 소프트웨어에서 영상 매개변수를 설정하여 50프레임 획득을 얻으세요.

항체를 추가하고 획득을 시작한 후, 녹화된 영상에서 단일 분자 국소화의 밀도와 희소도를 평가합니다. 최적의 단일 분자 사건 밀도를 얻는 비조명 구간을 결정합니다. 마지막으로, 이미지 획득이 진행되면서 공간적으로 겹치는 결합 현상이 발생하면, 일정 간격으로 광 표백 단계를 도입하세요.

결합된 항체에서 나온 형광이 겹치는 사건들이 누적되기 전에 제거되도록 광 표백 주파수를 조절하세요. MATLAB 소프트웨어에서 파일 경로를 재구성된 M 셀 쉼표 구분 값 파일이 있는 폴더로 설정하세요. MATLAB 툴바에서 '실행'을 클릭하여 코드를 실행하세요.

메시지가 뜨면 M 셀 CSV 파일을 선택하고 열기를 클릭하여 프로그램에 불러와야 합니다. 이전에 정의된 입력값을 출발점으로 분석하세요. 군집화되지 않은 위치 데이터를 포함하는 산점도(scatter plot) 평가.

잡음 국소화 수보다 높지만 셀 내 국소화 수보다는 낮은 최소 포인트 값을 선택하세요. 클러스터된 데이터를 나타내는 창을 평가합니다. 예상 표현형을 가진 세포 내에 클러스터가 유지되는지, 세포 외부의 국소화는 최소화되는지 확인하세요.

클러스터링 매개변수가 너무 제한적이면 최소 점수 값을 줄이고 엡실론을 늘리세요. 군집 매개변수가 너무 포괄적이면 최소 점수를 올리고 엡실론을 줄이세요. 마지막으로 최소 점수 값과 엡실론을 조정한 후 최적의 클러스터링을 위해 코드를 다시 실행합니다.

저르캣 T 세포는 막의 완전성을 유지하고 항체가 막 에피토프에 접근할 수 있도록 충분한 간격으로 고정되었습니다. 금 콜로이드는 시각화되어 M 세포 영상 획득 중 측면 이동 보정을 위한 기준 마커로 사용되었습니다. 비조명 간격의 최적화 결과, 5초 간격이 1나노몰 항체 농도에서 짧거나 긴 간격보다 공간적 겹침이 최소화된 항체 결합 이벤트를 발생시켰습니다.

드리프트 보정 적용은 교정되지 않은 재구성에 비해 재구성된 M 세포 이미지가 개선되었습니다. 밀도 기반 M세포 위치 클러스터링은 저밀도 배경 상호작용을 줄이고 클러스터된 CD81 결합 이벤트를 강조했습니다. 세포 환경에서 항체가 막 에피토프와 상호작용하는 모습을 관찰하여 치료용 항체와 관련된 통찰을 제공합니다.

항체 농도, 비조명 간격, 광 표백 단계가 최적화에 매우 중요합니다. 최적이 아닌 매개변수는 결과를 손상시킵니다. 단일 항체 표지는 동일한 세포 환경 내에서 여러 항체에 의한 막 단백질 결합을 동시에 평가하는 데도 확장될 수 있습니다.