형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

단백질은 복잡한 상태 공간에서 작동하며 많은 부분이 숨겨져 있습니다. 우리는 단일 분자 영상을 사용해 이러한 상태를 밝힙니다. 지질 이중층에서 단일 막 단백질을 추적할 때 주요 과제는 샘플 준비, 광표백, 시간 해상도입니다.

우선, 냉동실에서 지질 줄기 용액을 꺼내 실온에 도달시키세요. 깨끗한 10밀리리터 플라스크를 오븐에서 꺼내 실온까지 식히세요. 냉각된 둥근 바닥 플라스크에 분광 등급 클로로포름 900마이크로리터와 분광 등급 메탄올 100마이크로리터를 추가하세요.

그 다음 플라스크에 적절한 양의 지질을 넣고 충분히 섞을 만큼 휘저으며 섞습니다. 이제 둥근 바닥 플라스크 위에 진공 증류 커넥터를 올려놓고 질소 건조 라인에 연결하세요. 그 다음 질소 가스를 켜고 압력을 조절하여 손등에 닿는 흐름이 살짝 느껴질 때까지 조절합니다.

총 지질 5마이크로몰마다 완충액 1밀리리터를 둥근 바닥 플라스크에 피펫 넣습니다. 플라스크에 유리 마개를 올려놓고 파라핀 필름으로 밀봉하세요. 플라스크와 클램프를 링 스탠드 위에 올려놓고 바닥을 60도 섭씨 초음파 세척에 담가둡니다.

용액이 불투명해지고 플라스크 내부 벽에 지질이 남아 있지 않은지 확인하세요. 1시간 인큐베이션 후 소닉케이터를 켜고 진폭을 최고 수준으로 설정하세요. 플라스크를 욕조 안에서 움직이며 용액이 눈에 띄게 부딪히고 분사되는 가장 강한 자극 지점을 찾아보세요.

용액을 30분간 초음파로 처리하세요. 불투명함에서 투명하고 약간 오팔빛으로 전환하는 것을 관찰하며. 플라스크에서 지질 용액을 제거하여 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.

튜브를 100,000G에서 4도 섭씨로 1시간 동안 원심분리하세요. 원심분리 후에는 상액을 제거하여 새로운 원심분리관으로 옮깁니다. 25밀리미터 석영 커버를 비커에 넣고, 나노 순수수, 30% 과산화수소, 농축 질산을 같은 양으로 넣으세요.

뚜껑을 가열한 후 준비된 용액에 30분간 넣어 거품이 생기기 시작합니다. 용액을 10분마다 점검하고 덮개가 서로 달라붙지 않도록 부드럽게 휘저으세요. 소용돌이치면서 덮개 미끄러지기가 벌어지고 분리되는 것을 관찰하세요.

분리 후에는 점차 소용돌이 속도를 줄여 분리를 유지하고 거품이 되는 용액이 커버를 고르게 코팅할 수 있도록 하세요. 그 후 커버를 정제된 물로 깨끗하게 헹구면서 부드럽게 휘저어 모든 화학 잔여물을 제거하세요. 또는 n-헥산으로 석영 커버 슬립을 청소한 후 메탄올을 사용하고, 각 용매마다 렌즈 조직으로 닦아냅니다.

덮개를 UV 오존 클리너 안에 넣고, 처리할 표면을 램프를 향하게 하세요. 산소가 5분간 챔버에 5파운드당 평방인치로 흐르도록 합니다. 그다음 산소 흐름을 차단하세요.

이제 자외선을 15분간 켜고, 커버 슬립을 최소 10분간 두어 오존이 사라질 시간을 주세요. 새로 세척한 커버 슬립을 25mm 샘플 홀더에 넣으세요. 1/4인치 SM 단일 렌즈 튜브를 사용해 직경 8밀리미터의 이중 층 파 필름 가스켓을 자르고 샘플 홀더 중앙에 위치시킵니다.

8밀리미터 개스킷 중앙에 50마이크로리터 크기의 작은 유닐라멜라 소포를 발라줍니다. 상자를 밀봉한 후에는 37도 섭씨에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후에는 피펫으로 용액을 씻어내세요.

이중층에 50마이크로리터의 신선한 완충제를 추가하고 이 과정을 총 10번 반복합니다. 최종 헹굼 후에는 샘플 홀더에서 버퍼를 제거하세요. 세제에 원하는 단백질 50마이크로리터 알리코트를 첨가하여 임계 미셀라 농도 이하로 유지하세요.

샘플을 37도 섭씨에서 최소 1시간 배양하여 단백질이 포함되도록 하고, 샘플을 완충제로 헹구어 혼합되지 않은 단백질과 세제를 제거합니다. 수직 픽셀 이동 속도를 약 600나노초로 설정하고, 오버클럭 모드를 사용해 수직 클럭 전압을 증가시킵니다. 그 다음 수평 픽셀 읽기를 최대 속도로 설정하세요.

프리앰프 게인을 2로 조정하세요. 증폭기 출력을 전자 증폭용으로 설정하고 전자 증폭기 이득을 최고 수준으로 설정하세요. 그 다음 노출 시간을 25밀리초로 설정하세요.

실제 프레임 속도가 노출 시간을 약간 초과하는지 확인하세요. 이제 레이저 출력을 조절하여 신호가 배경 잡음에서 뚜렷하게 두드러질 때까지 조절하세요. 샘플당 최소 1000개의 트랙을 얻을 수 있을 만큼 충분한 영상 데이터를 수집하세요.

추적 분석을 위해 모든 데이터 세트를 일정한 크기로 자르고 Image J.In Fiji를 사용해 배경 보정을 수행하며, 분석해야 할 영화 또는 분석이 필요한 TIFF 파일을 드래그 앤 드롭하여 인터페이스에 삽입합니다. 픽셀 보정 세부 정보를 입력하려면 분석 탭에서 '설정 스케일'을 선택한 후 해당 기기에 맞는 픽셀 거리 보정을 적용하세요. 그 다음 원본을 보존하고 변경 사항을 추적하기 위해 데이터셋 복사본을 저장하세요.

관심 있는 영역에서 배경을 빼서 원본 데이터의 저장된 복사본에 적용합니다. 프로세스 탭으로 가서 배경 빼기를 선택하세요. 플러그인 탭에서 트래킹을 선택한 후 trackmate를 선택하면 trackmate 대화 창을 실행하여 트래킹 분석을 진행할 수 있습니다.

AQP 4 테트라머의 표지 정도는 UV 가시광선 분광법을 이용해 4.12로 계산되었고, 포아송 분포 분석 결과 테트라머의 98%가 최소 하나의 형광 염료 분자를 운반하고 있음이 나타났다. 히스토그램은 다양한 크기의 직교 입자 배열의 확산과 일치하는 넓은 스텝 크기 분포를 보여주며, 계산된 평균 확산 계수는 초당 0.0143 제곱 마이크로미터였습니다. 이 영상에서는 아쿠아포린 4 조절과 관련된 열역학적 힘에 중요한 주요 상태를 확인했습니다.

이 프로토콜은 정제된 막관통 단백질로 생체 모방 막을 만드는 데 있어 시간 경과 단일 분자 추적에 적합한 추측을 없애줍니다. 전환점에서 작동하는 단백질 기계는 단일 단백질 추적을 통해 확률적 경로, 가지, 막다른 길을 직접 관찰할 수 있습니다.