Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

이 절차의 전반적인 목표는 고정 세포 또는 살아있는 세포에서 나노미터 정밀도로 여러 단백질 종을 동시에 이미지화하는 것입니다. 이는 먼저 현미경의 초점이 맞춰진 이미지가 카메라 칩에 투사될 때까지 카메라와 광학 장치의 위치를 조정하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 레이저 빔을 배열하여 현미경 스테이지의 샘플에 직접 정렬하는 것입니다.

다음으로, 준비된 세포 샘플을 조명하고 원하는 단백질을 발현하는 세포를 선택합니다. 마지막 단계는 레이저로 샘플을 조명한 다음 세포 형광을 카메라 칩으로 보내 데이터 세트 세트를 획득하여 형광 활성화 국소화 현미경으로 세포를 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 광 활성화 국소화 현미경 검사는 고정 세포 또는 살아있는 세포에서 나노미터 공간 규모로 여러 단백질 종의 국소화를 보여주는 데 사용되며, 광시야에서 또는 전사 형광을 사용하여 샘플의 얇은 영역을 분리할 때 사용됩니다.

컨포칼 또는 전자 현미경과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 고정 세포 또는 살아있는 세포에서 나노미터 해상도로 여러 단백질을 동시에 이미지화할 수 있다는 것입니다. 다음 단계는 여기에 표시된 번호 매기기 시스템을 참조하며, 이는 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 그림 1과 같이 제공된 다색 F Om 설정에 대한 회로도이며, 현미경을 정렬하기 위해 10 x 대물렌즈를 제자리에 놓고 램프를 투과광용으로 설정한 현미경 스테이지에 보정 스케일 또는 라디칼을 배치하는 것으로 시작합니다. 시야의 중심에 수직을 맞춥니다.

다음으로, 자기장 조리개를 닫고 접안렌즈를 통해 수직을 바라봄으로써 coer 조명에 대한 현미경을 조정합니다. 자기장 조리개의 가장자리가 초점이 맞지 않으면 자기장 조리개와 빨간색에 모두 초점이 맞춰질 때까지 콘덴서의 높이를 조정합니다. 그런 다음 시야각이 시야각을 기준으로 중앙에 올 때까지 시야 조리개의 측면 위치를 조정하고 빨간색의 중앙 그리드만 켜질 때까지 시야 조리개를 닫습니다.

이러한 구성 요소를 처음 조립할 때 각 채널의 경로 길이를 동일하게 조정합니다. 이 프로젝트를 완수하기 위해 카메라 칩의 레드들은 미러 7과 9를 조정하고 감지 조리개를 닫아 두 채널 간의 공간적 중복을 방지합니다. 그런 다음 반사광 채널에서 라디칼 이미지의 초점을 맞추고 투과광 채널에서도 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.

투과광 채널의 이미지에 초점이 맞지 않으면 두 채널에서 동시에 라디칼 이미지의 초점이 맞춰질 때까지 미러 9를 변환합니다. 레이저 경로에서 렌즈 1을 제거하고 활성화 및 판독 빔을 차단하여 레이저 정렬을 시작합니다. 그런 다음 흰색 카드를 미러 4와 같은 높이로 놓고 현미경 셔터를 열고 라디칼 이미지가 미러 4 앞의 카드에 투사될 때까지 초점을 맞춥니다.

다음으로, 판독 빔의 차단을 해제하고 미러 1을 조정하여 판독 레이저를 미러 4에 있는 라디칼 이미지의 십자선에 중앙에 놓습니다. 중앙에 배치되면 라디칼 이미지를 미러 5에 투사하고 빔이 미러 5의 이미지 십자선의 중앙에 올 때까지 미러 4를 조정합니다. 이제 판독 빔이 M 4와 M 5 모두의 중앙에 위치해야 합니다.

그런 다음 셔터 1을 닫아 판독 빔을 차단합니다. 다음으로, 급진적인 이미지를 거울 3에 투사합니다. 레이저 경로에서 빔 익스팬더를 제거하고 활성화 레이저의 차단을 해제합니다.

이제 미러 2를 조정하여 활성화 빔을 미러 3의 라디칼 이미지의 십자선의 중앙에 맞춥니다. 중앙에 배치되면 미러 2와 미러 3 사이의 빔 익스팬더를 교체하고 빔이 라디칼 이미지의 십자선의 중심에 오를 때까지 빔 익스팬더의 위치를 조정합니다. 미러 3에서 급진적인 이미지를 미러 5에 투사하고 초점을 맞춥니다.

현미경의 초점 손잡이를 사용하여 활성화 빔이 redle 이미지의 중앙에 올 때까지 dichroic mirror number 1의 각도를 조정합니다. 그런 다음 대물렌즈 없이 2번 셔터를 닫고 현미경 셔터를 열어 활성화 레이저를 차단합니다. 판독 셔터 셔터를 열고 현미경의 후면 조리개를 통해 레이저를 투사합니다.

빔이 현미경에서 나올 때까지 미러 5를 조정하여 빔이 렌즈 1과 대물렌즈를 제자리에 다시 놓은 상태에서 현미경에서 수직으로 빠져나오도록 합니다. 100마이크로몰 브롬 B가 포함된 샘플을 활성화 레이저가 차단된 상태로 스테이지에 놓습니다. 판독 레이저를 60 x 대물렌즈를 통해 염료에 투사합니다.

전자 곱셈 이득이 비활성화된 상태에서. 이 이미지를 카메라로 보냅니다. 다음으로, 표본에 초점을 맞춥니다.

전체 빔 프로파일의 이미징을 허용하기에 충분히 넓게 조리개를 엽니다. 그런 다음 빔 프로파일의 중심과 조리개가 동심원이 되도록 조리개를 측면으로 이동합니다. 카메라 소프트웨어를 사용하여 두 채널을 모두 캡슐화하는 가장 작은 카메라 판독 영역을 허용하고 이러한 좌표를 기록할 수 있도록 관심 영역을 선택합니다.

이 시점에서 판독 빔 프로파일을 나타내는 단일 스냅샷을 기록합니다. 다음으로, 셔터 1을 닫고 셔터 2를 열어 판독 레이저를 차단합니다. 활성화 빔 프로파일을 측정하기 위해 활성화 레이저를 샘플에 투사하고 필요한 경우 100 미만의 전자 곱셈 이득을 사용하고 빔이 각 시야의 중앙에 올 때까지 첫 번째 이색성 미러를 조정합니다.

그런 다음 다중 색상 F 손바닥 이미지를 획득하기 위해 활성화 빔 프로파일의 스냅샷을 기록합니다. 모든 실내 조명을 제거하십시오. 그런 다음 플립 마운트를 통해 수은 램프를 형질 주입된 세포에 투사하고 필터 큐브를 프리 포토 스위치의 적절한 여기 파장을 포함하는 큐브로 변경합니다. 상태.

세포가 선택되면 레이저가 현미경으로 통과할 수 있도록 플립 마운트를 아래로 이동하고, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미징을 위한 적절한 이색성 미러가 포함된 필터 터렛으로 변경합니다. 그런 다음 이 이미지를 카메라에 투사하여 형질주입된 세포를 배경 형광과 구별하고 분자가 광을 볼 수 있는지 확인합니다. 활성화 레이저에서 10마이크로와트 미만의 낮은 전력으로 샘플을 간략하게 비춥니다.

다음으로, 전자 곱셈 게임을 200으로 설정하고 원하는 프레임 수를 5에서 10, 000 사이로 설정하여 키네틱 시리즈 획득을 위한 카메라 소프트웨어를 준비합니다. 또한 노출을 10밀리초에서 30밀리초 사이로 설정합니다. 그런 다음 활성화 빔을 차단하고, 판독 빔의 차단을 해제하고, 조명이 켜진 셀의 이미지를 카메라에 투사합니다.

개별 분자가 더 이상 보이지 않을 때까지 초점을 아래로 이동하여 하단 세포막 근처의 초점면을 선택합니다. 그런 다음 분자가 처음 보일 때까지 초점을 점차적으로 위쪽으로 이동합니다. 이제 활성화 빔의 차단을 해제하고 제곱센티미터당 1와트 미만의 강도로 샘플을 비춥니다.

활성화 레이저 앞의 중성 밀도 필터를 동적으로 조정하여 0.1 대 1 가시 광석 분자의 밀도를 유지하면서 카메라 소프트웨어를 통해 이러한 데이터를 수집하기 시작합니다. 내부 전반사(total internal reflection)를 위해 형광 이미징 미러 5와 렌즈 1을 단일 번역 스테이지에 장착하여 현미경 입구 바로 뒤의 측면으로 이동합니다. 미러 5와 렌즈 1이 이동함에 따라 샘플을 통해 대물렌즈에서 위쪽으로 나가는 레이저는 점차 한쪽으로 기울어지고 레이저의 각도가 수직에서 90도에 도달할 때까지 스테이지를 계속 변환합니다.

이 시점에서 등장하는 레이저 자체는 사라지고 들어오는 레이저는 들어오는 빔과 반평행하게 이동하여 조리개에 다시 반사되어 측면으로 변위됩니다. 이미지 획득이 완료된 후 샘플이 전반사 형광에 들어갈 때 배경이 감소하는 것을 볼 수 있어야 하며, 즉시 현미경 셔터를 닫고 두 빔을 모두 차단하십시오. 전자 곱셈 이득을 비활성화합니다.

한 프레임을 기록하도록 카메라를 설정하고 카메라 판독 영역을 최대 크기로 설정합니다. 마지막으로, 현미경 램프에 장착된 롱 패스 필터를 사용하여 F 3 또는 F 4 위에 카드를 배치하여 한 채널을 차단합니다. 샘플에 조명을 비추고 이 이미지를 카메라에 투사합니다.

투과광으로 전체 셀을 나타내기 위해 셀의 스냅샷을 기록합니다. 여기에 도시된 것은 DENDRA 2 Hemagglutinin 및 PAM Cherry actin을 모두 발현하는 NIH 3 T 3 세포의 2 색 F 손바닥 획득의 예입니다. 왼쪽의 투과 채널은 오른쪽의 반사 채널보다 더 긴 파장을 포함합니다.

여기에 표시된 것은 배경, 빼기 및 변환에 따라 왼쪽 및 오른쪽 채널을 오버레이하기 위한 동일한 두 가지 색상의 F OM 획득의 스냅샷입니다. 개별 분자를 식별하고 지역화할 수 있습니다. 일부 분자는 투과 채널에서 더 밝게 나타나고 일부는 두 채널 사이에 방출 분포가 더 균일합니다.

이는 PAM cherry와 DENDRA 2 사이의 방출 스펙트럼 차이를 나타내며 이 두 종을 식별하기 위한 분석에 사용됩니다. 여기에 표시된 히스토그램은 허용 오차가 적용된 후 모든 국소 분자에 대한 총 강도로 나눈 적색 투과 채널 강도의 비율을 나타냅니다. 픽셀은 왼쪽 아래 이미지에서 흰색으로 나타나고 오른쪽 아래에 표시된 최종 병합 이미지에서 빨간색으로 표시되는 반면, 녹색 영역에 있는 픽셀은 오른쪽 위 이미지에서 흰색으로 표시되고 오른쪽 아래에 표시된 최종 병합 이미지에서 녹색으로 나타납니다.

렌더링할 때 선택되는 임계값 수준은 노이즈 정도와 공동 지역화의 모양에 큰 영향을 줍니다. 표시. 다음은 렌더링을 위한 세 가지 다른 옵션으로, 가장 보수적인 임계값 수준을 통해 다양한 정도의 블리드가 발생하며, 아래쪽 두 가지에 표시되어 있습니다. 색상 F 손바닥 알파 히스토그램은 이미지에 두 개의 식별 가능한 피크가 있을 때 해석하는 것이 가장 좋습니다.

왼쪽의 히스토그램은 추가 분석을 위한 좋은 후보이지만 다른 두 히스토그램에서 생성된 이미지는 이 절차를 따라 해석하기가 훨씬 더 어려울 수 있습니다. 전체 내부 반사, 현미경 검사 및 살아있는 세포 이미징과 같은 방법은 단백질이 살아있는 세포막에서 나노 규모로 어떻게 구성되는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 자신의 FAR 현미경을 설정하고 이를 사용하여 데이터를 수집하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 시도하기 전에 안전 교육을 완료해야 한다는 것을 잊지 마십시오.