Name: Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 배우세요 형광 광활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 고정 및 살아있는 세포에서 여러 단백질 종을 나노미터 정밀도로 동시 이미징하는 방법을 배우세요. 이 기술은 단백질 위치와 상호작용을 분자 수준에서 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 컴퓨터 프로그래밍, 기술 지원 및 유용한 대화에 대해 Philip Andresen, Matthew Parent 및 Sean Carter와 관리 지원에 대해 Pat Byard에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 및 2061, Maine Economic Improvement Fund의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H.와 M.J.M.은 초고해상도 현미경 분야에서 특허를 보유하고 있습니다. S.T.H.는 Vutara, Inc.의 과학 자문 위원회에서 활동하고 있습니다.

현지화 기반 초고해상도 이미징은 생물학적 이미징을 위한 많은 강력한 기능을 제공합니다. 테이블 위에 배치된 개별 광학 부품에서 생물학적 샘플에서 여러 형광 종을 동시에 이미징할 수 있는 기능적 초해상도 현미경까지의 경로는 여러 가지 문제를 제시합니다. 정렬의 일부 측면은 다른 측면보다 더 중요합니다. 우리는 아래에서 경로의 가장 어려운 측면을 다루는 잠재 사용자에게 지침을 제공하기 위해 노력합니다.
중요한 단계
FPALM 및 유사한 기술이 제공하는 향상된 이미지 해상도는 현미경의 안정화에 더 많은 주의를 기울여야 합니다. 기존의 현미경 이미지는 ~20-50nm 규모의 샘플 드리프트 또는 진동 운동(진동)에 의해 눈에 띄게 왜곡되지 않는 경우가 많지만, 초고해상도 현미경 이미지는 이러한 움직임에 의해 저하됩니다. 예를 들어, 원치 않는 움직임의 원인에는 현미경 및 샘플 내의 열 구배, 에어 테이블에 부착된 장비의 냉각 팬, 현미경 스테이...

세포 구조는 광범위한 공간 규모에 존재하지만, ~250nm보다 작은 길이 규모에서 세포 조직의 형광 이미징은 회절 한계의 물리적 제약으로 인해 기존 현미경 검사에서 제한됩니다. 이 한계는 형광 광활성화 국소화 현미경 검사법(FPALM1) 및 유사한 기술2,3의 출현으로 극복되었으며, 이는 ~10nm의 정밀도로 많은 수의 개별 분자를 국소화할 수 있어 수십 나노미터의 해상도를 가진 이미지를 생성할 수 있습니다. FPALM은 광학 제어를 사용하여 분자의 부분 집합을 활성화 및 비활성화하는 것을 기반으로 합니다(FPALM에 대한 전체 설명 및 이 이미징 시스템을 구현하는 방법에 대한 지침은 Gould et al.4). 이 기술을 사용하면 단일 분자의 전체 개체군의 공간 분포를 매핑할 수 있으므로 수십 나노미터에서 수십 미크론에 이르는 길이 규모에 걸쳐 생물학적 구조를 설명할 수 있습니다. 국소화 기반 초고해상도 현미경 검사(이하 국소화 현미경이라고 함)는 이제 다양한 생물학적 문제를 해결하기 위해 채택되었으며, 예를 들어 편광 FPALM 또는 P-FPALM5를 사용한 개별 분자 배향의 이미징, Biplane FPALM6 또는 기타 기술7-9를 사용한 3차원 단일 분자의 형광 이미징을 허용하는 기술 개발이 가능해졌습니다, 그리고 살아있는 세포에서 단일 분자의 초고해상도 형광 이미징10-12. 국소화 현미경 검사는 고정 세포에서 여러 종의 이미징에도 적용되었습니다13-16. 최근에는 고정 세포와 살아있는 세포 모두에서 FPALM으로 3개의 단백질 종이 동시에 이미지화되었습니다17. 국소화 현미경 검사는 다양한 방법으로 라벨링된 샘플을 이미지화할 수 있습니다. 예를 들어 PAFP 또는 PSFP 융합 태그로 발현된 단백질, 케이지 유기 염료로 표지된 항체 또는 분자 또는 기존 유기 염료가 있습니다. 기존의 형광 염료를 사용하면 융합 단백질 태그가 없는 경우 단백질을 라벨링할 수 있지만, 초고해상도 이미징에서 비케이지 유기 염료를 사용하는 데 일반적으로 필요한 조건에서는 샘플을 환원 완충액에 담가야 합니다2. 또한 항체 염료 접합체의 세포 내 전달은 일반적으로 세포를 고정하고 세포막을 투과화해야 합니다. 또는 살아있는 세포가 전기천공법이나 다른 수단을 통해 투과될 수 있도록 해야 합니다. 완충액 조건 및 멤브레인 투과율화를 줄이기 위한 요구 사항은 라이브 셀 이미징에 대한 유기 염료의 적합성을 제한하지만, 최근의 개발로 인해 멤브레인 구조를 이미지화하기 위해 HaloTags 및 FPALM을 효과적으로 사용할 수 있게 되었습니다18.
FPALM은 살아있는 세포에 적용된 최초의 국소화 현미경 기법입니다10. 살아있는 세포에서는 표지된 분자의 위치에 대한 시간 의존적 공간 지도를 제공하는 것 외에도 FPALM은 여러 프레임에 걸쳐 단일 분자를 추적하고 밀리초의 시간 척도에 걸쳐 결정된 분자 궤적을 추적할 수 있습니다19. 따라서 FPALM은 상당히 짧은 시간 척도와 나노 단위 분해능에 대한 액세스를 제공합니다.
다색 FPALM은 광활성성 단백질 및 유기 케이지 또는 비케이지 염료를 포함한 다양한 프로브에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 두 가지 형광 단백질 종인 Dendra2 및 PAmCherry의 동시 이미징을 위한 프로토콜 및 설정에 대한 세부 정보를 제공합니다. NIH-3T3 섬유아세포에서 베타 액틴(PAmCherry-actin)에 접합된 PAmCherry와 인플루엔자 헤마글루티닌(Dendra2-HA)에 접합된 Dendra2를 이미징한 결과를 보고합니다. 설정에 설명된 구성 요소는 다른 프로브의 이미징에 더 적합한 다른 하드웨어로 교체할 수 있습니다. 이 경우, 우리는 본문에서 명시하려고 노력했습니다.
Multicolor FPALM은 살아 있거나 고정된 세포에서 여러 단백질 종의 공간 분포를 보고하는 데 이상적입니다. 이 기술은 나노미터 길이의 공간 스케일에서 공간 및/또는 동적 관계를 조사하는 데 특히 적합하지만, 이미지는 수십 나노미터에서 수십 미크론에 이르는 다양한 길이 스케일에서 국소화를 보고합니다. 다색 FPALM의 주요 장점 중 하나는 설정이 비교적 저렴하고 다양한 프로브 조합과 함께 사용할 수 있는 매우 유연하다는 것입니다. 구성 요소에서 시스템을 구성하고 보정하는 프로세스는 또한 데이터의 품질과 해석 가능성, 그리고 연구 결과를 손상시킬 수 있는 요인에 대한 상당한 이해를 제공합니다. 여기에서는 FPALM을 사용하여 PSFP 및 PAFP 융합 구조를 통해 여러 단백질 종의 광학 설정, 샘플 준비 및 데이터 수집 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 고정된 세포의 분석을 설명하지만, 이러한 절차는 살아있는 세포의 이미징에 쉽게 적용할 수 있습니다.
여기에 설명된 광학 설정은 PSFP Dendra2와 PAFP PAmCherry의 동시 이미징에 이상적입니다. 다른 많은 프로브가 다색 이미징에 사용될 수 있습니다. 그러나 필요한 정밀 구성 요소는 선택한 프로브의 여기 및 방출 스펙트럼에 따라 달라질 수 있습니다. dichroic mirrors, filters, laser wavelength의 선택은 이러한 고려 사항에 따라 이루어져야 합니다.

<table><tbody><tr><td>LabTek II 챔버</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>형광 비드</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>보정용 비드</td></tr><tr><td>Tetraspeck 비드</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>보정용 4색 비드</td></tr><tr><td>대물렌즈 이멀젼 오일</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>높은 NA 대물렌즈용 이멀젼 오일(대물렌즈 선택에 따라 다름)</td></tr><tr><td>HPLC water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>또는 Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>항생제</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>혈청</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>주의: 독성</td></tr></tbody></table>

simultaneous multicolor imaging of biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

국소화 기반 초고해상도 현미경을 적용하여 수십 나노미터의 공간 분해능을 가진 샘플 내에서 개별 형광 표지된 단일 분자의 분포에 대한 공간 지도(이미지)를 얻을 수 있습니다. 관심 단백질에 융합된 광활성(PAFP) 또는 광전환성(PSFP) 형광 단백질 또는 항체 또는 기타 관심 분자에 접합된 유기 염료를 사용하여 형광 광활성화 국소화 현미경(FPALM)은 단일 세포 내에서 여러 종의 분자를 동시에 이미지화할 수 있습니다. 다음과 같은 접근 방식을 사용하여 많은 수(수천에서 수십만 개)의 개별 분자 집단을 단일 세포에서 이미지화하고 ~10-30nm의 정밀도로 국소화합니다. 얻어진 데이터는 세포 내의 여러 단백질 유형의 나노 크기 공간 분포를 이해하는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 공간 해상도의 극적인 증가입니다: 기존 광학 현미경 검사에서 회절은 해상도를 ~200-250nm로 제한하는 반면, FPALM은 한 자릿수 이상의 이미지 길이를 이미지화할 수 있습니다. 많은 생물학적 가설이 서로 다른 생체 분자 간의 공간적 관계와 관련되어 있기 때문에 FPALM의 향상된 해상도는 이전에 기존 형광 현미경으로 접근할 수 없었던 세포 조직 문제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 샘플 준비 및 데이터 수집 방법을 자세히 설명하는 것 외에도 여기에서는 FPALM의 광학 설정에 대해 설명합니다. 초고해상도 현미경 검사를 수행하고자 하는 연구자가 고려해야 할 또 다른 사항은 비용입니다: 사내 설정은 대부분의 상업적으로 이용 가능한 이미징 기계보다 훨씬 저렴합니다. 이 기술의 한계에는 세포 샘플 내에서 관심 분자의 라벨링을 최적화해야 할 필요성과 결과를 시각화하기 위한 후처리 소프트웨어의 필요성이 포함됩니다. 여기에서는 고정된 세포에서 두 개의 단백질 종을 이미지화하기 위해 PAFP 및 PSFP 발현을 사용하는 방법을 설명합니다. 살아있는 세포에 대한 기술의 확장도 설명됩니다.

인플루엔자 헤마글루티닌(HA)은 수십 나노미터에서 마이크로미터 규모의 클러스터를 형성하며, 이러한 클러스터들은 액틴과 가변적으로 공동 국소화됩니다(그림 5). 이러한 공간적 분포는 이 두 단백질에 대한 더 거친 규모의 이미지 분석 결과28 및 액틴에 따른 HA 공간 분포의 의존성19을 뒷받침합니다. 다색 FPALM 이미지를 추가로 사용하여 이러한 클러스터의 밀도, 면적, 둘레를 설명할 수 있으며, 나노 및 마이크로 규모 모두에서 두 종 사이의 공동 국소화 정도를 분석할 수 있습니다. 획득한 이미지의 해상도는 수십 나노미터 수준입니다1,17. 여기에 제시된 렌더링 이미지에서 이미지 상의 각 개별 점은 단일 표지 단백질 분자의 국소화를 20 nm 정밀도 내에서 나타냅니다. 투과 광원을 사용하여 전체 시야(FOV)의 이미지를 추가로 획득함으로써(그림 6), FPALM 이미지를 전체 세포 및 그 주변 환경의 맥락에서 ...

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

본 절차의 전반적인 목표는 고정된 세포 또는 살아있는 세포에서 여러 단백질 종을 나노미터 정밀도로 동시에 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 현미경의 초점이 맞은 이미지가 카메라 칩에 투영될 때까지 카메라와 광학 장치의 위치를 조정함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 레이저 빔을 조절하여 현미경 스테이지 위의 시료에 직접 정렬되도록 하는 것입니다.다음으로, 준비된 세포 샘플을 조명하여 원하는 단백질을 발현하는 세포를 선택합니다. 마지막 단계는 레이저로 샘플을 조명하는 형광 광활성화 위치 현미경법(fluorescence photo activation localization microscopy)으로 세포를 이미징한 후, 세포 형광을 카메라 칩으로 유도하여 데이터 세트를 획득하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 광활성화 위치 현미경법은 고정 세포 또는 살아있는 세포에서, 그리고 광시야(wide field) 방식이나 샘플의 얇은 영역만을 분리하는 전반사 형광(total internal reflection fluorescence) 방식을 사용하여 나노미터 공간 규모에서 여러 단백질 종의 위치를 보여주는 데 사용됩니다.공초점 현미경이나 전자 현미경과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 고정된 세포 또는 살아있는 세포에서 나노미터 해상도로 여러 단백질을 동시에 이미징할 수 있다는 점입니다. 다음 단계들은 여기 표시된 번호 체계를 따르며, 이는 동반된 텍스트 프로토콜의 그림 1로 제공된 다색 F Om 설정의 모식도입니다. 현미경을 정렬하려면 10 x 대물렌즈를 장착하고 램프를 투과광으로 설정한 후, 보정 척도나 라디컬을 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 수직선을 시야 중심에 맞추십시오.다음으로, 필드 다이어프램을 닫고 접안렌즈를 통해 수직 방향을 관찰하여 현미경의 코헤르 조명을 조정하십시오. 필드 다이어프램의 가장자리가 초점이 맞지 않는 경우, 필드 다이어프램과 레들(redle) 모두에 초점이 맞을 때까지 콘덴서의 높이를 조정하십시오. 그런 다음 필드 다이어프램이 시야의 중심에 올 때까지 측면 위치를 조정하고, 레들의 중앙 그리드만 조명될 때까지 필드 다이어프램을 닫으십시오.이 구성 요소들을 처음으로 조립할 때, 각 채널의 경로 길이를 동일하게 조정하십시오. 이를 수행하려면 카메라 칩에 비치는 적색광을 통해 거울 7번과 9번을 조정하고, 두 채널 간의 공간적 중첩을 방지하기 위해 검출 조리개를 닫으십시오. 그다음

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Research

연구

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Biology

생물학

형광 광활성화 국소화 현미경을 이용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가​​ 생성된다.

동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

우리는 형광 표지 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 사용하여 단일 분자 정밀도로 이질적인 나노 구조 내의 다중 분자를 이미지화하는 방법을 시연합니다.

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

이 프로토콜은 레이저 광원 생성, 조직 샘플 준비, 이미징 수행 및 데이터 분석에 대한 세부 정보를 포함하여 SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경 기술에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. SLAM은 조직 미세 환경을 조사하기 위해 4개의 상보적인 무표지 대비를 측정하여 비선형 현미경을 발전시킵니다.

동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경

이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜

배우세요 형광 광활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 고정 및 살아있는 세포에서 여러 단백질 종을 나노미터 정밀도로 동시 이미징하는 방법을 배우세요. 이 기술은 단백질 위치와 상호작용을 분자 수준에서 연구하는 데 활용됩니다.

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Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

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