Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

본 절차의 전반적인 목표는 고정된 세포 또는 살아있는 세포에서 여러 단백질 종을 나노미터 정밀도로 동시에 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 현미경의 초점이 맞은 이미지가 카메라 칩에 투영될 때까지 카메라와 광학 장치의 위치를 조정함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 레이저 빔을 조절하여 현미경 스테이지 위의 시료에 직접 정렬되도록 하는 것입니다.

다음으로, 준비된 세포 샘플을 조명하여 원하는 단백질을 발현하는 세포를 선택합니다. 마지막 단계는 레이저로 샘플을 조명하는 형광 광활성화 위치 현미경법(fluorescence photo activation localization microscopy)으로 세포를 이미징한 후, 세포 형광을 카메라 칩으로 유도하여 데이터 세트를 획득하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 광활성화 위치 현미경법은 고정 세포 또는 살아있는 세포에서, 그리고 광시야(wide field) 방식이나 샘플의 얇은 영역만을 분리하는 전반사 형광(total internal reflection fluorescence) 방식을 사용하여 나노미터 공간 규모에서 여러 단백질 종의 위치를 보여주는 데 사용됩니다.

공초점 현미경이나 전자 현미경과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 고정된 세포 또는 살아있는 세포에서 나노미터 해상도로 여러 단백질을 동시에 이미징할 수 있다는 점입니다. 다음 단계들은 여기 표시된 번호 체계를 따르며, 이는 동반된 텍스트 프로토콜의 그림 1로 제공된 다색 F Om 설정의 모식도입니다. 현미경을 정렬하려면 10 x 대물렌즈를 장착하고 램프를 투과광으로 설정한 후, 보정 척도나 라디컬을 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 수직선을 시야 중심에 맞추십시오.

다음으로, 필드 다이어프램을 닫고 접안렌즈를 통해 수직 방향을 관찰하여 현미경의 코헤르 조명을 조정하십시오. 필드 다이어프램의 가장자리가 초점이 맞지 않는 경우, 필드 다이어프램과 레들(redle) 모두에 초점이 맞을 때까지 콘덴서의 높이를 조정하십시오. 그런 다음 필드 다이어프램이 시야의 중심에 올 때까지 측면 위치를 조정하고, 레들의 중앙 그리드만 조명될 때까지 필드 다이어프램을 닫으십시오.

이 구성 요소들을 처음으로 조립할 때, 각 채널의 경로 길이를 동일하게 조정하십시오. 이를 수행하려면 카메라 칩에 비치는 적색광을 통해 거울 7번과 9번을 조정하고, 두 채널 간의 공간적 중첩을 방지하기 위해 검출 조리개를 닫으십시오. 그다음 반사광 채널에서 라디칼의 이미지에 초점을 맞춘 후, 투과광 채널에서도 초점이 맞는지 확인하십시오.

투과광 채널의 이미지가 초점에 맞지 않는 경우, 두 채널 모두에서 라디칼 이미지가 동시에 초점에 맞을 때까지 거울 9를 이동하십시오. 레이저 경로에서 렌즈 1을 제거하고 활성화 빔과 판독 빔을 차단하여 레이저 정렬을 시작하십시오. 그런 다음 흰색 카드를 거울 4에 밀착시키고 현미경 셔터를 연 후, 거울 4 앞의 카드에 라디칼 이미지가 투영될 때까지 초점을 맞추십시오.

다음으로, 판독 빔의 차단을 해제하고 mirror one을 조정하여 판독 레이저가 mirror four에 있는 십자선 이미지 중심에 오도록 합니다. 중심이 잡히면 십자선 이미지를 mirror five에 투사하고, 빔이 mirror five의 이미지 십자선 중심에 올 때까지 mirror four를 조정합니다. 이제 판독 빔이 M four와 M five 모두의 중심에 위치해야 합니다.

그다음 셔터 1을 닫아 판독 빔을 차단하십시오. 이어서 라디칼 이미지를 거울 3에 투사합니다. 레이저 경로에서 빔 확장기를 제거하고 활성화 레이저의 차단을 해제하십시오.

이제 거울 2를 조정하여 활성화 빔이 거울 3에 있는 라디칼 이미지의 십자선 중앙에 오도록 합니다. 중앙 정렬이 완료되면 거울 2와 3 사이에 빔 확장기를 다시 설치하고, 빔이 라디칼 이미지의 십자선 중앙에 위치할 때까지 빔 확장기의 위치를 조정합니다. 거울 3에서 라디칼 이미지를 거울 5로 투사하고 초점을 맞춥니다.

현미경의 초점 조절 나사를 사용하여 활성화 빔이 redle 이미지의 중심에 올 때까지 1번 다이크로익 미러(dichroic mirror)의 각도를 조절하십시오. 그 다음, 대물렌즈가 장착되지 않은 상태에서 현미경 셔터는 열어둔 채로 2번 셔터를 닫아 활성화 레이저를 차단하십시오. 1번 판독 셔터를 열어 레이저를 현미경의 후방 개구부(back aperture)를 통해 투사하십시오.

렌즈 1과 대물렌즈를 다시 제자리에 배치한 상태에서, 빔이 현미경에서 수직으로 나오도록 거울 5를 조정하십시오. 활성 레이저를 차단한 상태에서 100 µM bromine B가 포함된 시료를 스테이지 위에 놓으십시오. 판독 레이저를 60x 대물렌즈를 통해 염료로 투사하십시오.

전자 증폭 이득(electron multiplying gain)을 비활성화한 상태에서 이 이미지를 카메라로 전송하십시오. 그다음, 대물렌즈를 조절하여 샘플에 초점을 맞추십시오.

전체 빔 프로파일을 촬영할 수 있을 만큼 조리개를 충분히 엽니다. 그런 다음 조리개를 측면으로 이동시켜 빔 프로파일의 중심과 조리개가 동심원이 되도록 맞춥니다. 카메라 소프트웨어를 사용하여 두 채널을 모두 포함하는 가장 작은 카메라 판독 영역으로 관심 영역(ROI)을 지정하고 이 좌표를 기록합니다.

이 단계에서 읽기 빔 프로파일(readout beam profile)을 나타내는 스냅샷을 한 번 촬영하십시오. 다음으로 셔터 1을 닫아 읽기 레이저를 차단하고 셔터 2를 여십시오. 활성화 빔 프로파일 측정을 시작하기 위해 활성화 레이저를 샘플에 조사하고, 필요한 경우 전자 증배 이득(electron multiplying gain)을 100 미만으로 설정한 후 빔이 각 시야의 중심에 오도록 첫 번째 다이크로익 미러를 조정하십시오.

그런 다음 다색 F palm 이미지를 획득하기 시작하기 위해 활성 빔 프로파일의 스냅샷을 기록하십시오. 실내 조명을 모두 끄십시오. 그런 다음 플립 마운트를 통해 수은 램프 빛을 형질전환된 세포에 조사하고, 필터 큐브를 pre photo switch 상태의 적절한 여기 파장이 포함된 것으로 교체하십시오.

세포를 선택한 후, 레이저가 현미경 내부로 투사될 수 있도록 플립 마운트(flip mount)를 내리고, 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미징에 적합한 다이크로익 미러(dichroic mirror)가 포함된 필터 터렛으로 변경합니다. 그다음 이 이미지를 카메라로 투사하여 배경 형광과 형질전환된 세포를 구분하고, 분자들이 광활성화 가능한지 확인합니다. 활성화 레이저를 사용하여 10 µW 미만의 낮은 출력으로 시료를 짧게 조사합니다.

다음으로, 전자 증배 이득(electron multiplying gain)을 200으로 설정하고 원하는 프레임 수를 5에서 10,000 사이로 설정하여 키네틱 시리즈 획득을 위한 카메라 소프트웨어를 준비합니다. 또한 노출 시간을 10에서 30 milliseconds 사이로 설정하십시오. 그런 다음 활성화 빔을 차단하고 판독 빔의 차단을 해제하여, 조명된 세포의 이미지를 카메라로 투사합니다.

개별 분자들이 더 이상 보이지 않을 때까지 초점을 아래로 이동시켜 세포막 하단 근처의 초점 평면을 선택하십시오. 그런 다음 분자들이 처음으로 보일 때까지 초점을 점진적으로 위로 이동하십시오. 이제 활성화 빔의 차단을 해제하고 1 W/cm² 미만의 강도로 시료를 조사하십시오.

활성화 레이저 앞의 중성 밀도 필터를 동적으로 조정하여 제곱 마이크론당 0.1에서 1개의 가시 광반응 분자 밀도를 유지하면서 카메라 소프트웨어를 통해 데이터 수집을 시작하십시오. 전반사 형광 이미징을 위해 거울 5와 렌즈 1을 단일 이동 스테이지에 장착하여 현미경 입구 바로 뒤쪽으로 측면 이동시킵니다. 거울 5와 렌즈 1이 이동함에 따라 시료를 통해 대물렌즈 위로 나오는 레이저가 점차 한쪽으로 기울어지며, 레이저의 각도가 수직에서 90도가 될 때까지 스테이지를 계속 이동시키십시오.

이 시점에서 출력 레이저는 사라지고, 입사 레이저는 입사 빔과 평행하지만 반대 방향으로 진행하며 측면으로 치우친 채 개구부를 통해 다시 반사됩니다. 이미지 획득이 완료되어 시료가 전반사 형광 상태에 진입하면 배경 신호가 감소하는 것을 확인할 수 있어야 합니다. 즉시 현미경 셔터를 닫고 두 빔을 모두 차단하십시오. 전자 증배 이득(electron multiplying gain)을 비활성화하십시오.

카메라를 한 프레임만 기록하도록 설정하고, 카메라 판독 영역을 최대 크기로 설정하십시오. 마지막으로, 현미경 램프에 장착된 롱패스 필터를 이용해 F3 또는 F4 위에 카드를 놓아 한 채널을 차단하십시오. 샘플을 조명하고 이 이미지를 카메라로 투영하십시오.

투과광 상태의 전체 세포를 나타내는 세포 스냅샷을 기록하십시오. 여기에는 DENDRA 2 Hemagglutinin과 PAM Cherry actin을 모두 발현하는 NIH 3T3 세포의 2색 F palm 획득 예시가 표시되어 있습니다. 왼쪽의 투과 채널은 오른쪽의 반사 채널보다 더 긴 파장을 포함합니다.

여기에 표시된 것은 배경 제거 및 좌우 채널 오버레이 변환 후, 동일한 2색 F OM 획득 과정에서 얻은 스냅샷입니다. 개별 분자들을 식별하고 위치를 특정할 수 있습니다. 일부 분자들은 투과 채널에서 더 밝게 나타나며, 일부는 두 채널 간에 방출 분포가 더 균일하게 나타납니다.

이는 PAM cherry와 DENDRA two의 방출 스펙트럼 차이를 나타내며, 분석 시 이 두 종을 식별하는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 히스토그램은 허용 오차를 적용한 후 모든 국소화된 분자에 대해 전체 강도 대비 적색 투과 채널 강도의 비율을 나타냅니다. 픽셀은 왼쪽 하단 이미지에서 흰색으로 나타나며 오른쪽 하단에 표시된 최종 병합 이미지에서는 적색으로 나타나는 반면, 녹색 영역의 픽셀은 오른쪽 상단 이미지에서 흰색으로 나타나며 오른쪽 하단에 표시된 최종 병합 이미지에서는 녹색으로 나타납니다.

렌더링 시 선택하는 임계값 수준은 노이즈의 정도와 공국소화(colocalization)의 외관에 큰 영향을 미칩니다. 여기서는 서로 다른 세 가지 렌더링 옵션을 보여주며, 이는 다양한 정도의 블리드스루(bleed through) 결과를 나타냅니다. 가장 보수적인 임계값 수준은 하단 두 개의 이미지에 표시되어 있습니다. Color F palm alpha 히스토그램은 이미지 내에 두 개의 뚜렷한 피크가 있을 때 해석하기 가장 좋습니다.

왼쪽의 히스토그램은 추가 분석을 위한 좋은 후보가 되지만, 나머지 두 히스토그램으로 생성된 이미지는 이 절차를 따랐을 때 해석하기 훨씬 더 어려울 것입니다. 살아있는 세포막의 나노스케일에서 단백질이 어떻게 조직되어 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전반사 현미경 및 살아있는 세포 이미징과 같은 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 FAR 현미경을 직접 설정하고 이를 사용하여 데이터를 획득하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

레이저 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 시도하기 전에 반드시 안전 교육을 이수해야 함을 잊지 마십시오.