림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.

이 방법은 림프내막 세포 또는 LEC가 특정 자극에 어떻게 반응하는지, 그리고 질병 병인에 기여하는 방법과 같은 림프및 간 장에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간 림프내막 세포 표현형및 기능을 세포 별로 평가할 수 있으며 세포 분류 후 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 간 림프 생물학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 피부와 유방 선과 같은 다른 조직에서 림프 내피 세포를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 전문 연구 조수 인 제프리 핀론 (Jeffrey Finlon)이 될 것입니다. 고립 된 간 세포에서 단일 세포 현탁액을 준비하려면 70 %의 에탄올로 마우스를 살포하고 발을 해부 보드에 고정하는 것으로 시작합니다. 해부 가위를 사용하여 항문 위의 약 1센티미터 높이의 피부를 자르고 이빨이 있는 집게를 사용하여 피부가 몸에서 멀어지게 합니다.

피부와 복막 사이에 가위 팁을 삽입하고 가위를 열어 조직을 분리한 후 피부 절개를 목까지 계속합니다. 각 앞다리 아래와 각 뒷다리 위에 해부 보드에 피부를 고정하고, 목으로 절개를 확장하기 위해 위쪽으로 회귀 자루를 당깁니다. 간의 엽을 잡고 흉골 바로 아래잘라 간 주위해부를 허용합니다.

그런 다음 장기를 Click's EHAA 배지의 4밀리리터로 옮기습니다. 메스를 사용하여 간을 직경약 1mm조각으로 자르고 갓 준비된 소화용액 500마이크로리터와 DNase 1의 500마이크로리터로 조각을 소화합니다. 섭씨 37도에서 15분 후, 500밀리리터 파이펫을 사용하여 조직을 철저히 혼합하고 컨테이너를 인큐베이터로 15분 더 돌려보냅니다.

인큐베이션의 끝에서, 100 미콘 여과기를 통해 50 밀리리터 원뿔 튜브로 소화된 샘플을 옮기고 1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 메쉬를 통해 나머지 조직 조각을 부드럽게 누릅니다. 5밀리리터의 격리 버퍼로 필터를 씻고 여과기를 통해 남은 조직을 부드럽게 누릅니다. 원심분리에 의해 고립된 간 세포를 수집하고 적혈구 용해 완충제의 4밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.

실온에서 5 분 후, 격리 버퍼의 10 밀리리터에서 세포를 세척하고 전체 간 수를 결정하기 위해 혈류계에 세포를 계산합니다. 20%의 iodixanol의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 PBS의 1밀리리터로 세포 현탁액을 오버레이합니다. 밀도 그라데이션 분리에 의해 세포를 분리하고 PBS와 iodixanol 사이의 층을 수확한다.

그런 다음 100 마이크로미터 여과기를 통해 세포를 새로운 50 밀리리터 원뿔 튜브로 필터링합니다. 신선한 절연 버퍼의 10 밀리리터에서 세포를 세척하고 PBS의 500 마이크로 리터에 생성 펠릿을 다시 중단, 2 %의 태아 소 혈청, 또는 FBS로 보충. 계산 후, 알리쿼트 6-비-parenchymal 세포각 제어 및 원심분리를 위한 96개의 웰 플레이트의 실험우물에 약 5회 반을 하고 PBS 플러스 FBS의 90마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다.

각 웰에 적절한 실험 및 제어 기본 항체 칵테일을 추가하고 적절한 생존 성 마커로 모든 우물을 얼룩지게합니다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 항체의 적절한 적정과 염색을 확인하기 위해 얼음 유형 제어 및 형광-1 컨트롤의 사용입니다. 섭씨 4도에서 30분 후, 원심분리기는 PBS+ FBS 100마이크로리터로 세포를 씻어내고 각 웰의 세포를 개별 5밀리리터 라운드-하부 유동 세포측정튜브로 전송하여 400마이크로리터의 PBS+ FBS의 최종 부피로 옮겨집니다.

그런 다음 소량의 세포를 사용하여 유동 사이토미터의 레이저 및 보상 설정을 조정하고 각 튜브에 대한 모든 이벤트를 읽습니다. 모든 튜브를 읽은 경우 데이터를 적절한 흐름 세포 분석 프로그램으로 가져옵니다. 부정적인 발현이 살아있는 것으로 간주되는 생존 성 마커 염료를 기반으로 라이브 셀에 게이트.

세포의 크기 및 세분성뿐만 아니라 생존성 마커 염료 발현에 기초하여 살아있는 세포에 게이트는 적절한 등류형 제어 및 형광-1 데이터를 사용하여 CD45 음성 CD31 양성 세포 집단에 게이팅하여 양성 및 음수 집단을 결정한다. 그런 다음 CD45 음의 CD31 양성 세포를 CD16/32 및 podoplanin 발현에 따라 게이트하여 CD45 음수 CD31 양성, CD16/32 음수 포도플라닌 양성 내피, CD45 음성 CD31 양성, CD16/32 양성 포도플라닌 네거티브 간 세포세포 세포의 식별을 가능하게 한다. 내피 세포는 림프용기와 내피 히알루로난을 표현하지만 CD146은 표현하지 않는다.

간 분리 CD31 양성 CD16/32 양성 세포는 또한 CD146 양성 및 podoplanin 양성, CD31 양성 CD16/32 부정적인 세포는 주로 CD146 음성 및 podoplanin 양성 또는 음수. 양성은 형광-1 염색에 기초하여 결정되었다. 간 림프내막 세포는 CD146 음성 및 PDPN 양성이다.

혈관 내피또는 뮤린 간 대식세포는 podoplanin을 표현하지 않습니다. 포도플라닌 염색은 담관의 뚜렷한 핵 구조뿐만 아니라 시토케라틴 7 염색에 의해 림프관과 담관의 분뇨를 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 림프내막 세포만이 혈관 내피 성장 인자 수용체 3 및 프로스페로 홈로박스 단백질 1을 원간에서 공동 발현하기 때문에, 이들 마커는 선별된 간 림프내막 세포 집단의 순도를 확인하기 위해 더 사용될 수 있다.

이 절차를 시도하는 동안, 신속하게 작동하고 얼음에 세포를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 LEC 모집단의 흐름 정렬과 같은 다른 방법을 수행하여 LEC의 전사 프로파일링과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 림프가 마우스와 인간에 있는 간 질병에 어떻게 영향을 미치는지 탐구하기 위하여 간 특정 림프생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

일반적으로, 림프 내막 세포는 간에서 드문 점진적 인구이며 방법은 신속하게 수행 될 필요가 있기 때문에이 방법에 새로운 개인투쟁할 것이다.