Name: 림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 학습하세요 콜라게나제 IV와 DNase 처리를 활용한 유동 세포측정법으로 생쥐 간에서 림프 내피 세포를 분리하고 표현형을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 수준에서 질병 기전 연구에 활용됩니다.

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저자 기 및 간 타고 난 면역 프로그램이이 프로젝트의 통화 지원에 감사 하 고 싶습니다. B.A.J.T.는 또한 R01 AI121209에 의해 자금을.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 콜로라도 대학 Anschutz 의료 캠퍼스의 승인 되었습니다.
1입니다. 자료의 준비
<ol><li>5 mg/mL 솔루션 DNase의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 내가.</li>
	<li>클릭의 EHAA 미디어 콜라 IV의 5000 U/mL을 추가 하 여 소화 혼합물 을 확인 합니다.</li>
	<li>사용 하기 30 분 전에 37 ° C에서 소화 혼합 따뜻한.</li>
	<li>4.8% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 행 크 스를 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 균형 소금물 (HBSS) 추가 하 여 절연 버퍼 를 확인 합니다.</li>
	<li>염화 암모늄 100 mM, 10 mM KHCO3및 0.1 m m EDTA를 H2o. 소 주를 추가 하 여 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼를 확인</li>
</ol>2. 마우스 간에서 단일 세포 현 탁 액의 준비
<ol><li>CO2 와 자 궁 경부 전위 마우스 안락사</li>
	<li>그것의 모피를 젖은 70% 에탄올과 마우스 아래로 스프레이. 마우스의 고정 해 부 보드 발.</li>
	<li>해 부가 위를 사용 하 여 피부 피부 (약 1 m m)만 극복 하 게 주의 되 고 항문 위에 약 1cm를 잘라. 이빨된 집게와 몸 떨어져 피부를 당겨 하 고 피부와 복 막 사이 위를 삽입 합니다. 복에서 피부를 분리 하 고, 다음, 목에 절 개에서 피부를 잘라가 위를 엽니다.</li>
	<li>각각의 팔 아래 및 각 다리 위에서 하나의 핀을 사용 하 여 해 부 보드에 피부를 고정 합니다. 복 주머니를 올려 고 목으로 위쪽으로 잘라. 간 엽을 흉 골 바로 아래를 잘라. 참고: 한다 주의 간의 immunohistochemistry (IHC) 사용 될 것입니다.</li>
	<li>간 주위와 마우스에서 간 제거 잘라내어 클릭의 EHAA 미디어의 4 mL에 배치.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 간 ~ 1 m m에서 직경 조각 잘라.</li>
	<li>추가 소화 혼합물의 500 µ L 500 µ L는 DNase의 간 난 (2 mg/mL).</li>
	<li>37 ° c.에 30 분 간 품 어 15 분 후 5 mL 피 펫을 사용 하 여 액체 믹스.</li>
	<li>외피의 30 분 후 50 mL 원뿔 튜브를 100 µ m 스 트레이너를 통해 소화 샘플을 전송.</li>
	<li>부드럽게 필터 1 mL 주사기의 플런저를 통해 남은 조각을 밀어.</li>
	<li>절연 버퍼의 5 mL로 필터를 세척 하 고 1 mL 주사기에서 조직 플런저의 뒷면으로 스 트레이너를 통해 가볍게 눌러. 이 필터는 절연 버퍼의 25 mL로 씻어 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>5 분은 신중 하 게는 상쾌한에서 발음에 대 한 400 x g 에서 세포를 원심.</li>
	<li>RBC 세포의 용 해 버퍼의 4 mL와 펠 릿 resuspend 5 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.</li>
	<li>절연 버퍼 및 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기의 10 mL로 세포 세척.</li>
	<li>전체 간 수를 확인 하려면 hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>Resuspend 20 %iodixanol 5 ml에서는 세포 고 1 mL의 PBS로 레이어.</li>
	<li>세포는 브레이크 없이 15 분 300 x g 에서 원심</li>
	<li>PBS는 iodixanol 사이 레이어를 제거 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 100 µ m 필터를 통해 그들을 배치.</li>
	<li>절연 버퍼 및 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기의 10 mL로 세포 세척.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 PBS의 500 µ L에 셀 resuspend.</li>
</ol>3. 간에서 단일 세포의 Cytometric 분석 흐름
<ol><li>Hemocytometer 고 trypan 블루 제외를 사용 하 여 측정 가능한 세포를 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. Trypan 블루의 10 µ L를 셀의 10 µ L을 추가 하 고 즉시는 hemocytometer에 넣어 현미경 (하지 블루) 라이브 셀. 그런 다음, microliter 당 셀의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>약 수 약 5 백만 96 잘 접시의 단일 우물으로 남아 있는 nonparenchymal 세포의.</li>
	<li>5 분에 대 한 400 x g 에서 셀 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 2%와 PBS의 90 µ L 셀 resuspend FBS.</li>
	<li>안티-CD45 (1: 200), 안티-CD146 (1: 200), 안티-CD31 (1: 200)을 추가 하 고 PDPN (1: 200) 2.4G2 또는 안티-CD16/32 (1: 200) x 10의 10 µ L에 희석. 참고: 안티 CD16/32-표시 된 항 체 사용 되었다 때 아니 Fc 블록 (2.4G2) 사용 되었다.</li>
	<li>긍정적이 고 부정적인 게이츠 설정할 위치를 확인 하려면 각 색상 및 항 체 isotype 컨트롤 1 (FMO) 얼룩 빼기 형광을 포함 합니다.</li>
	<li>라이브 대 죽은 세포를 확인 하려면 생존 표시 (예, 귀신 빨간 780)와 함께 얼룩. 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>2%와 PBS의 100 µ L로 세포 세척 FBS.</li>
	<li>셀의 작은 약 수를 사용 하 여 교류 cytometer에서 레이저와 보상 설정을 조정할. 각 개별 fluorophore와 어떤 항 체 없이 하나의 항 체와 세포 얼룩. 참고: 사용 되 고 교류 cytometer 따라 보상 매트릭스 스펙트럼 중복 제거를 설립 되어야 합니다.</li>
	<li>Cytometer 프로브에 샘플 튜브를 배치 하 고 수집 하 고 모든 이벤트를 기록.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>측면-분산형 지역 대 앞으로 피해 지역에서 찾고, 크기와 단위 생존 마커 염료에 따라 "라이브" 셀 게이트.</li>
	<li>다음, CD45 화려한 바이올렛 510과 CD31 PerCp Cy5.5, CD45-CD31 + 셀을 긍정적이 고 부정적인 인구 isotype 컨트롤 및 FMO를 사용 하 여 게이트를 사용 합니다.</li>
	<li>마지막으로, CD146-PDPN + 또는 CD16/32를 걸릴 CD146 v450 또는 CD16/32 FITC와 PDPN APC를 사용 하 여-PDPN + 셀, 사용 하 여 다시 isotype 컨트롤 및 FMO, 긍정적이 고 부정적인 인구 확인 하. 이 세포는 LECs는.</li>
</ol>

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<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
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<li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989(2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

빛25LECs의 전반적인 중요성 면역 항상성 그리고 규칙에 최근에 왔다. 게시 된 림프 문학의 많은 피부와 림프절;에 초점을 맞추고합니다 그러나, lymphatics26 신체 걸쳐 발견 되 고, 따라서, 다른 기관에 그들의 중요성의 우리의 이해는 필요 하다. 여기 우리가 다른 표면 마커, cytokines, 발산, 및 녹음 방송 요인 등 세포내 단백질의 그들의 동시 표현 이해 하기 셀에 의해 셀 기준 LECs에에서 공부 될 수 있다 메서드를 보여줍니다. 이 메서드는 미래 연구 건강 및 질병 표현 형 및 간에서 LECs의 기능 평가를 위해 유용할 것 이다.
간에서 LECs의 식별에 대 한 장애물 중 하나는 다른 세포 유형에 비해 상대적으로 낮은 주파수 이다. Hepatocytes 간, 그리고 제거 전에 실행 간 교류 cytometer에 적은 시간을 요구 하 고, 따라서, 더 나은 생존 능력을 제공...

간에서 림프 혈관 및 LECs의 역할은 잘 이해 되지. 림프 혈관 간1 의 포털 3 인조 내의 질병2중 확장 하는 동안 아주 작은 기능 및 간 내 LECs의 표현 형에 관한 이해 된다. LECs3에 주로 발견 되는 마커의 발견과 항상성 및 질병에 다른 조직 틈새 내의 이러한 셀의 중요성 우리의 이해에 중요 한 격차를 채울 것입니다. LECs는 T 세포4,,56,7,8, 와 직접 상호 작용 하 여 림프 노드 및 전이성 종양 주변 공차를 유지 하는 주요 역할 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 림프 노드에서 LECs 철새 수지상 세포14,,1516와 그들의 상호 작용을 통해 보호 면역을 홍보할 수 있습니다. 따라서, 특정 조직에 있는 그들은 존재 하는 상호 작용 수 있는 LECs에 대 한 여러 역할이 있습니다. 그러나, 아주 작은 LECs 조직에서 면역 세포 상호 작용 하는 방법 또는 다른 기관 체계; LECs 작동 하는 방법에 대 한 이해는 따라서, 간 또는 다른 장기에서 세포 당 기준 LECs 평가 어떻게 LECs 조직 특정 면역 프로그램에서 발생할 수 있습니다. 문학에 초점을 맞춘 LECs 간에서 많이 LECs 하나 또는 두 개의 마커 및 형태학17를 사용 하 여 시각화를 현미경을 사용 하 여, 하는 동안 아주 작은 일 하고있다 특히 cytometry, 비록 한 연구를 사용 하 여 셀에 의해 셀 별로 LECs를 평가 하 한 간 사인 내 피 세포 (LSECs), LECs18간의 차이 평가. Cytometry 여 간에서 LEC 인구를 분석할 수 있는 정상적인 항상성 또는 질병 동안 LEC 표현 형의 심도 있는 연구에 대 한 수 있습니다.
LECs cytometry로를 평가 하려면 여러 표면 마커 필요 합니다. 일반적으로, LECs 지주 님 관련 homeobox 1의 표현 (Prox-1), 림프 혈관 내 피 hyaluronan 수용 체 1 (LYVE1) 또는 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 3 (VEGFR3) 현미경을 사용 하 여 시각화 됩니다. 그러나,이 간,이 마커의 식 LECs 제한 되지 않습니다. Prox 1 널리 간 개발, 재생, 및 부상19, hepatocytes에 의해 표현 하 고 LYVE1 및 VEGFR318간 사인 내 피 세포 의해 표현 됩니다. 림프절, LECs cytometry 차별화 (CD)의 클러스터로 사용 하 여 식별 됩니다 CD45-CD31 +, podoplanin + (PDPN)16. 그러나,이 방법은 너무 CD45-CD31 + 세포는 내 피 세포와 간에서 혈관 내 피 세포의 주된 인구는 LSECs 이후 간에서 LECs을 최소 이다. 따라서, 다른 마커는 풍부한 LSEC 인구에서 드문 LEC 인구 구분 필요 합니다. CD16/32 (성숙 LSECs18에 의해 표현)와 CD146 (일반적인 혈관 내 피 세포 마커를 주로 림프 여 식이 없는 거의 간 사인 내 피 세포20 여 간 사인 내 표현 내 피 세포21) 후보 마커를 했다.
따라서, 우리는 분리 하 고 간 cytometry에 대 한 위의 마커, CD45, CD31, CD146, CD16/32, 및 PDPN를 사용 하 여에서 LECs을 시각화 하는 방법을 최적화 합니다. 우리는 콜라 4의 사용, DNase 1, 및 단일 셀 서 스 펜 션에 간 조직 소화에 대 한 기계적 분리 설명합니다. 우리는 또한 세포질 파편을 제거 하 고 비 parenchymal 세포 (NPC)의 분리에 대 한 iodixanol 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 설명 합니다. 주된 마커로 PDPN 간에서 LECs을 식별 하는 최적의 흐름 cytometry 제어 전략을 결정 마지막으로, 여러 개의 마커를 사용 하 여, 우리.

<table><tbody><tr><td>클릭 / EHAA 미디어</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical corporation</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical corporation</td><td>LS002145</td><td>Deoxyribonuclease 1</td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>V450 anti mouse CD146 (clone ME-9F1)</td><td>BD biosciences</td><td>562232</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD146 (클론 ME-9F1)</td><td>Biolegend</td><td>134706</td><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td></tr><tr><td>퍼시픽 블루 안티 마우스 CD31 (클론 390)</td><td>Biolegend</td><td>102422</td><td></td></tr><tr><td>PerCp / Cy5.5 안티 마우스 CD31 (클론 390)</td><td>Biolegend</td><td>102420</td><td>페리디닌 - 엽록소 단백질 - 시아닌 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr> <tr><td>APC 안티 마우스 PDPN (클론 8.1.1)</td><td>Biolegend</td><td>127410</td><td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td></tr><tr><td>APC / Cy7 안티 마우스 CD45 (클론 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 안티 마우스 CD45 (클론 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD16 / 32 (클론 93)</td><td>Biolegend</td><td>101306</td><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td></tr> <tr><td>PerCp / Cy5.5 안티 마우스 CD16 / 32 (클론 93)</td><td>Biolegend</td><td>101324</td><td>페리디닌 - 엽록소 단백질 - 시아닌 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr> <tr><td>고스트 레드 780 생존 염료</td><td>TONBO biosceinces</td><td>3-0865-T100</td><td></td></tr><tr><td>APC 시리아 햄스터 IgG (클론 SHG-1)</td><td>Biolegened</td><td>402102</td><td></td></tr><tr><td>PerCp / Cy5.5 쥐 IgG2a (클론 RTK2758)</td><td>Biolegend</td><td>400531</td><td></td></tr><tr><td>FITC 쥐 IgG2 (클론 eBR2a)</td> <td>ebioscience</td><td>1-4321-80</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 LYVE1 (클론 223322)</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB2125A</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 사이토 케라틴 (클론 EPR17078)</td> <td>abcam</td><td>ab181598</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 F4 / 80 (클론 Cl : A3-1)</td> <td>Bio-rad</td><td>MCA497</td><td></td></tr><tr><td>BSA (fraction V)</td> <td>Fischer</td><td>BP1600-100</td><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>잭슨 Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>잭슨 Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>E177</td><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) -RBC 용해 완충액용</td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>피셔</td><td>A687-500</td><td>RBC 용해 완충액</td></tr><tr><td>중탄산칼</td>륨 <td>피셔</td><td>P184-500</td><td>적혈구 용해 완충액</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m 세포 스트레이너</td><td>Fischer</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2</td><td>in house/ATCC</td><td>ATCC HB-197</td><td>FC 블록으로 Fc 감마 + 세포에 대한 비특이적 결합을 억제 - 하이브리도마로 만든</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>코닝</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>행크스 평형 염 용액(HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>애틀랜타 생물학 제제</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형</td><td>Truline</td><td>TR2004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔</td>형 <td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 피펫 팁</td><td>USA scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 피펫 팁</td><td>미국 과학</td><td>1110-1700</td><td></td></tr><tr><td>10 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>USA scientific</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 10 mL 피펫</td><td>그라이너 바이오 원</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>혈청 5 mL 피펫</td><td>그라이너 바이오 원</td><td>606107</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양기</td><td>Fischer</td><td></td><td>Heracell 160i</td></tr><tr><td>BD FacsCanto II 유세포 분석기</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>임상 원심 분리기</td><td>Beckman 쿨터</td><td></td><td>모델 X-14R</td></tr></tbody></table>

림프 내 피 세포의 흐름 cytometric 분석 murine 간 소화

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

간, 내 림프 혈관 포털 깡패 내에서 발견 되 고 그들의 설명한 기능 세포 파편과 항을 조사 수 있는 림프절을 간에서 틈새 액체를 제거 하는. 우리는 림프 맥 관 구조 염증 및 간 내에서 면역 세포 기능에 관여 하는 수도 있습니다 어떻게 이해에 매우 관심이 다입니다. 그러나, 아주 작은 게시 된 간 또는 간 평가 하는 데 사용할 수 있는 특정 마커 (LECs)의 림프 내 피 세포의 고립에 대 한 소화 프로토콜 설정 LECs 당 셀 기준. 따라서, 우리는 소화와 간에서 LEC 인구를 평가 하기 위해 간 얼룩에 대 한 방법을 최적화 합니다. 우리는 여기에 설명 된 방법을 식별 및 간에서 LECs의 격리에 대 한 도움이 될 것입니다 LECs 간 microenvironment에 대응 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 강화할 것 이다 확신.

간 lymphatics를 분석 하는 연구는 주로 주파수와 간에서 림프 혈관의 직경을 quantitate 하 immunohistochemistry를 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 셀에 의해 셀 기준 LECs의 평가 대 한 또는 여러 마커, cytokines, 발산, 또는 녹음 방송 요인의 표현에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 우리는 물었다 간 여부 LECs 간 으로부터 격리 될 수 있고 cytometry 사용 하 여 평가. 림프절 LECs 분리 이전 작업 Liberase DL (콜라 나-II-및-dispase)와 DNase 1 바늘14,16림프절 조직의 기계적 분리와 결합을 사용 하 여 수행 되었다. 따라서, 간 조직에 동일한 소화 프로토콜 사용 되었다 또는 콜라 IV 및 DNase 1 간22 에서 면역 세포 격리에...

이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

이 방법은 림프내막 세포 또는 LEC가 특정 자극에 어떻게 반응하는지, 그리고 질병 병인에 기여하는 방법과 같은 림프및 간 장에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간 림프내막 세포 표현형및 기능을 세포 별로 평가할 수 있으며 세포 분류 후 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 간 림프 생물학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 피부와 유방 선과 같은 다른 조직에서 림프 내피 세포를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 전문 연구 조수 인 제프리 핀론 (Jeffrey Finlon)이 될 것입니다. 고립 된 간 세포에서 단일 세포 현탁액을 준비하려면 70 %의 에탄올로 마우스를 살포하고 발을 해부 보드에 고정하는 것으로 시작합니다. 해부 가위를 사용하여 항문 위의 약 1센티미터 높이의 피부를 자르고 이빨이 있는 집게를 사용하여 피부가 몸에서 멀어지게 합니다.피부와 복막 사이에 가위 팁을 삽입하고 가위를 열어 조직을 분리한 후 피부 절개를 목까지 계속합니다. 각 앞다리 아래와 각 뒷다리 위에 해부 보드에 피부를 고정하고, 목으로 절개를 확장하기 위해 위쪽으로 회귀 자루를 당깁니다. 간의 엽을 잡고 흉골 바로 아래잘라 간 주위해부를 허용합니다.그런 다음 장기를 Click's EHAA 배지의 4밀리리터로 옮기습니다. 메스를 사용하여 간을 직경약 1mm조각으로 자르고 갓 준비된 소화용액 500마이크로리터와 DNase 1의 500마이크로리터로 조각을 소화합니다. 섭씨 37도에서 15분 후, 500밀리리터 파이펫을 사용하여 조직을 철저히 혼합하고 컨테이너를 인큐베이터로 15분 더 돌려보냅니다.인큐베이션의 끝에서, 100 미콘 여과기를 통해 50 밀리리터 원뿔 튜브로 소화된 샘플을 옮기고 1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 메쉬를 통해 나머지 조직 조각을 부드럽게 누릅니다. 5밀리리터의 격리 버퍼로 필터를 씻고 여과기를 통해 남은 조직을 부드럽게 누릅니다. 원심분리에 의해 고립된 간 세포를 수집하고 적혈구 용해 완충제의 4밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.실온에서 5 분 후, 격리 버퍼의 10 밀리리터에서 세포를 세척하고 전체 간 수를 결정하기 위해 혈류계에 세포를 계산합니다. 20%의 iodixanol의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 PBS의 1밀리리터로 세포 현탁액을 오버레이합니다. 밀도 그라데이션 분리에 의해 세포를 분리하고 PBS와 iodixanol 사이의 층을 수확한다.그런 다음 100 마이크로미터 여과기를 통해 세포를 새로운 50 밀리리터 원뿔 튜브로 필터링합니다. 신선한 절연 버퍼의 10 밀리리터에서 세포를 세척하고 PBS의 500 마이크로 리터에 생성 펠릿을 다시 중단, 2 %의 태아 소 혈청, 또는 FBS로 보충. 계산 후, 알리쿼트 6-비-parenchymal 세포각 제어 및 원심분리를 위한 96개의 웰 플레이트의 실험우물에 약 5회 반을 하고 PBS 플러스 FBS의 90마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다.각 웰에 적절한 실험 및 제어 기본 항체 칵테일을 추가하고 적절한 생존 성 마커로 모든 우물을 얼룩지게합니다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 항체의 적절한 적정과 염색을 확인하기 위해 얼음 유형 제어 및 형광-1 컨트롤의 사용입니다. 섭씨 4도에서 30분 후, 원심분리기는 PBS+ FBS 100마이크로리터로 세포를 씻어내고 각 웰의 세포를 개별 5밀리리터 라운드-하부 유동 세포측정튜브로 전송하여 400마이크로리터의 PBS+ FBS의 최종 부피로 옮겨집니다.그런 다음 소량의 세포를 사용하여 유동 사이토미터의 레이저 및 보상 설정을 조정하고 각 튜브에 대한 모든 이벤트를 읽습니다. 모든 튜브를 읽은 경우 데이터를 적절한 흐름 세포 분석 프로그램으로 가져옵니다. 부정적인 발현이 살아있는 것으로 간주되는 생존 성 마커 염료를 기반으로 라이브 셀에 게이트.세포의 크기 및 세분성뿐만 아니라 생존성 마커 염료 발현에 기초하여 살아있는 세포에 게이트는 적절한 등류형 제어 및 형광-1 데이터를 사용하여 CD45 음성 CD31 양성 세포 집단에 게이팅하여 양성 및 음수 집단을 결정한다. 그런 다음 CD45 음의 CD31 양성 세포를 CD16/32 및 podoplanin 발현에 따라 게이트하여 CD45 음수 CD31 양성, CD16/32 음수 포도플라닌 양성 내피, CD45 음성 CD31 양성, CD16/32 양성 포도플라닌 네거티브 간 세포세포 세포의 식별을 가능하게 한다. 내피 세포는 림프용기와 내피 히알루로난을 표현하지만 CD146은 표현하지 않는다.간 분리 CD31 양성 CD16/32 양성 세포는 또한 CD146 양성 및 podoplanin 양성, CD31 양성 CD16/32 부정적인 세포는 주로 CD146 음성 및 podoplanin 양성 또는 음수. 양성은 형광-1 염색에 기초하여 결정되었다. 간 림프내막 세포는 CD146 음성 및 PDPN 양성이다.혈관 내피또는 뮤린 간 대식세포는 podoplanin을 표현하지 않습니다. 포도플라닌 염색은 담관의 뚜렷한 핵 구조뿐만 아니라 시토케라틴 7 염색에 의해 림프관과 담관의 분뇨를 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 림프내막 세포만이 혈관 내피 성장 인자 수용체 3 및 프로스페로 홈로박스 단백질 1을 원간에서 공동 발현하기 때문에, 이들 마커는 선별된 간 림프내막 세포 집단의 순도를 확인하기 위해 더 사용될 수 있다.이 절차를 시도하는 동안, 신속하게 작동하고 얼음에 세포를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 LEC 모집단의 흐름 정렬과 같은 다른 방법을 수행하여 LEC의 전사 프로파일링과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 림프가 마우스와 인간에 있는 간 질병에 어떻게 영향을 미치는지 탐구하기 위하여 간 특정 림프생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.일반적으로, 림프 내막 세포는 간에서 드문 점진적 인구이며 방법은 신속하게 수행 될 필요가 있기 때문에이 방법에 새로운 개인투쟁할 것이다.

digestion-murine-liver-for-flow-cytometric-analysis-lymphatic

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추​​가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

간단 하 고 신뢰할 수 있는 식이 유발 설치류 동물 모델에 대 한 무 알콜 지방 각 막 염 (내 쉬)에 대 한 설명, 동물의 비 SPF 주택을 통해 달성 하 고 특정 높은 뚱뚱한 다이어트의 관리. 우리는 마우스를 환경 세균에 노출 시 킴으로써 인간 면 역학적 조건을 다시 캡처하는 간 및 지방 면역 세포 하위 세트의 식별을 설명 합니다.

타입-2 당뇨병과 관련 하 여 무 알콜 수 막 염을 위한 진보 된 뮤 린 모형

본 프로토콜은 단핵세포, 마이크로글리아, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 특정 안구 단핵 교핵 세포집단을 식별하기 위해 다중 파라미터 유동 세포측정 분석을 목적으로 전체 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하는 방법을 제공한다.

단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

본 프로토콜은 마우스에서 십이지장내 영양소 주입에 반응하여 흐르는 장 림프를 분리하기 위한 상세한 수술 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 다양한 실험 영양소에 대한 반응으로 총 장내 지질 흡수 및 유미미크론 합성 및 분비를 생리학적으로 측정할 수 있습니다.

식이 지질 흡수 및 유미미크론 분비의 생체 내 동역학을 정량화하기 위한 마우스의 흐르는 장간막 림프의 분리

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

학습하세요 콜라게나제 IV와 DNase 처리를 활용한 유동 세포측정법으로 생쥐 간에서 림프 내피 세포를 분리하고 표현형을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 수준에서 질병 기전 연구에 활용됩니다.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

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